Summary
Her beskriver vi en protokoll for immunisering av voksen sebrafisk (Danio rerio) med en DNA-baserte vaksine og demonstrere validering av en vellykket vaksinasjon hendelse. Denne metoden er egnet for prekliniske screening av vaksine kandidater i ulike infeksjon modeller.
Abstract
Interessen for DNA-baserte vaksinasjon har økt i løpet av de siste to tiårene. DNA vaksinasjon er basert på kloning av et valgt antigen eller en kombinasjon av antigener i en plasmider, som gjør en skreddersydd og trygt design. Administrasjon av DNA vaksiner i verten cellene fører til uttrykk for antigener som stimulerer både humoral og celle-mediert immunreaksjoner. Denne rapporten beskriver en protokoll for kloning av antigen sekvenser i pCMV-EGFP plasmider, immunisering av voksen sebrafisk med vaksine kandidater av intramuscular microinjection og den påfølgende electroporation å forbedre inntak. Vaksine antigener uttrykkes som grønne fluorescerende protein (GFP)-fusion proteiner, hvilke innrømmer bekreftelse av antigen uttrykket under UV-lys fra levende fisk og måling av uttrykk blanding protein med ELISA, så vel som gjenkjenningen med en western blot analyse. Beskyttende effekten av vaksine kandidatene er testet av infisere fisken med Mycobacterium marinum fem uker postvaccination, etterfulgt av kvantifisering av bakterier med qPCR fire uker senere. Sammenlignet med pattedyr prekliniske screening modeller, gir denne metoden en kostnadseffektiv metode for foreløpige screening av ny DNA-baserte vaksine kandidater mot en mycobacterial infeksjon. Metoden kan videre brukes til sortering DNA-baserte vaksiner mot ulike bakterielle og virale sykdommer.
Introduction
Den første DNA vaksine studier ble utført i 1990-tallet1, og siden da DNA vaksiner er testet mot ulike smittsomme sykdommer, kreft, autoimmunitet og allergi2. I pattedyr, en DNA vaksine mot West Nile virus hos hester og en terapeutisk kreft vaksine for hjørnetann muntlig melanom er lisensiert, men dette er ikke tiden i klinisk bruk2. I tillegg til interessen fremkalt av pattedyr studier, har DNA vaksinasjon vist seg for å være en praktisk måte å vaksinere oppdrettsfisk mot sykdommer. En vaksine mot fisk smittsomme blodkreft nekrose virus (IHNV) har vært i kommersiell bruk siden 2005, og en vaksine mot smittsomme bukspyttkjertelen nekrose virus (IPNV) ble nylig lisensiert3. I tillegg utvikles flere DNA vaksiner mot fisk patogener.
Som tradisjonelle vaksiner ofte inneholder deaktivert eller live dempes patogener, utgjør de en potensiell risiko for overføring av sykdom2. DNA vaksiner, avverge igjen denne risikoen, fordi de er basert på administrasjon av plasmider koding bakterielle eller virale antigener, i stedet for hele patogen selv2,4. DNA vaksiner er produsert med DNA rekombinasjon teknikker, som tillater presis utformingen av vaksine antigener og fleksible utformingen av antigen kombinasjoner og adjuvans i en enkelt vaksine konstruere5. Videre er produksjon av DNA vaksiner raskere, enklere og mer kostnadseffektivt enn protein-basert rekombinant vaksiner, som er en stor fordel for vaksine kandidat screening formål, men også, for eksempel ved pandemi utbrudd 2.
