Summary
Als gevolg van het hoge vetgehalte, heeft adipeus weefsel is uitdagend om te visualiseren met behulp van traditionele histologische methoden. Adipo-Clear is een weefsel clearing techniek waarmee robuuste labeling en hoge resolutie volumetrische fluorescerende beeldvorming van vetweefsel. Hier beschrijven we de methoden voor de bereiding van de monsters, voorbehandeling, kleuring, clearing en montage voor imaging.
Abstract
Vetweefsel speelt een centrale rol in de homeostase van de energie en thermoregulatie. Het is samengesteld uit verschillende soorten adipocytes, evenals adipocyte precursoren, immune cellen, fibroblasten, bloedvaten en zenuwen projecties. Hoewel de moleculaire controle van cel type specificatie en de wisselwerking van deze cellen hebben steeds zijn afgebakend, kan een vollediger inzicht in deze cellen adipeus-ingezeten worden bereikt door het visualiseren van hun distributie en architectuur gedurende het hele weefsel. Bestaande immunohistochemistry en immunofluorescentie benaderingen voor het analyseren van obesitas histologie is afhankelijk van dunne paraffine-ingebedde secties. Echter, dunne secties vangen slechts een klein gedeelte van weefsel; Dientengevolge, kunnen de conclusies worden beïnvloed door welk deel van weefsel wordt geanalyseerd. Daarom hebben we een adipeus weefsel clearing techniek, Adipo-Clear, om toe te staan uitgebreide driedimensionale visualisatie van moleculaire en cellulaire patronen hele vetweefsel. Adipo-Clear werd aangepast van iDISCO / iDISCO +, met specifieke wijzigingen aangebracht in de lipide opgeslagen in het weefsel met behoud van de morfologie van het oorspronkelijke weefsel volledig te verwijderen. In combinatie met licht vel fluorescentie microscopie tonen we hier het gebruik van de methode Adipo-Clear te verkrijgen van de volumetrische resolutieafbeeldingen van een hele adipeus weefsel.
Introduction
Tot voor kort werd adipeus weefsel opgevat als een amorfe verzameling van vetcellen. In de afgelopen decennia, is ons begrip meer verfijnd, gegroeid met vet nu erkend als een complex orgaan met verschillende soorten adipocytes, evenals adipocyte precursoren, immune cellen, fibroblasten, de therapieën en zenuw projecties. Interacties tussen deze cellen adipeus-ingezeten hebben uitgesproken effecten op vetweefsel en organisch fysiologie en pathofysiologie1. Hoewel opkomende studies hebben ontrafeld belangrijke moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan bepaalde interacties, vereist een vollediger begrip betrouwbare structurele profilering van het hele weefsel in drie dimensies (3D).
Onze huidige kennis van vetweefsel morfologie is grotendeels gebaseerd op histologische analyse van dunne secties (5 μm) met relatief hoge-vergroting beeldvorming (meer dan 10 X)2,3. Deze benadering heeft echter enkele belangrijke beperkingen. Eerste, ingewikkelde filamenteuze structuren zoals sympathische zenuwen en de therapieën, waarvan bekend is dat een belangrijke rol spelen in de obesitas functie4,,5,,6,7, zijn moeilijk te evalueren via de dunne secties. Ten tweede, vanwege zijn schijnbaar amorfe vorm en het gebrek aan representatieve structurele eenheden te concentreren op, het is moeilijk te waarderen adipeus weefsel structuren alleen gebaseerd op sectie kleuring. Ten derde, vetweefsel heeft een zeer hoog vetgehalte, maken van de uitdagingen bij het verkrijgen van consistente seriële secties die geschikt voor 3D anatomische reconstructie, een conventionele methode gebruikt zijn bij het bestuderen van de hele hersenen morfologie8. Gezien deze factoren, is er een grote behoefte aan een geheel-mount aanpak die 3D visualisatie van een hele obesitas depot terwijl nog het bereiken van cellulaire resolutie kan bieden.
