Summary
Ett detaljerat protokoll för samtidiga driften av 48 parallella cellodlingar under varierande förhållanden i ett microbioreactor system presenteras. Cellodlingsprocessen, skörd och efterföljande antikropp titer analys beskrivs.
Abstract
Automatiserad hur provtagningsutrustningen skall bioreaktorer (15 mL) kan vara ett användbart verktyg för cell kultur ingenjörer. De underlättar den samtidig körningen av en rad olika experimentella villkor samtidigt minimera potentiella process variabilitet. Tillämpningar av detta synsätt inkluderar: klon screening, temperatur och pH förändringar, tillägg och media optimering. Dessutom bidrar de små reactor volymerna till stora Design av experiment att undersöka en rad villkor. Detta tillåter uppströms processer optimeras betydligt innan skala upp där experimenterande är mer begränsad i omfattning på grund av tid och ekonomiska begränsningar. Automatiserad hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor systems erbjuder olika fördelar jämfört med traditionella småskaliga cell kultur enheter, till exempel shake kolvar eller spinner kolvar. Dock under pilotskala måste process utveckling betydande vara försiktig att säkerställa att dessa fördelar realiseras. När kör med omsorg, systemet kan aktivera hög nivå automation, kan programmeras att köra does med ett högre antal variabler och kan minska provtagningstiden när integrerad med en näringsämnen analyzer eller cell räknare. Integrationen av den expert-derived heuristik presenteras här, med nuvarande automatiserade hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor experiment kan minimera vanliga fallgropar som hindrar meningsfulla resultat. I extrema, kan underlåtelse att följa de principer som anges här leda till skada på utrustningen som kräver dyra reparationer. De microbioreactor system har dessutom små kulturvolymer som försvårar karakterisering av cell odlingsbetingelser. Antal och belopp av prover i processen i batch-läge kultur är begränsat eftersom operativa volymer inte kan understiga 10 mL. Denna metod kommer att diskutera fördelar och nackdelar hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor system.
Introduction
Monoklonala antikroppar (mAbs) tillverkades först i mus Hybridomteknik celler i 19751. Sedan dess skett en ökning i utvecklingen av rekombinant proteinproduktion att humanisera mAbs ökning i vivo säkerhet och effekt2,3,4. De flesta av rekombinant protein produktionsprocesserna anställa från kinesisk Hamster (CHO) celler för den lätthet med vilken de kan anpassas till serum fria medier, sin förmåga att producera proteiner med liknande post-translationella modifieringar som en medfödd mänskliga protein och deras pålitlighet som värd celler5,6.
Efterfrågan växer att leverera produkten snabbare och större patientgrupper med jämn kvalitet. Förutom de ekonomiska fördelarna ökar repertoaren av sjukdomar som behandlas av mAbs, som nu omfattar autoimmuna sjukdomar, efter transplantation komplikationer, artrit och cancer7. Genomsnittsavkastningen för moderna kommersiella mAb produktionslinjer är normalt i intervallet 5-6 g/l och fortsätter att stiga5. Detta har delvis åstadkommits genom CHO cell teknik och förbättrad produktionslinje screening med hög genomströmning bioreaktorer8. Dock har de flesta ökningar proteinproduktion tillskrivits för att bearbeta förbättringar, inklusive framsteg i media optimering, cell odlingsbetingelser, och förbättrad utfodring strategier7,9,10. Näringsrikt tillskott är viktigt inte bara för korrekt celltillväxt men också för effektiv produktion av högkvalitativt protein. Dessutom kräver celler stökiometriska tillägg av specifika näringsämnen, som kräver ytterligare förståelse för utfodring strategi optimering6,11. Traditionella optimeringsmetoder omfattar enskilda medier komponent titrering och blandning med blandning mönster. Men metoderna är tidskrävande, labor intensiv och innebära risker associerade med mänskliga fel12,13.
Optimering mediestudier åberopade tidigare skaka kolvarna och 1-2 L bioreaktorer som kan vara oöverkomligt dyrt i form av råvaror och humankapital. Mikroplattor har också använts men dessa metoder ger begränsad utbyggbarhet. Detta kan dessutom fortfarande kräva flera tidskrävande körningar som införa sats till sats variabilitet som skymmer den Kreditvärdighetsbedömning variationen orsakas av media sammansättning och utfodring strategi14,15,16. Därmed, behovet av stora dataflöden och konsekvent parallella bioreaktor system uppstått17,18,19,20.