I fisk, den vanligste administrasjon ruter for DNA vaksiner er intraperitoneal, intramuskulær og muntlig3,6,7, mens i pattedyr, subkutan og intradermal ruter er tilleggsalternativer2. Etter en intramuskulær injeksjon, administrated DNA plasmider inn cellene på administrasjonsområdet (f.eks., hovedsakelig myocytter, men også bosatt antigen presentere celler [APCs]). Andelen av transfekterte celler kan økes betraktelig av electroporation2,8. Etter inn cellen, inn noen plasmider DNA kjernen, hvor genene kodet av plasmider er transkribert2. I denne protokollen benytter vi den pCMV-EGFP plasmider som har en sterk allestedsnærværende promoter optimalisert for eukaryote uttrykk9. I denne konstruksjonen er av antigener oversatt som et fusion protein med et GFP. GFP muliggjør bekreftelse av en vellykket vaksinasjon og riktig antigen produktet ved enkel visualisering av antigen uttrykk med fluorescens mikroskop i levende fisk.
I pattedyr, har DNA vaksiner vist å stimulere typer immunreaksjoner avhengig av den transfekterte celle typer2,5. Transfekterte myocytter skiller antigener i ekstracellulære plass eller slipp dem på celledød og antigener omsluttet av APCs, presenteres deretter på store histocompatibility kompleks II molekyler2. Dette utløser CD4 og CD8 T celle svar, spesielt, i tillegg til B-cellen svar2,5,10. I fisk, har T- og B-lymfocytter, samt dendrittiske celler (DCer), blitt identifisert, men deres arbeidsdeling i antigen presentasjon er mindre godt forstått11. Sebrafisk DCs, har imidlertid vist å dele bevarte fenotypiske og funksjonelle egenskaper med deres pattedyr kolleger12. Videre har DNA vaksinasjon vist seg å framprovosere lignende immunreaksjoner i fisk og pattedyr, inkludert T- og B-celle svar6,13,14,15,16 .
Både larvene og voksen sebrafisk er mye brukt til modell ulike infeksjonssykdommer, som fisk M. marinum infeksjon modell av tuberkulose i denne protokollen17,18,19,20 ,21,22. Med pattedyr modell organismer, fordelene ved sebrafisk inkluderer liten størrelse, rask reproduserbarhet og lav boliger utgifter23. Disse aspektene gjør sebrafisk en ideell dyr modell for store prekliniske screening undersøkelser for romanen vaksiner og farmasøytiske forbindelser23,24,25.
I denne protokollen beskriver vi hvordan romanen vaksine antigen kandidater mot mycobacteriosis kan evalueres av DNA-baserte vaksinasjon av voksen sebrafisk. Først beskrive vi hvordan antigener er klonet i pCMV-EGFP uttrykk plasmider, etterfulgt av en detaljert protokoll for intramuskulær injeksjon av vaksine plasmider og den påfølgende electroporation til muskel. Uttrykk for hver antigen er bekreftet av fluorescens mikroskopi ukes postimmunization. Effekten av antigen kandidatene er testet av eksperimentelt infisere vaksinert fisk med M. marinum.
Protocol
Eksperimenter inkludert voksen sebrafisk krever en tillatelse for dyr eksperimentering for både vaksinasjon og etterfølgende studier med infeksjon modellen. Alle metoder og eksperimenter beskrevet her er godkjent av det dyr eksperiment styret i Finland (ESAVI) og undersøkelsene er utført i samsvar med EUs direktiv 2010/63/EU.
1. kloning av DNA vaksine antigener
- Velg et uttrykk plasmider optimalisert for eukaryote uttrykk for antigen(s) rundt under en sterk, konstituerende promoter, som cytomegalovirus (CMV) umiddelbar tidlig arrangøren. For å aktivere i vivo verifisering av antigen uttrykket, Velg en vaksine plasmider som koder et fluorescerende kode, for eksempel pCMV-EGFP plasmider9 brukes i denne protokollen.
- Bruke riktige web-basert og bioinformatic for å velge en potensielt immun-beskyttende antigen sekvens (eller flere sekvenser) ca 90-600 nt (30-200 aa)26 fra gene(s)-av-interesse av patogen som skal brukes i den etterfølgende infeksjon modell.
- Bruk tilgjengelig programvare, eller manuelt design primere forsterke antigen gener fra patogen genomet og klone antigen sequence(s) på flere-kloning området av uttrykket plasmider. Pass på å bevare leses rammen når du velger antigen.