3D volumetrische beeldvorming van een gehele orgaan is uitdagend vanwege de verduistert effecten van licht spreiding. Een belangrijke bron van licht spreiding in biologische weefsels komt van lipide-waterige interfaces. Hoewel de inspanningen om te elimineren scatter doordat lipiden lopende voor meer dan een eeuw geweest, zijn er een groot aantal recente innovaties9. Een dergelijk nieuw ontwikkelde weefsel-clearing methode is immunolabeling ingeschakelde 3D beeldvorming van oplosmiddel-gewist organen (iDISCO / iDISCO +)10,11. Vetweefsel kampt echter met een bijzondere uitdaging, gezien zijn hoge niveau van lipiden, en daarom extra wijzigingen in de iDISCO / iDISCO + protocol moeten volledig uittreksel van de lipiden terwijl de bescherming van het weefsel instort. Het gewijzigde protocol die we hebben ontwikkeld, nu genaamd Adipo-Clear, maakt gebruik van methanol/dichloormethaan gebaseerde delipidation van vetweefsel aan het bereiken van optimale transparantie geschikt voor hoge resolutie volumetrische imaging12. Want de delipidation stap grotendeels lest endogeen uitgedrukt fluorescente proteïnen zoals GFP en RFP, moet visualisatie van dergelijke eiwitten worden bereikt door immunolabeling. Globaal, dit eenvoudig en robuust protocol kan worden toegepast om te bestuderen van weefsel-niveau organisatie van adipeus-ingezeten cellen, lineage traceren van adipocyte voorlopercellen, en obesitas morfogenese tijdens de ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verzorging van de dieren en experimenten werden uitgevoerd volgens de procedures die zijn goedgekeurd door het dier zorginstellingen en gebruik Comité aan de Rockefeller-universiteit.
1. de weefsels voorbereiding
- Voer standaard intracardiac perfusie met ~ 20 mL voor 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C tot het bloed wordt volledig verwijderd uit het weefsel.
- Activeer het perfusaat ~ 20 mL kleefpoeders oplossing (4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS) bij 4 ° C tot de nek en staart hebben aanzienlijk verstijfd.
Let op: PFA is giftig. Vermijd contact met huid, ogen en slijmvliezen. Oplossingen moeten worden gemaakt in een zuurkast. - Ontleden de dikke pads van belang zorgvuldig met de gehele vet pad verwijderen zonder deze te beschadigen. Gebruik bot-ended pincet te voorkomen knijpen of knijpen van het weefsel. Vermijd besmetting van de ontleed weefsel met een bont.
- Na het bevestigen van het weefsel in 4% PFA in 1 x PBS overnacht bij 4 ° C. Voor elke vet pad, na correctie met ~ 10 mL van oplossing van de fixatie in een conische tube van 15 mL.
- Wassen het weefsel 3 keer (van elk 1 h) met 1 x PBS bij kamertemperatuur (RT).
- Opslaan van het weefsel voor korte termijn (tot 2 weken) in 1 x PBS bij 4 ° C en beschermd tegen licht. Voor langdurige opslag (bijvoorbeeld1-2 jaar), schakelen de buffer naar 1 x PBS met 0,05% natriumazide (als conserveringsmiddel).
Let op: Natriumazide is zeer giftig is wanneer mondeling ingenomen of geabsorbeerd door de huid. Geconcentreerd natriumazide oplossingen (op 5% of meer) moeten worden behandeld in een zuurkast.
2. Delipidation en Permeabilization
Timing: 1-2 dagen
- Bereiden van 20%, 40%, 60% en 80% methanol gradiënt met B1n buffer (tabel 1) (v/v), bvvoor 20% methanol/B1n buffer, meng 20 mL van methanol en 80 mL B1n buffer. Opslaan van alle buffers bij 4 ° C. Glycine kristallen zal neerslaan van 60% en 80% methanol/B1n buffers als gevolg van de verzadiging. Voorkomen dat het verwijderen van de kristallen; Gebruik de vloeibare oplossing voor de volgende wast.
Let op: Methanol is vluchtige, irriterende, licht ontvlambaar. Vermijd huid- of oogcontact. - Verwijder voorzichtig het haar uit de steekproef onder een Microscoop dissectie. Elke haar, lint of puin gekoppeld aan het monster zal veroorzaken schaduwen tijdens imaging. Breng de schoongemaakte monster in een nieuwe buis.
- Voer alle volgende stappen uit op ijs of bij 4 ° C tenzij anders aangegeven. Voor kleine steekproeven (b.v., posterior subcutaan/perigonadal dikke pads van jonge slanke muizen), 2 mL microcentrifuge buizen met 1.6 mL van de oplossing te gebruiken. Voor de grote monsters of met hoog vetgehalte (bijvoorbeeld, vet pads van zwaarlijvige muizen), 5 mL buisjes met 4 mL van de oplossing te gebruiken.
