Summary

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Published: September 28, 2018
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Summary

Wir präsentieren Protokolle hierin für High Yield Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und Protein Transport Assays für die Chloroplasten Twin Arginin Translokation (CpTat), sekretorische (cpSec1) und Signalwege Anerkennung Teilchen (CpSRP).

Abstract

Chloroplasten sind die Organellen in grünen Pflanzen verantwortlich für zahlreiche wichtige Stoffwechselwege, die vor allem Photosynthese. Innerhalb der Chloroplasten der Thylakoidmembran-Membran-System beherbergt die photosynthetische Pigmente, Reaktion-Zentrum-komplexe und die meisten der Elektron-Träger, und ist verantwortlich für Licht-abhängige ATP-Synthese. Über 90 % der Chloroplasten Proteine sind im Zellkern codiert, übersetzt in die Zellflüssigkeit und anschließend in die Chloroplasten importiert. Protein-Weitertransport in oder über der Thylakoidmembran Membran nutzt eine der vier Translokation Wege. Hier beschreiben wir eine hochverzinsliche Methode zur Isolierung von Transport-kompetente Thylakoids aus Erbsen (Pisum Sativum), zusammen mit Transport-Assays durch drei Energie-abhängige CpTat, cpSec1 und CpSRP-vermittelten Signalwege. Diese Methoden ermöglichen Experimente bezüglich Thylakoidmembran Protein Lokalisierung, Transport-Energetik und die Mechanismen der Protein Translokation über biologische Membranen.

Introduction

Fast alle die proteinhaltige Maschinen verantwortlich für die ordnungsgemäße Chloroplasten Funktion muss aus dem Zytosol1umgesiedelt werden. Die Chloroplasten-Umschläge sind Protein Substrate durch das Translocon der äußeren Membran (TOC) und die Translocon der inneren Membran (TIC)2eingeführt. Weitere Ausrichtung auf die Thylakoidmembran erfolgt Membran und Lumen durch Twin Arginin Translokation (CpTat)3, die sekretorischen (cpSec1)4, Signal Anerkennung Teilchen (CpSRP)5, und die spontane Aufnahme Wege6 . Eine Methode für die High Yield Isolierung der physiologisch aktiven Chloroplasten und der Thylakoidmembran Membranen ist notwendig zur Messung der Energetik und Kinetik einer Translokation Veranstaltung, zu die vielfältigen Transportmechanismen in jeder Weg zu verstehen und zu lokalisieren eine bestimmtes Protein Substrat für eines der sechs verschiedene Fächer der Chloroplasten von Interesse.

Die Isolation der Membranen aus den Chloroplasten bietet bessere experimentelle Kontrolle über Umweltfaktoren (z. B. Salz und Substrat-Konzentrationen, die Anwesenheit von ATP/GTP und pH-Bedingungen), die die Messung der Transport Energetik zu beeinflussen und Kinetik. Dieser in-vitro- Umgebung eignet sich für die Erforschung der mechanistischen Details der Translokation aus den gleichen Gründen. Darüber hinaus während predictive Software für die Lokalisierung der Chloroplasten Proteine7,8verbessert hat, bieten in-vitro- Transport-Assays einer schnelleren Methode zur Bestätigung über Mikroskopie-basierte fluoreszierenden Proben, die erfordern Sie eine genetisch codierte fluoreszierende Tag, Pflanzentransformation und/oder spezifische Antikörper. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für Chloroplasten und Thylakoidmembran Isolationen von Erbsen (Pisum Sativum), sowie für Transport-Assays für jeden der die ENERGIEABHÄNGIGE Thylakoidmembran Translokation Wege optimiert.

Protocol

1. erste Materialien Ca. 55 g Erbsen für 3 Stunden in 400 mL destilliertem Wasser einweichen und dann säen in einem Plastikbehälter (35 cm x 20 cm x 6 cm) im Boden mit dünnen Schicht von Vermiculit bedeckt. Wachsen Sie das Tablett mit Erbsen bei 20 ° C unter 12/12 h hell/dunkel (50 µE/m2s)-Zyklus für 9 bis 15 Tage. Bereiten Sie Protein Substrat nach eine bevorzugte Methode.Hinweis: Haben wir Protein Substrate mit einer Vielzahl von Methoden, einschließlich 1) in-vi…

Representative Results

Um erfolgreich transportiert Substratmenge einschätzen zu können, ist es sinnvoll, einen oder mehrere “prozentuale Eingabe” Bahnen gehören. Für die unten dargestellten Daten wurde 10 % des endgültigen Transportreaktion ohne Thylakoids verwendet. Diese “prozentuale Eingabe” hilft auch, um die Größe des Substrats Vorläufer zu visualisieren. Der Prozentsatz ist eine bekannte und definierte Menge an Substrat mit denen zu vergleichen, die transportiert Substrat gegen und kann skaliert …

Discussion

Chloroplasten und Thylakoidmembran isolation

Übermäßiger Bruch führt in armen Chloroplasten Isolierung und damit schlechte Thylakoidmembran nach Trennung im Verlauf ergeben. Es empfiehlt sich, die geerntete Gewebe sanft zu homogenisieren, indem sichergestellt wird, dass sämtliches Material eingetaucht ist, vor dem Mischen und pulsieren in 15 s Zyklen bis vollständig homogenisiert. Verwenden Sie ggf. mehrere kürzere Runden mit weniger Gewebe in jeder Runde.

Kühl…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Manuskript wurde mit finanzieller Unterstützung durch die Abteilung von Chemie, Geowissenschaften und Biosciences, 408 Büro der Grundlagenwissenschaften Energie an das US Department of Energy durch Grant DE-SC0017035 vorbereitet

Materials

Pisum sativum seeds Seedway LLC, Hall, NY 8686 – Little Marvel
Miracloth Calbiochem, Gibbstown, NJ 475855-1
80% Acetone Sigma, Saint Louis, MO 67-64-1
Blender with sharpened blades Waring Commercial BB155S
Polytron 10-35 Fischer Sci 13-874-617
Percoll Sigma, Saint Louis, MO GE17-0891-01
Beckman J2-MC with JA 20 rotor Beckman-Coulter 8043-30-1180
Sorvall RC-5B with HB-4 rotor Sorvall 8327-30-1016
100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB Sigma, Saint Louis, MO 12/3/83 Can be frozen in aliquots for future use
200 mM MgATP in 1xIB Sigma, Saint Louis, MO 74804-12-9 Can be frozen in aliquots for future use
Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) Sigma, Saint Louis, MO 9073-78-3 Can be frozen in aliquots for future use
HEPES Sigma, Saint Louis, MO H3375
K-Tricine Sigma, Saint Louis, MO T0377
Sorbitol Sigma, Saint Louis, MO 50-70-4
Magnesium Chloride Sigma, Saint Louis, MO 7791-18-6
Manganese Chloride Sigma, Saint Louis, MO 13446-34-9
EDTA Sigma, Saint Louis, MO 60-00-4
BSA Sigma, Saint Louis, MO 9048-46-8
Tris Sigma, Saint Louis, MO 77-86-1
SDS Sigma, Saint Louis, MO 151-21-3
Glycerol Sigma, Saint Louis, MO 56-81-5
Bromophenol Blue Sigma, Saint Louis, MO 115-39-9
B-Mercaptoethanol Sigma, Saint Louis, MO 60-24-2

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Citer Cet Article
Asher, A., Ganesan, I., Klasek, L., Theg, S. M. Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays. J. Vis. Exp. (139), e58393, doi:10.3791/58393 (2018).

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