- Inkluder både en Kozak sekvens (CCACC)27 og en start codon (ATG) i 5' primer. For å bevare C-terminalen EGFP kode, unngå mellomliggende stopp kodon (TAG, TAA, TGA) i antigen sekvensen og 3 primer. Kontroller også at GFP koden forblir i samme lesing rammen med antigen rundt.
- Bruk RNA eller DNA utvunnet fra patogen som en mal for å generere en tilstrekkelig mengde PCR produkt med kloning primerne. Bruk gjerne en korrekturlesing DNA polymerase beholde riktig antigen sekvensen.
- Rense PCR produktet og sjekk riktig størrelse på produktet av gel geleelektroforese. Fordøye og ligate PCR produktet med fordøyd vaksine plasmider.
- Forvandle ligation mix kompetent bakterieceller etter en egnet protokoll. Bruk et passende antibiotikumet utvalg for positiv kolonier og plasmider produksjon i E. coli; pCMV-EGFP-plasmider inneholder for eksempel en ampicillin motstand genet for dette.
- Bruke Sanger sekvensering å bekrefte innsetting av riktig antigen sekvensen. Følgende primerne kan brukes for sekvensering antigener i pCMV-EGFP-plasmider: CMV videresende 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 "og EGFP-N reversere 5' CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3".
- Produsere og rense en tilstrekkelig mengde vaksine Konstruer. Oppløse eller elute plasmider i sterilt vann. Kontroller at produsert plasmider DNA er av høy kvalitet og konsentrasjonen er minst 0,72 µM eller 2000 ng/µL.
2. Dra Microinjection nålene
- Forbered microinjection pinner på forhånd. Bruk 10 cm aluminosilicate glass kapillærer. Merk at Borosilikatglass kapillærene er for sprøtt sprøytebrukere voksne fisk.
- Trekk nålene en brønnene-p-fabrikasjon enhet.
Merk: Nålene ligne en presentert i figur 1. Med enheten brukes i denne protokollen (Tabell for materiale), resultere følgende innstillinger i den ønskede typen nåler:- Angi glasset kapillær i V-groove i baren avtrekker og stram klem knotten lett.
- Flytt holderen ved filament og skyv av kapillær gjennom filament i avtrekker bar på den andre siden av filament. Unngå å berøre filament med av kapillær.
- Stram klem knotter, satt ned av sikkerhetsglass og trykk trekk.
Advarsel: Filament er varmt.
- Sett pinnene på et stykke gjenbrukbare lim innenfor en 15 cm Petriskål platen for å beskytte pinnespissene. Holde parabolen dekket for å holde pinnene ren.
3. fylle brønnene nålene
- Klargjør vaksine blandingen. Bruk 0,5-12 µg av plasmider per dose. Hvis kombinere flere forskjellige plasmider i en vaksinasjon blanding, bruke en maksimal total DNA konsentrasjon av 12 µg per fisk.
- Beregne volumet av vaksinen "master mix" av antall fisk i hver gruppe (se nedenfor). Legge til 1 µl sterilt-filtrert fenol rød hver injeksjon dose å lette både fylling av kapillær nålene og observasjon av injeksjon. Legge til sterilt 1 x PBS opp til en maksimal totalvolum på 5 til 7 µl i ettall innsprøytningen dose8.
Merk: Injeksjon volumer høyere enn 7 µL kan resultere i tilfeldige lekkasje av injeksjon løsningen og bør derfor unngås. - Legg et stykke tape, lim side opp, på en passende holder, for eksempel siden av en tom Verktøytips-boksen. Forsiktig legge kapillær pinnene på båndet.
- Pipetter maksimalt 7 µL av vaksine miksen på et stykke laboratorium film. Bruke en lasting tips, overføre vaksinen fra filmen inn nålen. Pipetter sakte og forsiktig, unngå pipettering luftbobler i nålen.
- La nålene betale for 15-30 min å fjerne mulig resterende små luftbobler.