- Plaatsen van de buizen met de monsters horizontaal op een roteerschudapparaat vastgesteldop ~ 100 rpm. Zorg ervoor dat de monsters zich vrij kunnen bewegen in de buis.
- Het uitdrogen van het monster in een gesorteerde reeks van 20%, 40%, 60%, 80% en 100% methanol/B1n buffer voor de aangegeven tijd (tabel 2). Het minimaliseren van de "Carry-over"-oplossing.
- Delipidate het monster met 100% dichloormethaan (DCM) (3 keer), elk met de incubatietijd aangegeven in tabel 2. Het monster moet zinken naar de bodem van de buis aan het einde van de tweede en derde DCM wast. Zo niet, de incubatietijd om ervoor te zorgen volledige delipidation uit te breiden (bvverlengen van 30 min tot 1-2 h).
Let op: DCM moet worden behandeld in een zuurkast. Gebruik glazen recipiënten voor opslag en microcentrifuge buizen die zijn gemaakt van polypropyleen voor incubations. De microcentrifuge-buizen moeten niet worden gebruikt voor langetermijnopslag van DCM. Petrischalen en serologische pipetten die van polystyreen gemaakt zijn stroken niet met DCM. DCM is zeer volatiel. Breng het monster in verse oplossing snel om uitdroging te voorkomen. - Wassen tweemaal met 100% methanol voor de aangegeven tijd (tabel 2).
- Optioneel: Als het monster niet goed perfused is, kan de kleur van hemoglobine van de resterende rode bloedcellen sterk autofluorescence veroorzaken. Bleekmiddel met 5% H2O2 in methanol (1 deel 30% H2O2 tot 5 volumes van methanol) 's nachts bij 4 ° C.
- Het monster in een omgekeerde methanol/B1n buffer reeks hydrateren: 80%, 60%, 40%, 20% methanol/B1n en 100% B1n buffer (2 keer) voor de aangegeven tijd (tabel 2).
- Wassen van het monster met PTxwH buffer (tabel 1) voor 2 h op RT.
- Het delipidated monster in PTxwH buffer bij 4° C (tot 1 jaar) opslaan of ga onmiddellijk naar de immunokleuring stap.
3. hele Mount immunokleuring
Timing: 8-10 dagen
Opmerking: Alle van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd op RT tenzij anders aangegeven, met schudden en bescherming tegen licht. Voor kleine steekproeven, 2 mL microcentrifuge buizen met 1.6 mL van de oplossing te gebruiken. Voor grote monsters, 5 mL buisjes met 4 mL van de oplossing te gebruiken. Het is aanbevolen om eerst de antilichamen op kleine stukjes weefsel of de methanol-behandelde weefselsecties valideren.
- Verdun het primaire antilichaam in PTxwH buffer bij de aanbevolen concentratie. Centrifugeer de verdunde antilichaam oplossing bij ~ 20.000 x g gedurende 10 minuten introductie antilichaam precipitaten of aggregaties te voorkomen.
- Incubeer het monster van de delipidated met het primaire antilichaam-oplossing voor de aangegeven tijd (tabel 2).
- Wassen van het monster met PTxwH buffer in een reeks van incubatie stappen: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 uur, 2 h, 4 h en overnachting.
- Verdun het secundaire antilichaam in PTxwH buffer bij de aanbevolen concentratie. Centrifugeer de verdunde antilichaam oplossing bij ~ 20.000 x g gedurende 10 minuten introductie antilichaam precipitaten of aggregaties te voorkomen.
Opmerking: Om te voorkomen dat hoge achtergrond veroorzaakt door weefsel autofluorescence, secundaire antilichamen zijn geconjugeerd met fluorophores die uitstoten van licht in het rood en far-red gebieden worden aanbevolen. Afhankelijk van het aantal laserlijnen beschikbaar op een Microscoop, kan maximaal 3-4 markeringen gelijktijdig in één monster worden beeld. - Incubeer het monster met de secundair antilichaam-oplossing voor de aangegeven tijd (tabel 2).
- Wassen monster met PTxwH buffer in een reeks van incubatie stappen: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 uur, 2 h, 4 h en overnachting.