Med betydande kostnaderna associerade med driften av traditionell bänk skala bioreaktorer (0,5-5 L), microbioreactors erbjuda ett kostnadsbesparande alternativ för att bedöma produktion av biologiskt härrör droger. 21 bänk skala rörs-tank bioreaktorer är pålitlig och ger täta data via sensoriska matriser. Feedback styrsystem möjliggör enkel övervakning av drift. Men gör församlingen, kalibrering, rengöring, arbetskostnader, substrat kostnader, och sterilisering krav bänk skala rörs-tank bioreaktorer dyrt och arbetskrävande att fungera. Skaka kolvarna och mikrotiter plattor bort några av kostnaden och arbete problem i samband med större skala bioreaktorer, men dessa alternativ ger svag kontroll över bearbetningsförhållanden och producera låg densitet data, ofta endast slutpunkten mätningar. 22
Alternativt kan utnyttja microbioreactors en liten arbetande volym för att ge en skala-down-strategi att cellen fodrar och uppströms processutveckling. Omfattningen av microbioreactor experiment kan avsevärt minska driftskostnader genom lägre utnyttjandegrad av makt, substrat, labor, utrymme och verktyg. 23 Microbioreactors är som skaka kolvarna i att de är lätta att hantera på grund av sin storlek, men de behåller fördelarna med traditionell bänk skala bioreaktorer via deras online feedback kontroll av pH, temperatur, upplöst syre, och syra/bas konsumtion samt deras realtidsdata produktion av kvalitetsparametrar inklusive off gassammansättning. Microbioreactor skala möjliggör hög genomströmning screening kapacitet, vilket kan vara användbart för klon urval och process utveckling. 24
Den avancerade hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor har visat sig vara ett effektivt verktyg för CHO cell kultur processen karakterisering och utveckling18. Häri, en automatiserad ambr15 system, bestående av 48 microbioreactors parallellt, som har visat sig vara jämförbar med klassiskt stirred tank reaktorer i skala upp studier,25 användes på ett sätt som är jämförbar med tidigare arbete som optimerade media sammansättning för en CHO-DG44 cellinje producera en modell chimära IgG16. Effekterna av varierande media förhållanden på tillväxt och antikroppnivåns var jämförs och analyseras. En allmän riktlinje att köra microbioreactor system och analys av rå media prover har presenterats i denna uppsats.
Protocol
1. utsäde träna Expansion
Obs: Detta protokoll används 1 mL rekombinant DG44 CHO cell bestånd som har lagrats på en densitet på ~ 3 x 107 celler/mL. Utspädningar och tidslinjer för enskilda CHO cellinjer varierar. Mäta tillväxtkurvor av den cellinje som ska användas i förväg och justera därefter. Cellerna är initialt tinade i skaka kolvarna och senare överfördes till en spinner kolv. Bestämma antalet skaka kolvarna och spinner kolvar behövs för experimentet baserat på antalet microbioreactors som ska köras och målet för sådd densitet.
- Snabbt Tina lager vaccinkoncentratet CHO celler genom nedsänkning i 37 ° C vattenbad tills endast en liten flisa av is återstår. Sanera utsidan av injektionsflaskan med 70% etanol lösning och en luddfri vävnad. Överför till en biosäkerhet skåp.
- Resuspendera cellerna av försiktigt pipettering upp och ner och överför 1 mL till en steril 125 mL ventilerade skaka kolv som innehåller 29 mL före värmde media kompletteras med 8 mM L-glutamin och 1 x Penicillin/Streptomycin.
Obs: Om inte annat anges, kommer termen ”medier” i detta protokoll nedan definieras som OptiCHO media. - Plats skaka flask(s) i en inkubator som hålls vid 37 ° C och 8% CO2. Använd orbitalskak för att agitera celler med en hastighet av 130 rpm.
- Övervaka livskraftig cell densiteten (VCD) varje dag med en automatisk cell räknar enheten eller manuellt med hemocytometer och trypan blå. Subkulturen (utspädd) cellerna 72 timmar efter inympningen i färska media (pre varmt media till 37 ° C varje gång det måste läggas till celler) sådan som den slutliga volymen 100 mL i en 125 mL spinner. Inkubera spinner kulturer på samma villkor som används för skaka kolven kulturer med en hastighet av 70 rpm.
Obs: Efter subkultur bör celler med en täthet på 0,7-1 x 106 celler/mL. Säkerställa att slutliga densitet inte är under 0,5 x 106 celler/mL. Subkultur efter 96 h om målet cell densiteten för inympningen i spinnare inte kan nås. - På dag tre (en dag före inokulum preparat), lägga till färsk, pre värmde medier spinner-flask(s) att upprätthålla ≥ 90% livskraft. Inte överstiger 125 mL totalvolym. 6
2. kör den automatiserade microbioreactor
Förutsättningar: Användaren måste ha fått lämplig utbildning från tillverkaren och måste vara förtrogen med säkerhet och driftsförhållanden för systemet.