4. innstilling av Microinjector og Electroporator for immunisering
- Angi micromanipulator og en lyskilde i riktig posisjon. Bytte luften trykk trykk til åpen posisjon.
- Justere parameterne for den pneumatiske pumpe (se figur 2) som følger.
- Angi vent knotten på Løs ut-porten til å holde å hindre oppfylling av pipette kapillær handling. Sette rør fra løs ut-porten til brønnene. Ikke bruk støvsuger havnen i denne protokollen.
- Justere puls lengde: Bruk den tidsbestemte modus, hvor en elektronisk timer styrer hele tiden presset releet forblir åpen. Kontroller at den grønne lampen ved siden av utstøtingstasten trykkmåleren lyser når trykket releet er åpen (energi).
- Angi puls rekkevidde til 10 s; med denne innstillingen på pulser kan ytterligere angis fra 100 ms 10,1 s. Bruk den 10-sving perioden ringe for finjustering hvor puls-hver sving av urskiven er 1.0 s. Hvis nødvendig, kan dette også justeres under en injeksjon.
- Bruke puls initiatoren ("start knappen") på frontpanelet på pneumatiske pumpen, eller en ekstern fotbryter (anbefales). Dette er koblet til frontpanelet på pneumatiske pumpen.
- Angi nålen på brønnene innehaver av micromanipulator. Kutte spissen av nålen med pinsett slik at væske kan skyves, og bruk mikroskopet til å vise riktig posisjon. Trykk på fotbryteren én gang se at en 1-s puls presser en liten dråpe av nålen.
- Bruk følgende innstillinger for electroporator: spenning = 40 V; puls lengde = 50 ms, antall pulser = 6. Koble pinsett til electroporator. Se at den faktiske spenning og puls lengden vist på skjermen ikke avviker betydelig fra innstillingene.
5. injeksjon av DNA vaksinen og Electroporation
- For vaksinasjoner i henhold til denne protokollen, Bruk sunn, 6 til 12 måneder gammel voksen sebrafisk. Holde fisk i et gjennomflytsenhet system med en 14/10 h lys/mørke syklus, med maksimalt sju fisk per 1 L vann.
- Forberede en 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester (tricaine) løsning (pH 7) i tank vann anesthetizing fisk28. Bruk en 10 cm Petriskål eller noe lignende.
- Forberede en utvinning tank ved å fylle en 5 liters kanne med 3 L ren system vann.
- Forberede en vaccination polstring for å holde fisken i en fast stilling under vaksinasjon. Ta et 5 x 7 cm2 stykke 2 til 3 cm-tykke svamp. Skjær en groove i svamp med skalpell blad eller skarp saks.
Merk: Samme vaksinasjon utfylling kan brukes i flere eksperimenter. Desinfisere svampen mellom eksperimenter av soaking det i 70% etylalkohol og la det tørke. - Grundig nyte svamp i systemet vannet og svamp på en Petriskål.
- Rask fisken 24 timer før vaksinasjoner.
- Bedøve en sebrafisk ved å plassere den på en Petriskål inneholder 0.02% tricaine. Vent til fisken ikke reagerer for å berøre stimulering og til det er ingen bevegelse i gjellene. Bedøve en enkelt fisk samtidig.
- Bruker en plast skje, overføre de bedøvet sebrafisk på våt svamp og sette fiskens ventral side ned i sporet. I riktig stilling og sikre at hodet og de fleste av kroppen av fisken er innenfor groove og ryggfinnen og halen er stikker ut fra sporet.
- Under mikroskopet, forsiktig plassere nålen i en ca 45° vinkel nær den sebrafisk rygg muskler, ved hjelp av x - og y - aksen finjustering hjul på micromanipulator.
- Finne den lille flekken uten vekter foran ryggfinnen, hvor skyver nålen ikke krever styrke. Hvis føles motstand, kan du prøve et tilstøtende sted. Unngå skadet ryggen, ryggfinnen eller skalaer.