- Optioneel: Voor weefseltypes (HLA) die kwetsbaar zijn, fix het gekleurd weefsel met 4% PFA in 1 x PBS overnacht bij 4 ° C tot het bijdragen aan het behoud van de morfologie van het weefsel.
Opmerking: Deze stap kan verhogen beeldvorming achtergrond. Het is niet nodig voor het uitvoeren van deze stap voor adipeus weefsel. - Het monster met 1 x PBS wassen in een reeks van incubatie stappen: 5 min, 10 min, en 30 min.
- Voorzichtig uit het monster onder een Microscoop dissectie lint te verwijderen.
4. de weefsels Clearing
Timing: 1-2 dagen
- Optioneel: Insluiten het monster in de agarose om monster montage voor licht vel microscopie.
Opmerking: Deze stap wordt sterk aanbevolen voor adipeus weefsel te stabiliseren zijn vorm tijdens imaging.- Bereid de insluiten oplossing met 1% agarose in 1 x PBS (w/v). Koel de insluiten oplossing voor ~ 40 ° C om te voorkomen dat het monster aan overmatige hitte blootstellen.
- Leg de schoongemaakte monster in een mal (b.v., petrischaal of gewicht van de boot) en regelen het naar de gewenste positie. Vermijd alle vloeibare overdracht. Giet voorzichtig het insluiten oplossing over het monster. Vermijd alle luchtbellen.
- Laat de agarose stollen volledig bij RT. Cut uit een blok met het monster.
Opmerking: Alle van de volgende stappen, met inbegrip van overnachting incubations moet worden uitgevoerd op RT, met schudden en bescherming tegen licht. Voor kleine steekproeven, 2 mL microcentrifuge buizen met 1.6 mL van de oplossing te gebruiken. Voor grote monsters, 5 mL buisjes met 4 mL van de oplossing te gebruiken.
- Het uitdrogen van het monster in methanol verloop met H2O: 25%, 50%, 75% en 100% (3 keer) voor de aangegeven tijd (tabel 2).
Opmerking: Monster kan worden overgelaten 's nachts bij de 100% methanol stap. - Incubeer het monster in 100% DCM voor 1 h met schudden (3 keer). Monster moet zinken naar de bodem van de buis aan het einde van elke DCM wassen. Als dat niet het geval is, breiden de incubatietijd om volledige verwijdering van methanol. Monster kan 's nachts bij de 100% DCM stap worden overgelaten.
- Incubeer het monster in dibenzyl ether (DBE) 's nachts met milde schudden om brekingsindex matching.
Opmerking: Monster zal uiteindelijk worden transparant in zichtbaar licht.
Let op: DBE is gevaarlijk. Vermijd elk contact met de huid. Behandelen in een zuurkast met dubbellaagse handschoenen. Gooi de handschoenen, zodra het wordt verontreinigd met DBE. Gebruik glazen recipiënten voor opslag en microcentrifuge buizen (polypropyleen) voor incubations. De microcentrifuge-buizen moeten niet worden gebruikt voor langetermijnopslag van DBE. Petrischalen en serologische pipetten die van polystyreen gemaakt zijn stroken niet met DBE. Reinig elke morsen met 100% ethanol. - Incubeer het monster met verse DBE met milde schudden 2 h. winkel het monster bij RT in het donker of ga direct naar imaging.
Opmerking: Monsters worden aanbevolen aan het beeld worden binnen een maand. Hoewel bepaalde fluorophores stabieler dan anderen zijn, wordt langdurige opslag van de monsters in dit stadium niet aanbevolen.
5. microscopie
- Beeldbewerking met een licht vel Microscoop die compatibel is met de DBE.
Opmerking: Alleen doelstellingen die zijn goedgekeurd voor organische oplossingsmiddelen gebaseerde beeldvorming en overeenkomen met de brekingsindex van DBE kunnen worden gebruikt als de doelstellingen in DBE-ondergedompeld beeldbewerking dompelen.- Monteer het agarose-embedded monster op een houder die voorkomen verkeer tijdens imaging dat kan. Dompel het monster in een DBE gevulde zaal.
- Het verzamelen van een z-stack die betrekking hebben op het gehele monster (bijvoorbeeld, 1-2 X vergroting) te verkrijgen van geheel-weefsel distributie/structuur van de markering van belang.