- Initiera och ansluta till Cell Counter
- Initialisera systemet operativsystem. Innan du öppnar programvaran, kontrollerar du räknaren cell (se Tabell för material) tillsammans med respektive programvaran. Räknaren cell är integrerad med systemet.
- Anslut till Cell counter anslutning innan du öppnar programvaran. Klicka på ikonen remote desktop och klicka på ”Anslut”. När den avlägsna desktopen är ansluten, öppna cell counter programvara. Installera en ny reagensförpackningen, Tom trypan blå avfall och prime systemet.
- Minimera fjärranslutningen och öppna micro bioreaktor programvaran använder befintliga experiment som en mall för att skapa ett nytt experiment. Namnge och spara experimentet. Kontrollera att automatisk cell räknaren är ansluten under fliken status i programvaran. Status kan kontrolleras på cell counter programvara.
- Definiera plattor och lasta fartyg
Obs: hänvisas till figur 1 att orientera lastning av förbrukningsvaror och reagenser på kultur stationer och däck. Klämman plattorna bör Ånghärdad på en gravitation cykel (används för fasta material) före användning.- Innan du börjar springa, definiera plattorna används under körningen i avsnittet härma i programvaran. Namnge varje platta används och utse varje platta till ett däck på microbioreactor kultur station.
- Använda en 24-well platta för media laddning och placera på kultur stationen utsedda däck. Placera 1 mL och 4 mL Pipettera tip boxar i avsnitt som anges i figur 1.
- Placera en 24-väl inympning platta på respektive däck på kultur stationen. Placera den enda-väl 1 X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) plattan på däck 1. Placera singel-väl 1 M NaOH plattan på däck 2 och 24-väl antiskum plattan på däck 7 (positioner som anges i figur 1). Däck siffrorna visas schematiskt under fliken ”härma” i programvaran.
- Packa upp de odlingskärl (utrustade med sparger) inuti säkerhet skåp huven. Placera tolv sterila odlingskärl per kultur station. Plats Ånghärdad klämma plattor på toppen av fartygen. Se till att hålen i skär föreskrivs omrörare som alla står inför samma riktning för lättare placering.
Obs: Med en permanent markörpenna, kategorisera odlingskärl innan du placerar dem i kultur stationen för att spara tid och undvika förvirring vid tidpunkten för skörd. - Klämman plattan O-ringar är den första delen att bära efter upprepade autoklavering, därför noga kontrollera dem före autoklavering innan varje experiment. Att hålla en steril klämma platta som back-up vid O-ring fel rekommenderas.
- Placera rör plattorna ovanpå klämma plattorna, säkerställa varje pin är ordentligt isatt. Säkra klämma plattorna med skruvar och knoppar som tillhandahålls. Dra åt rattarna tills de är hand tight. Dra åt vänster och höger rattar alternativt för även placering av klämman plattan.
Obs: Om klämman inte är flush mot ytan eller om skruvarna i slutet av klämman plattan är ojämnt åtdragna, kommer fartygen att uppleva upplöst syre (DO) kontrollproblem. Om dessa justeringar inte löser problemet, kontrollera O-ringarna som ofullständig försegling av plattorna kan leda till ineffektiva gasning av kultur.
- Kör den automatisera Micro bioreaktor programvaran
Obs: användning ”processteg” fliken för att redigera eller skapa nya steg. Steg behöver programmeras individuellt att starta och stoppa någon process. Klicka på ”Infoga”-knappens under fliken process steg för att skapa nya steg eller dubbelklicka på ett befintligt steg för att redigera det steget. Programstegen är indelade i tio huvudavsnitt: Start, Media laddning, Antifoam tillägg, / pH kontroll, bakgrunden Base tillägg, pausad pH, Inympning, 5 X celltal, 10 X celltal, näringsämne Analyzer provtagning och kultur Station avstängning. Kör varar oftast mellan 7-9 dagar när körs i batchläge.- Systemet initierar och kontrollerar förekomsten av lämpliga fartyg. Skanna streckkoden medföljer odlingskärl. Samma streckkoden kan tillämpas för kultur stationer med tomma fartyg eller fartyg som inte används.
- Systemet kommer att inledas med designade program efter kontroll göra kontroll, gasning och andra anslutningar.