Merk: Hvis nålen bøyer mens skyve, forkorte nålen litt ved å kutte den. - Bruk av fotbryteren å gradvis injisere vaksine løsningen i muskelen. Observere injeksjon gjennom mikroskop: fenol red er synlig som det går inn i muskelvev. Juster varigheten på pulsen hvis nødvendig.
Merk: Alternativt bruke puls initiatoren knappen på frontpanelet av pneumatiske pumpen for injeksjon. Bruk av en ekstern fotbryteren kan imidlertid bruke den andre hånden for justere puls lengden av 10-sving dial hjulet. Unngå sprøytebruk løsningen for fort, siden dette kan føre til overdreven vevsskade. Pass på ikke å injisere noen luft. - Electroporate fisken umiddelbart etter injeksjon. Kontroller at fisken er fortsatt under narkose. Holde fisk på svamp og angi fisken mellom tweezer-type elektroder, slik at elektrodene er plassert på hver side av injeksjonsstedet. Ikke trykk elektrode pinsett for stramt, men behold begge elektrodene i kontakt med fisken.
- Trykk start-knappen på electroporator å gi seks 40 V, 50 ms pulser.
- Forsiktig overføre fisken å akvariet utvinning.
- Rengjør elektrodene etter hver electroporation ved å dra dem med 70% etanol.
Merk: Nøye overvåke for fisken etter vaksinasjon. Avlive noen fisk viser tegn på ubehag (en langsom bedring bedøvelsen, avvikende svømming, gisper) i 0,04% tricaine. Etter utvinning, overføre fisken til gjennomflytsenhet enheten og mate den normalt.
6. visualisering og bildebehandling Antigen uttrykk
- Bedøve fisken 0.02% tricaine 2-7 dager etter immunisering, og bruke en UV-lys for å se EGFP uttrykk nær injeksjonsstedet.
Merk: Visuell inspeksjon under et UV lys er en lett og ikke-invasive operasjon som passer for rutinemessig verifisering av vellykket vaccinations, også i store eksperimenter. Hvis ingen bilder av fisken er nødvendig, kan også dette trinnet utføres i vanlig fisken tank uten behovet å bedøve eller flytte fisken. - For å ta bilder, bruke fluorescens mikroskop for å visualisere EGFP uttrykk injeksjon området8. Bruk en 2 X linsen og velg riktig filteret å visualisere fluorescens eller synlig lys visninger.
- Holde bedøvet fisk fortsatt ved å trykke ventrale fin forsiktig med pinsett mot en Petriskål bunn. Ta både lys-mikroskopet og fluorescens bilder av samme område.
- Flette lys-mikroskopet og fluorescens bildene ved hjelp av riktig programvare29. Legge til en skala bar.
7. kvantifisering av uttrykket nivå og størrelsen på antigener
- Euthanize fisken 0,04% tricaine. Dissekere den fluorescerende delen av rygg muskelen skalpell og pinsett under UV-lys. Ekstra proteiner fra prøver8.
- Kontrollere riktig størrelse på i vivo-produsert proteiner med en western blot analyse, med en pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert GFP antistoff (eller lignende)8. Inkludere en negativ kontroll (unimmunized fisk) Hvis du vil utelate noen bakgrunn signaler og uspesifikke bindende, sammen med en kontroll uttrykke EGFP uten en smeltet antigen.
Merk: For western blot analyse, den forventede størrelsen (i kDa) av antigen-fusion proteinene kan beregnes, for eksempel med ligning:
Molekylvekt (MW) av dsDNA (antall nukleotider x 607.4) + 157.9; eller ved å bruke webbaserte verktøy. - Kvantifisere uttrykk for hver antigen ved hjelp av GFP-ELISA8 (valgfritt).
8. kombinere Vaccination protokollen med en M. marinum infeksjon modell
- Angi gruppen kreves for pålitelige fastsettelse av effektiviteten av en ny vaksine kandidat i infeksjon modellen og analysen brukes (se, for eksempel Myllymaki et al. 24 og Charan og Kantharia30). Utføre aktuelle beregningene selv planlegger eksperimenter.