- Overschakelen naar een doel met hogere vergroting (bijv., 4-12 X vergroting) om in te zoomen op de regio's van belang om het imago van gedetailleerde structuren.
Opmerking: Collageen is een belangrijke bijdrage aan de extracellulaire matrix van vetweefsel, die alle vetcellen13omringt. Collageen is een typische emissiespectrum variërend van ongeveer 400 nm tot 550 nm14. Beeldvorming van het monster met de 488 laser line (groen) en het verzamelen van het uitgestraalde licht op een golflengtebereik dat binnen het emissiespectrum van collageen (b.v., 525-550 nm ligt) zorgt voor het weefsel autofluorescence signaal, dat bleek eerder te bakenen vet cel contour en algehele weefsel het platform12.
- Beeldbewerking met een omgekeerde confocal of een twee-foton microscoop.
- Leg het monster agarose-ingebed in een dia van de kamer met een glazen bodem zonder te raken alle plastic onderdelen (of andere DBE-compatibele imaging kamer die kan zegel). Zorg ervoor dat DBE doet niet uitlekken.
- Kies de doelstellingen met langere afstanden van de werken aan het bereiken van dieper penetratie.
Opmerking: Imaging moet gebeuren met een omgekeerde confocal of twee-foton microscoop door de glazen bodem van de kamer dia. Vermijd direct contact tussen het monster en de doelstellingen die niet zijn voorgesteld voor DBE gebaseerde imaging dompelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Adipo-Clear bereid hele vet kussentjes kunnen worden beeld in 3D te analyseren hoe weefsel morfologie en cellulaire interacties worden beïnvloed in de Staten mager en obesitas. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast om te analyseren van algemene obesitas structuur door het verzamelen van het weefsel autofluorescence signaal in het groene kanaal. Wij hebben eerder aangetoond dat het autofluorescence signaal in obesitas overlays gunstig met perilipin vlekken, een veelgebruikte marker te schetsen van de volwassen adipocytes12. Bijvoorbeeld, het scannen van een posterieure onderhuids vet pad (psWAT) met behulp van een Microscoop licht vel met lage vergroting (1.3 X) toont de lobulair organisatie van adipocytes (figuur 1A en B). Meer gedetailleerde informatie, zoals de grootte van de adipocytes, kan worden onthuld door in te zoomen in de regio's van belang met hogere vergroting (4 X) (Figuur 1 c en D).
Adipo-Clear is vooral handig voor het visualiseren van draadvormige structuren zoals de projecties van de zenuwen en bloedvaten, die uitdagend om te vangen of trace op dunne secties zijn. Het sympathische zenuwstelsel (SNS) speelt een cruciale rol bij het beheersen van de lipolyse en thermogenese in adipeus weefsel4,5. Imaging een pad van de psWAT gekleurd met tyrosine hydroxylase (TH), onthult een marker voor SNS, de structuren die verschijnen als grote zenuw bundels, bloedvat innervatie arm, evenals de dichte terminal arborization in het weefsel parenchym (figuur 2A-H). Bovendien tonen de TH + parenchymal-projecties regionale variatie in psWAT, met de inguïnale gedeelte met hogere dichtheid ten opzichte van het gedeelte van de torsolumbale (2E figuur-H; Aanvullende film 1). Onze vorige werk heeft aangetoond dat SNS terminal arborization computationeel kan worden getraceerd en gereconstrueerd met behulp van het hulpprogramma FilamentTracer voor Imaris software te beoordelen van de dichtheid van de innervatie arm12.
Adipeus weefsel is worden zwaar gevacuoliseerd bekend. De veranderingen in de metabole eisen van adipeus worden vaak geassocieerd met dynamische verbouwing van zijn therapieën6,7. Robuust en snelle profilering van geheel-weefsel therapieën kan voorzien in extra onbevooroordeelde analyse bloedvat remodelleren. Met behulp van bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul (PECAM-1, ook bekend als CD31) als een marker label bloedvaten, vastgesteld we hebben dat alle adipocytes in contact met de haarvaten gedurende het hele weefsel (figuur 3A-H zijn; Aanvullende Movie 2), ter ondersteuning van de grote vraag naar efficiënte voedingsstoffen en zuurstof uitgewisseld in adipeus.