Obs: Användaren kan fortsätta med programmet även om ett fel uppstår, men gör det på användarens risk och om du fortsätter framåt inte skadar systemet och kommer inte att avbryta experimentet. Till exempel kan gasning vara avstängd för vissa fartyg som inte används i experimentet som visas som ett fel men kan passeras.
- Start och Media laddning
- Den första dagen du konfigurerar systemet eller media laddning dag betecknas som dag 0 kultur tid.
- Under avsnittet Start första belastning Pipettera tips, både 1 mL och 4 mL, som programmeras. Om redan placerat, klicka på Fortsätt. Placera den media, 1 X PBS, 1 M NaOH, antiskum plattan, media laddningsplattan och inympning plåt i de utsedda däck eller, om redan placerat, tryck på Fortsätt att flytta till nästa steg.
- Som en del av protokollet Start, börjar temperaturkontroll och ställa in temperatur till 37 ° C. Slå på omrörningen vid 1000 rpm och DO / pH övervaka.
- Nästa, köra media laddning program. Den flytande hanteraren för automatiserade microbioreactor systemet kommer att avstå media från media plattan till kultur fartyg som mappas i programmet. Media har lagt till det är OptiCHO med varierande processförhållanden.
Obs: Två brunnar från en 24-well platta krävs att fylla ett kultur fartyg till kapacitet (13 mL), som varje brunn rymmer endast 8 mL av media. Använda 7-8 mL i varje brunn för att förhindra ritning luft när media som blandas av flytande handler före laddning. - När media laddningen är klar, kommer 35 µL av Ex-Cell antifoam läggas från antiskum plattan till kultur fartyget. Kan 30 minuter för odlingsmedium blandas väl och den optiska DO / pH-sensorer för att vara hydrerade.
Obs: Samma volym av antifoam läggs periodvis under hela kulturtid när skumbildning upptäcks. 6 Foaming identifieras visuellt och reaktorn fartyg kontrolleras varje dag för skumbildning. Antifoam läggs omedelbart vid upptäckt. - DO / pH-kontroll slås sedan på starta övervakning och inspelning och pH odlingssubstrat. Låt de göra för att nå börvärdet på 50%, vilket tar minst 2 h.
- Efter Jämviktstiden, slå på bakgrunden bas tillägg att uppnå ett pH börvärde på 7,1 för alla odlingskärl. Att göra och pH temperera över natten och vara helt hydratiserade.
- Pausade pH - dag 1 pH Offset
- Nästa dag (markerade som dag 1), köra den pausade pH steg varigenom Välj kultur fartyg analyseras och en pH korrigering offset bestäms.
Obs: Antalet pH fartyg som skall provtas för motbokning pH är användaren bestäms. Ett prov från varje reaktortanken kanske inte nödvändigt om du har en bra representation av befolkningens bioreaktor. - Placera röret provhållaren plattor på utsedda däck och belastning micro centrifugrör med caps öppna och stoppade bredvid dem. Flytande hanteraren kommer att dispensera 600 µL av cell kultur vätska in i röret som mappas i programmet.
-
Ta omedelbart bort provet och mät pH på en närande bioanalyzer som har varit rätt kalibrerad och för vilka QCs har körts (se nedan, ”daglig näringsämne och metaboliten analys”).
Obs: Prover körs individuellt, omedelbart efter ritning, för att undvika pH-förändringar på grund av exponering för luft, som avgasning av CO2 från provet kan orsaka pH-förändringar. - Hit ”fortsätta” efter varje prov, annars nästa steg inte körs.
- Ange externa, FLEX-derived pH-värdena i programvaran, ”kompilera” förskjutningarna för samplade fartyg automatiskt. Genomsnitt de förskjutningar som erhållits för prov fartyg och ange numret i kolumnen användare pH offset under fliken ”fartyget Data” manuellt. Den genomsnittliga förskjutningen skulle sedan tillämpas till alla fartyg. Tillåta pH temperera för minst 2-3 timmar, varefter odlingskärl kan ympas.
- Nästa dag (markerade som dag 1), köra den pausade pH steg varigenom Välj kultur fartyg analyseras och en pH korrigering offset bestäms.
- Inympning
- Efter mätning VCD, flytta hela innehållet i spinner-flask(s) i en steril, 250 mL koniska Centrifugera röret och pellet celler genom centrifugering för 10 min vid 140 x g vid rumstemperatur. Dekantera det gamla mediet och slamma i tillräckligt frisk media så att det slutliga densitet ska vara 1 x 106 celler/mL efter tillägger inokulatet för fartyget i kultur.