Immune cellen zijn een ander cruciaal onderdeel van het vetweefsel. In de zwaarlijvige staat, raakt adipeus weefsel ontstoken, die vergezeld gaat van de infiltratie van pro-inflammatoire macrofagen die vormen "kroon-achtige" structuren rond van dode adipocytes15,16. Dikke pads van zwaarlijvige dieren zijn bijzonder moeilijk te duidelijk te wijten aan hun grote omvang en hoger vetgehalte. De uitgebreide versie van Adipo-Clear (beschreven in tabel 2 voor grote weefsel of weefsel met een hoog vetgehalte) kunnen echter consistent clearing van hele hoge vet-beladen weefsel. Epididymaire vet uit een muis gevoed met 16 weken van vetrijke dieet bevat bijvoorbeeld dichte "kroon-achtige structuren", immunolabeled door CD68, gedurende het hele weefsel (figuur 4A en B). Belangrijker, optische secties genomen vanuit verschillende posities over de gehele diepte van het weefsel (~ 4-5 mm) Toon even scherpe beelden, demonstreren van de volledige verrekening van het weefsel (figuur 4C-F).
Figuur 1: analyse van de morfologie van de adipeus weefsel met behulp van het autofluorescence signaal. Alle panelen zijn licht blad fluorescentie microscopie (LSFM) afbeeldingen van een Adipo-Clear bereid psWAT pad geïsoleerd uit een 8-week-oude C57Bl/6J mannelijke muis gehuisvest op RT. Het autofluorescence signaal wordt verzameld door het scannen van het gewiste monster met het groene kanaal. Optische secties (dwarsdoorsneden van het midden van het monster) van de torsolumbale regio (A) en de inguïnale regio (B) door 1.3 X doelstelling genomen. (C, D) High-vergroting (4 X) optische secties van de boxed regio's van de A en B. Lymfeklieren worden aangegeven met sterretjes. Schaal bars worden aangeduid in elk deelvenster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: 3D imaging van sympathieke innervatie arm in adipeus weefsel. Alle panelen zijn LSFM beelden van een psWAT aangeduid met tyrosine hydroxylase (TH) (hetzelfde monster zoals in Figuur 1). Maximale prognoses van de gereconstrueerde torsolumbale regio (A) en de inguïnale regio (B) door de 1.3 X doelstelling genomen. (C, D) Optische secties uit het midden van A en B. (E, F) High-vergroting (4 X) optische secties van de boxed regio's uit C en D. (G, H) High-vergroting optische secties van de overlay tussen TH (groen) en autofluorescence (magenta). Pijlpunten geven verschillende patronen van sympathieke innervatie arm: (1) zenuw bundel; (2) bloedvaten innervatie arm; (3) parenchymal arborization. Lymfeklieren worden aangegeven met sterretjes. Schaal bars worden aangeduid in elk deelvenster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: 3D imaging van bloedvaten in adipeus weefsel. Alle panelen zijn LSFM beelden van een CD31 met het label psWAT (hetzelfde monster zoals in Figuur 1). (A, B) Maximale prognoses van de gereconstrueerde torsolumbale regio (A) en de inguïnale regio (B) door de 1.3 X doelstelling genomen. (C, D) Optische secties uit het midden van A en B. (E, F) High-vergroting (4 X) optische secties van de boxed regio's uit C en D. (G, H) High-vergroting optische secties van de overlay tussen CD31 (rood) en autofluorescence (cyaan). Lymfeklieren worden aangegeven met sterretjes. Schaal bars worden aangeduid in elk deelvenster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: 3D beeldvorming van de "kroon-achtige structuren" in adipeus weefsel. Alle panelen zijn LSFM beelden van een Adipo-Clear bereid eWAT pad geïsoleerd van een mannelijke muis gevoed met hoog vet dieet voor 16 weken. De steekproef was immunolabeled met CD31 en CD68. (A, B) Maximale prognoses van het gereconstrueerde monster met een totale diepte van meer dan 4 mm. (A) X-Y Bekijk. (B) Y-Z weergave. (C-F) Optische secties van de aangegeven diepte in B. Schaal bars worden aangeduid in elk deelvenster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Buffer | Chemische stof | Eindconcentratie |
| B1n buffer | ||
| Glycine | 0,3 M | |
| Triton-X-100 | 0,1% (v/v) | |
| H2O | Oplosmiddel | |
| Natriumazide (conserveermiddel, optioneel) | 0,01% (g/v) | |
| Breng de pH op 7 met NaOH | ||
| PTxwH buffer | ||
| 10 x PBS | 1 x | |
| Triton-X-100 | 0,1% (v/v) | |
| Tween-20 | 0,05% (v/v) | |
| Heparine | 2 µg Mo/ml | |
| H2O | Oplosmiddel | |
| Natriumazide (conserveermiddel, optioneel) | 0,01% (g/v) |
Tabel 1: lijst van buffers en oplossingen. Deze tabel bevat recepten voor de buffers gebruikt in Adipo-Clear. Voor langdurige opslag van de buffers, is het aanbevolen om het toevoegen van natriumazide als conserveermiddel.
| Buffer | Kleine weefsel | Grote weefsel (of met een hoog vetgehalte) | Temperatuur |
| 20% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 80% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% methanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 30 min | 1 h | 4° C |
| DCM | 1 h | 2-3 h, of 's nachts | 4° C |
| DCM | 30 min | 2 h | 4° C |
| 100% methanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| 100% methanol | 30 min | 1 h | 4° C |
| Optioneel: 5% H2O2/methanol | Overnachting | Overnachting | 4° C |
| 80% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 60% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 40% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| 20% methanol/B1n buffer | 30 min | 1 h | 4° C |
| B1n buffer | 30 min | 1 h | RT |
| B1n buffer | Overnachting | Overnachting | RT |
| PTxwH buffer | 2 h | 2 h | RT |
| PTxwH buffer | Opslag | Opslag | 4° C |
| Primair antilichaam-incubatie | 3 dagen | 4-5 dagen | RT |
| Incubatie van secundair antilichaam | 3 dagen | 4-5 dagen | RT |
Tabel 2: incubatie tijden voor delipidation en immunokleuring. Deze tabel bevat incubatie tijden voor de delipidation en immunokleuring stappen van het protocol. Het geschatte gewicht van kleine weefsel is < 300 mg.
Aanvullende film 1: 3D imaging van sympathieke innervatie arm in adipeus weefsel. Tyrosine hydroxylase (TH) immunokleuring van een psWAT monster (hetzelfde als in Figuur 2). De film toont de fly-through van optische secties (4 X uit de torsolumbale) en inguïnale regio's van de psWAT, met een totale diepte van ~ 2 mm. TH is getoond in groen. Autofluorescence wordt weergegeven in magenta. De regio uit het gedeelte torsolumbale lijkt te hebben lagere SNS dichtheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Movie 2: 3D imaging van de therapieën in adipeus weefsel. CD31 immunokleuring van een psWAT monster (hetzelfde als in Figuur 3). De film toont de fly-through van optische secties (4 X uit de torsolumbale) en inguïnale regio's van de psWAT, met een totale diepte van ~ 2 mm. CD31 is in rood weergegeven. Autofluorescence wordt weergegeven in cyaan. Alle adipocytes ernaar uit nauw worden omringd door de haarvaten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adipo-Clear is een eenvoudige en robuuste methode voor het ontruimen van vetweefsel, die gemakkelijk kunnen worden uitgevoerd in een regelmatige lab setup. In vergelijking met andere methoden op basis van oplosmiddel clearing zoals iDISCO / iDISCO +10,11,12, Adipo-Clear is met name geoptimaliseerd voor het ontruimen van vetweefsel en ander weefsel met een hoog vetgehalte. De delipidation stap volledig verwijderd adipeus, lipiden en daarom vergemakkelijkt immunolabeling gedurende het hele weefsel en grotendeels minimaliseert lichte scatter, end-to-end imaging zonder verlies van XY-resolutie toe te staan. Naast licht vel fluorescentie kunnen microscopen, waarmee snel scannen van grote weefsel, confocal en twee-foton microscopen ook worden gebruikt om grotere resolutie en meer details te verkrijgen.