- Tillsätt de suspenderade cellerna i den utsedda väl av en steril lockförsedda 24-bra platta. Tillsätt 3 mL av inokulatet till varje brunn, varav 2 mL tas bort inokulum för varje fartyg som kultur.
- Placera inokulum plattan på utsedda däck inuti huven. Se till att spraya på utsidan av lockförsedda inokulum plattan med 70% alkohol innan den placeras inuti huven.
- Cell räknar med automatiserad Cell Counter
- Efter inympningen, låt de odlingskärl låt jämvikta i minst en timme. Efter en timme att köra 5 X cell räkna steg i programmet. 5 X anger utspädningsfaktorn används för att läsa celltalet.
Obs: 5 X celltalet används initialt när cellerna är i fasen eftersläpning. När cellerna når sin exponentiella fasen kommer 10 X celltal att användas. Baserat på prov och spädningsvätska volymer instrumentet står för utspädningsfaktorn och justerar det slutliga värdet därefter automatiskt. - Flytande hanteraren läggs först 480 µL av 1 X PBS till cell counter cup följt av tillägg av 120 µL av cell kultur vätska från fartyget som kultur. Celltalet läses sedan använda räknaren automatiserade cell. Detta steg upprepas för alla fartyg.
- Celltalet är det sista steget för dag 1 av kultur tiden. Tillsammans med och pH data celltalet registreras data (livskraftiga cell densiteten och lönsamhet) också dagligen av programvaran.
Obs: Ren cellen counter koppen minst två gånger under tid som kör med 70% IPA att förhindra igensättning av linjer. Linjer och flöde-cell rengörs automatiskt efter varje cell räknas.
- Efter inympningen, låt de odlingskärl låt jämvikta i minst en timme. Efter en timme att köra 5 X cell räkna steg i programmet. 5 X anger utspädningsfaktorn används för att läsa celltalet.
- Pausade pH - dag 2 pH Offset
- Dag 2 kulturtid, upprepa ”pausad pH” använder kultur fartyg än de som var urvalet från under inledande pausad pH steg.
Obs: Provtagning av fartyget befolkningen för pausade pH kommer att ge en bättre förskjutning för pH korrigering. Därför inte prova de samma fartyg som används för pausade pH från föregående dag.
- Dag 2 kulturtid, upprepa ”pausad pH” använder kultur fartyg än de som var urvalet från under inledande pausad pH steg.
- Dagliga näringsämnen och metaboliten analys
- Prover kommer att tas för näringsämnesanalyser från dag 2 av kultur fram till slutet av experimentet och analyseras med näringsämnen bioanalyzer.
- Placera röret provhållaren plattor på utsedda däck och belastning micro centrifugrör med caps öppna och stoppade bredvid dem. Flytande hanteraren kommer att fördela cell kultur vätskan i röret som mappas i programmet.
Obs: För inledande är dagarna (dagar 2-4) mängden prov som tas från fartyget som kultur 300 µL. Detta är utspädd med 300 µL av 1 X PBS expedieras av flytande handler. Detta görs för att bevara kultur volymen och förhindra att nivån sjunker under 10 mL. Dessutom faller näringsvärden för de första dagarna inom detektionsområdet instrument efter utspädning. - Lägg proverna i analyzer magasinet att utföra näringsämnen analysen.
Obs: Frysa några prover som inte kommer att analyseras samma dag.
- Systemavstängning
- För att avsluta körningen, först stänga av temperaturkontroll följt av agitation. För det andra, sluta gör / pH-kontroll och bakgrund bas tillägg. För det tredje, stoppa alla andra kontroller. Slutligen, stoppa Systemövervakaren.
- Lossa klämman och rör plattor och avlägsna odlingskärl. Ren insidan av kultur stationen med en luddfri torka. Placera snabbtorkande plattorna på kultur station och skruva fast dem i.
Obs: Torkning cykel krävs för kyls version av systemet och är inte nödvändigt för standard-versionen av systemet. - Köra 2 timmars torkning cykeln på programmet. Ren följt klämma plattorna med hjälp av ultrarent vatten av 70% isopropylalkohol (IPA) för att ta bort eventuella kondenserade vätskan i raderna. Spola med luft för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska.
- Klicka på ”stopp” i bioreaktor programvaran en gång snabbtorkande cykeln har avslutats.
3. cell kultur skörd
- Överföra den cell kultur vätskan från reaktorn fartygen och pellet celler vid 1 962 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Dekantera supernatanten. Använda ett 0,22 µm PVDF filter sterila filter upphälld cell kultur vätskan.
- Alikvotens 1 mL steril cell kultur vätskan i 1,5 mL Eppendorf rör för titer analys. Lagra 1 mL tuberna vid-20 ° C. Rena resten av den skördade cell kultur vätska med hjälp av snabba protein Vätskekromatografisystem. 6
4. mäta IgG titrar
Obs: Detta är en kortfattad översikt över köra och analysera prover med hjälp av proteinA biosensor systemet. Alla assay parametrar ( t.ex. temperatur, Läs tid, rpm, etc. ) måste bestämmas empiriskt för varje Provtyp.
- Slå på systemet och tillåter lampan att värma upp för minst 1 h. ta bort prover från frys till Tina och temperera vid rumstemperatur.
- I systemprogramvaran, ställa in plattan temperatur 26 ° c. Förväg blöta antalet Protein A tips att användas i prov matris (e.g. cell media) för minst 30 minuter.
Obs: Den optimala temperaturen måste fastställas empiriskt. En temperatur på 26 ° C används här att minimera provavdunstning under längre analys gånger och låt instrumentet att hålla en jämn temperatur (genom att vara flera grader över omgivningstemperaturen). Prover måste vara pre skakade till den valda analys temperaturen före mätning av ruvning prov plattan på prov scenen för ≥ 10 minuter. - Bygga en protein standardkurva som använder samma antikropp koncentrerad till 10 mg/mL och späd seriellt i matrisen prov (dvs media) i intervallet som måste upptäckas.
Obs: Det är viktigt att få en hög koncentration av antikroppar att minimera matriseffekter på grund av utspädning, men det är också viktigt att inte över koncentrera antikroppen och framkalla aggregering. Kör en i-skylt standardkurvan för varje prov platta är att föredra. Minimalt, måste positiv kontroll användas för att redovisa spets-till-spets och plattan-till-plåt variabilitet. En ny standardkurvan måste genereras för varje ny massa protein ett tips används. - Utforma provet plattan (för ett exempel, se figur 2). I ett protein A kan analysmetod som använder regenerering, upp till 80 prov analyseras, vilket inkluderar okänd kultur prover, standarder och kontroller. För varje plåt analyseras, kommer att ett enda protein A tips användas för att mäta upp till 10 prover över plattan (kolumnerna 1-10), med en regenerering cykel mellan varje prov.
Obs: Det rekommenderas att hela första raden av plattan (rad A) användas som negativ kontroll och referens. I analysen diskuteras här, används rader B och C för två positiva kontroller; en i nedre och en vid den övre gränsen för den linjär responsen. Detta säkerställer att varje spets mäter negativa och positiva kontroller innan analysera prover. Denna uppsättning förenklar även referens subtraktion i programvaran analys. Återstående brunnarna används sedan för okända prover. Om det finns ett prov gap i en av raderna, måste det finnas en matris i denna brunn för att förhindra uttorkning av spetsen (dvs Wells A2 genom G2 har prov medan H2 inte. Säkerställa H2 innehåller prov matris för att säkerställa tip inte torkar ut innan de börjar prova H3). Slutligen inte avgas tips med hjälp av en inställd att analysera flera plattor. Använda en ny, rekommenderas icke-regenereras set för varje plåt. - Förbereda prover för analys genom att försiktigt blanda, antingen genom inversion eller pipettering, följt av en puls spin att samla in prov på botten av röret. För koncentrerad prover, skapa lämplig utspädning replikat genom spädning i prov matris.
Obs: Det linjära området av bindande för en antikropp för protein varierar en bio-lager interferometry (BLI) mätningar av både antikroppar, assay villkor och matrix. Detta bör fastställas empiriskt i förväg för att säkerställa lämpliga provspädningar används. - Förbereda 96 brunnar prov plattor så nära assay tid som möjligt. Säkerställa det inte finns några luftbubblor i någon av brunnarna. Avlägsna luftbubblor med en ren pipettspetsen eller genom centrifugering.
- Läsa in plattan i systemet och kör analysen använder standard ”hög känslighet test med Regeneration” i programvaran datainsamling. Analysera med HT dataanalys programvara.
Obs: Om plattorna skall vara beredda i förväg på grund av begränsningar, täta ordentligt med film för att förhindra avdunstning. Beroende på förväntad titrar, kan förvärv priser och tider behöva justeras. Se manualen för vägledning. - Använda programvaran dataanalys, referens subtrahera och beräkna koncentrationen av de okända prover med standardkurvan och funktionen ursprungliga lutningen (IS) med en linjär point-to-point som passar.