De delipidation/DCM methanolbasis is een cruciale stap. Onvoldoende delipidation kan leiden tot onscherpe beelden, vooral naar de kern van het weefsel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen volledige verwijdering van lipiden door het observeren van obesitas monsters zinken in DCM. De monsters die een mengsel van weefseltypes (HLA) (b.v., epididymaire vet met bijbal en testis aangesloten bevatten) kunnen niet volledig wastafel zelfs met uitgebreide DCM incubations. Nochtans, het broeden van deze monsters overnachting in DCM moet bereiken volledige delipidation. Als gevolg van de denaturatie van eiwitten in deze organische oplosmiddelen, bepaalde antistoffen mogelijk niet compatibel met de delipidation stap. Het kiezen van een geschikte antilichaam wordt daarom een andere kritische stap voor dit protocol. Het is aanbevolen om eerst valideren de antilichamen op methanol-behandelde weefselsecties of kleine stukjes weefsel door Adipo-Clear verwerkt. Evenzo moet de verenigbaarheid van chemische kleurstoffen met methanol/DCM/DBE ook worden getest voordat toepassing.
Een beperking van het protocol is het blussen van het endogeen uitgedrukt fluorescente proteïnen. De organische oplossingsmiddelen gebaseerde delipidation en clearing stappen denatureren grotendeels dergelijke eiwitten bevatten. Om te visualiseren endogene fluorescente proteïnen, moet labelen van het antilichaam worden toegepast. De beschikbaarheid van geschikte antilichaam combinaties beperkt de mogelijkheid voor het uitvoeren van zeer multiplexed imaging. De huidige beschikbare licht vel microscopen kunnen alleen beeld tot 4 kanalen.
Adipo-Clear is vooral handig voor het visualiseren van draadvormige structuren en de bevolking van de cel die relatief lage dichtheid in adipeus weefsel hebben. Imaging dichte signalen wordt echter beperkt met deze aanpak. Wanneer antilichamen worden gebruikt voor het etiketteren van dichte signalen, kunnen zij worden afgezonderd door de epitopes gelegen op het oppervlak van het monster, het blokkeren van de toegang tot het interieur van het weefsel. Kleine chemische sondes worden daarom aanbevolen om vlek dichte structuren. Als gevolg van de zelfde kwestie is de toepassing van Adipo-Clear op bruin vetweefsel beperkt. Bruin vet is een obesitas depot met dichte structuren. Naast dichte bloedvaten en zenuwen innervatie arm, is het ook strak vol met kleine adipocytes die een groot aantal mitochondriën17 bevatten. Bij de toepassing van CD31 en TH kleuring met dezelfde procedure als hierboven beschreven te bruin vet, alleen het oppervlak van het monster werd het label (gegevens niet worden weergegeven). Bruin vet produceert bovendien sterk weefsel autofluoresence, wat leidt tot lage signal-to-noise verhouding tijdens imaging. Het is aanbevolen om bruin vet in kleinere stukken gesneden en gebruik van chemische sondes indien mogelijk.
Over het geheel genomen Adipo-Clear kunt gelijktijdige profilering van meerdere structuren van belang met hoge resolutie in hele adipeus weefsel. Met behulp van deze aanpak, kunt een analyseren hoe structuren zoals zenuwen projecties, therapieën, immune cellen en adipocytes werken gedurende de hele vet pad. Het biedt onpartijdige imaging gegevens door het vermijden van segmenteren of het kiezen van de regio's van belang. Adipo-Clear kan ook worden toegepast om te bestuderen van de ontwikkeling van de obesitas zoals gebeurtenissen tijdens vroege morfogenese, alsmede de verdeling van de cellen van adipocyte voorlopercellen en voorloper in bloedlijn tracering studies. Naast adipeus, kan Adipo-Clear ook 3D geheel-mount analyse van andere weefsels die hoog vetgehalte hebben of zijn omringd door vet, zoals melkklier en vette lymph node vergemakkelijken. Deze methode biedt ook de mogelijkheid te bestuderen van de histologie van menselijk vetweefsel in fysiologische en pathologische omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Christina Pyrgaki, Tao Tong en Alison North uit het Bioimaging Resource Center aan de Rockefeller-universiteit voor hulp en ondersteuning. Wij danken ook Xiphias Ge Zhu voor het bewerken van de film. Dit werk werd gesteund door het Human Frontier Science programma organisatie (PC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270991 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | 325-100 | |
| Benzyl ether | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | 1:200 dilution |
| Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1 | R&D Systems | AF3628 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | Final concentration of 2 µg/mL |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | Final concentration of 5-10 µg/mL |
| Imaging chamber | ibidi | 80287 | |
| Light sheet microscope | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| Imaging software | LaVision BioTec | Imspector software | |
| Microscopy visualization software | Bitplane | Imaris |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
- Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
- Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
- Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
- Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