Representative Results
Övervakning av kritiska processparametrar och andra cell kultur parametrar i hela cellkulturer verksamhet är en viktig aspekt i bioprocessing. Den cell counter och näringsämnen analyzer användes för att kvantifiera fem attribut som kännetecknar celltillväxt, näringsämne konsumtion och biprodukt bildas. Blodkroppar erhölls dagligen för alla odlingsbetingelser. Den genomsnittliga livskraftig cell tätheter och förmåga är som kan ses i figur 3 tillsammans med deras ±1 SD intervall. Näringsämnen och biprodukt profilerna visas också med ±1 SD intervall genom den stationära fasen av kulturer. Lutningen på denna profil representerar de genomsnittliga glutamin konsumtion, glukos och laktat produktion, priserna. Sammantaget visar dessa resultat möjligheten att övervaka dessa attribut i microbioreactor systemet; samt förmåga att microbioreactor systemet att bibehålla dessa parametrar inom ett tätt intervall.
Totalproduktiviteten av cellkulturer kvantifierades med ett proteinA biosensor system efter skördade cell kulturmassmedia passerade genom ett filter med 0,22 mikrometer i PVDF. Den specifika produktiviteten per cell varierade från 0.87 pg/cell-d till 1,15 pg/cell-d som kan ses i figur 4. Baserat på dessa resultat en lång rad villkor kan undersökas för att välja media sammansättning och utfodring strategier som maximerar mängden protein produceras för en minimal investering i experimentella rutiner.
Figur 1 : Layout av microbioreactor systemet med 4 kultur stationer (CS) med 12 reaktorn fartyg varje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Exempel prov plattan set-up för en grundläggande kvantitering med regenerering experiment på systemet proteinA biosensor. rad 1 (röd ”R”) är reserverat för referensprovet (dvs matrix frånvarande analyten); rad 2 (aquamarine) är en uppsättning standarder (koncentrationer är i µg/mL). raderna 3 och 4 (orange) är uppsättningar av låga och höga positiva kontroller (”PL” och ”PH”, respektive); raderna 5 till 10 (lila) innehåller okända prover. rader 11 och 12 (grå) är program-standard positioner för regenerering (”R”) och neutralisering (”N”) buffertar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : en) Genomsnittlig livskraftig cell densiteten och livskraft profiler över åldern av en batch. ± 1 SD visas också i de microbioreactor systemen anger tight kontroll av celltillväxt. (b) genomsnittliga näringsprofil för glukos samt glutamin och den genomsnittliga biprodukt profilen för laktat. ± 1 SD visas också i de microbioreactor systemen anger tight kontroll över media sammansättning. (N = 3, alla villkor kördes i tre exemplar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa box-plot av genomsnittliga specifika produktivitet av olika media villkor. (N = 3, alla villkor kördes i tre exemplar) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kör automatisk micro bioreaktor systemet ordentligt och innebär effektivt snabba avrättningen av flera automatiserade steg. En av de viktigaste delarna av kör systemet programmering programvaran. Om det finns något fel medan du skriver programmet, blir det allvarliga fel i experimentet som kan resultera i oväntade ändringar i processen, utfodring strategi, provtagningsstrategi eller slutproduktens kvalitet som kan ogiltigförklara resultaten av studien. En annan viktig aspekt av kör systemet är att placera och dra åt klämman plattan korrekt för att säkerställa korrekt kontroll. Den vanligaste indikationen att klämma plattan har skärpts ojämnt är oväntade variationer i mätningarna för fartyg 1, 6, 7 och 12 (hörnet reaktorn fartyg). Övergripande indikerar instabilitet en uppluckring av packningar på gas inlopp raderna i klämman plattorna. Detta scenario kan hindra att nå börvärdet. En annan vanlig fallgrop att undvika när du börjar ett experiment är att låta cellerna sitta alltför länge under inympning steg, vilket får dem att lösa. Den mindre tid cellerna sitter, skadar desto mindre chans finns det att progressivt lägre inokulum blodkroppar läggs kronologiskt till reaktorn kärlen som kan orsaka betydande bias som omedvetet studieresultat. Det är bättre att Inokulera i flera etapper, dvs. Inokulera varje kultur station efter varandra med paus steg däremellan så cellerna inte sitter i inympning plattan för längre än 15 minuter.
Om daglig användning, att upprätthålla sterilitet är avgörande. Även om systemet är i biologiska säkerhetsdragskåp, garanteras sterilitet inte på grund av frekventa förflyttningar in och ut ur motorhuven. Därför måste allt som går i huven besprutas med 70% IPA. För det andra är det viktigt att säkerställa att minimal skumbildning inträffar under kulturen. Media kan täppa till gasning och uttömma linjer, vilket leder till skada av klämman plattan och även kärnkomponenter nedan. Förebyggande anti skum tillägg steg är kritiska i någon mikro bioreaktor programdesign. I händelse av en ”skum ut” det skulle vara fördelaktigt att följa tillverkarna rengöring protokoll och kan förhindra permanenta skador av klämman plattor. Alternativt, användning av icke-sparged fartyg kan vara fördelaktigt för lägre cell tätheter eller när körs i batchläge högre yta att volymförhållandet möjliggör effektiv syre även med avsaknaden av en sparger. Icke-sparged fartyg kan dock inte användbar för hög densitet eller perfusion cellkulturer som huvud utrymmet är otillräckligt för att hänga med de kulturer som ökad förbrukning av syre.
Det finns många fördelar som tillhandahålls av det microbioreactor systemet, eftersom det möjliggör flera kontrollerade kulturer ska köras parallellt i en liten skala med större kontroll än skaka kolvarna. 17 därför systemet underlättar utförandet av screening studier, gör, hög genomströmning klon studier och transfection studier. Automatiserad vätskehantering minskar också analytiker-till-analytiker variabilitet och samtidigt minimera tråkiga och tidskrävande arbete för utbildad personal. Medan det finns flera fördelar med systemet, finns det flera viktiga nackdelar som bör övervägas. Först, en kultur volym 15 ml avsevärt begränsar i processen provtagning och sista skörden material och flera alternativa småskaliga bioreaktorer (upp till 500 mL) har nyligen blivit tillgängliga. En senaste befordran till systemet är att integrera den automatiserade hur provtagningsutrustningen skall bioreaktor med BioProfile FLEX 2 analyzer från Nova Biomedical, som mildrar i provtagning frågan genom att reducera provvolymen för cell densiteten och näringsämne analys . Fördelarna kan inkludera Snabbinstallation och praktiskt taget ingen rengöring leder till operativa besparingar, men kostnaden för disponibla enheter bör övervägas för lång sikt projekt eftersom det kan vara dyrare att köpa enheter än de återanvändbara konventionella system.
Den metod som diskuteras i detta dokument är främst lämplig för batch mode cellkultur, men kan ändras beroende på användarens behov. Varje kultur station har oberoende kontroll av temperatur, medan och pH kan varieras på nivån för enskilda reaktorn fartyg. Sartorius erbjuder också DoE planering programvara som utformats speciellt för att tillåta experiment skräddarsys för micro bioreaktor systemet. Storskaliga DoE studier med hjälp av nya DoE programvara från tillverkaren kan hjälpa i media och komplettera optimering. Även om inte används här, möjliggör microbioreactor systemet också matas-batch studier. Systemet har ännu inte optimerats för perfusion cellkulturer. Det har dock begränsade studier och prövningar för att efterlikna perfusion cell kultur drift i nuvarande micro bioreaktor systemet. 26 denna metod kan ändras för att efterlikna hög densitet perfusion kulturer av cell lösa. Genom att variera höjden som Pipettera sätts in i reaktorn och genom att optimera lösa tid, kan media tas bort och fyllas på till spegelläge överflöd av kultur. Det finns nya produkter i denna utvecklande område som kan fungera bättre än det system som presenteras här önskas perfusion funktionsläget av kultur.
Sammanfattningsvis, denna studie visar användningen av automatiserade mikro-bioreaktorer och tillhörande analytisk för CHO cell kultur verksamhet att producera och karakterisera en modell IgG1 monoklonal antikropp. Den betonar den roll liten skala mikro-bioreaktorer spelar i bioprocess tillverkning och deras påverkan på kultur celltillväxt och media screening. Medan det finns många fördelar med att använda ett automatiserat småskaliga system, för att fullt ut förverkliga sina förmåner bearbeta förståelse och analytiska karakterisering är absolut nödvändigt. Denna studie ger användaren med en riktlinje för att använda ett automatiserat hur provtagningsutrustningen skall reaktorn system, som kan utvecklas och förbättras per Forskningsbehovet på enskilda områden.
Disclosures
Friskrivningsklausul: Denna publikation återger författaren åsikter och ska inte tolkas för att representera FDA: s åsikter eller politik.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Scott Lute för det analytiska stöd som de ges. Partiell intern finansiering och stöd för detta arbete var som tillhandahålls av CDER kritisk sökväg programmet (CA #1-13). Projektet stöddes delvis av en utnämning till deltagande praktik/forskningsprogrammet på Office av biotekniska produkter, US Food and Drug Administration, administreras av Oak Ridge Institutet för vetenskap och utbildning genom en institutionsöverskridande avtal mellan US Department of Energy och FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