- For å evaluere effektiviteten av vaksine kandidater, infisere fisk 5 uker postimmunization. Bruk en intraperitoneal infeksjon med ca 30 colony-forming enheter (cfu) av M. marinum, noe som fører til en latent infeksjon i de fleste fisk8,20,31.
Merk: Når du bruker M. marinum, Følg en BSL2 sikkerhet protokollen. Utarbeidelse av bakterien eller virus, avhenger av patogen. - Kvantifisere antall patogener i hver fisk. Euthanize fisk 4 uker postinfection og bestemme bakterielle belastningen i hver fisk fra utdraget DNA med qPCR bruker primere bestemt M. marinum20,24.
Merk: Sørg for å inkludere en passende kontrollgruppe og bruke riktig statistiske metoder for å analysere resultatene. Vanligvis er en gruppe Fisken vaksineres med Tom pCMV-EGFP-plasmider en passende negativ kontroll. - Bekrefte positive resultater med antigener uten GFP koden. Klone antigener som beskrevet i trinn 1 og gjenta eksperimentet vaksinasjon.
Representative Results
Trinnene involvert i DNA vaccination protokollen for voksen sebrafisk er illustrert i Figur 3. Først, den valgte antigen sekvenser er klonet i en pCMV-EGFP plasmider og plasmider DNA er produsert og renset24 (Figur 3). Vaksine kandidater er deretter Injisert intramuskulært med en microinjector og injeksjonsstedet er electroporated å forbedre inntak av plasmider i celler (Figur 3). Brukte vaksinasjon dosen ble optimalisert av sprøytebruk ulike mengder av pCMV-EGFP-plasmider og måler GFP uttrykket med ELISA (utfyllende figur 1). To til sju dager postvaccination, uttrykk for fusion protein oppdages under UV-lys og visualisert med fluorescens mikroskopi (Figur 3 og Figur 4). Uttrykket nivåer av ulike antigener kan variere fra svært intensiv (antigen 1) til en svak uttrykk (Figur 4). I tillegg GFP uttrykk kan observeres over rygg muskelen (antigen 1) eller i et mer begrenset område (antigen 2) (Figur 4). Men hvis ingen fluorescens oppdages innen 10 dager, anbefales det å sørge for at det ikke er noen feil i antigen kloning eller primer design. For å bekrefte at uttrykt fusion protein er riktig størrelse, kan proteiner utvunnet fra muskelvev rundt injeksjonsstedet og brukes for en western blot analyse.
Effekten av vaksine kandidater vurderes ved utfordrende fisken med en lav dose av M. marinum ved en intraperitoneal injeksjon (figur 5). Fire til fem uker postinfection, bakteriell teller er bestemt med qPCR og forhold til bakteriell laster i kontrollgruppen (figur 5). Videre effektiviteten av de mest lovende vaksine kandidatene kan testes ved å overvåke overlevelse etter en høy dose M. marinum infeksjon()figur 5). Men i tillegg gir en kvantitativ resultat på utviklingen av infeksjon, i stedet for bare statusen i live eller død, qPCR-baserte cfu kvantifiseringen krever mindre tid og mindre gruppe størrelser og er derfor en mer etisk tilnærming til en primær skjermen. Samlet forenkler denne protokollen screening av effektiviteten av romanen vaksine antigener i 12 uker (figur 5).
Figur 1: Nærbilde (12 X) aluminosilicate nåler i voksen sebrafisk intra muskel injeksjoner. Tipset nedenfor har blitt kuttet med pinsett og er klar til å brukes for microinjections. Dette tallet er tilpasset Oksanen35. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Microinjection utstyr og oppsett. Hovedkomponentene i utstyret som trengs for DNA vaksinasjon av voksen sebrafisk utheves med fet skrift. Kritisk justeringene er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: forberede DNA vaksine plasmider og immunisering prosedyren. (1) valgt antigener er klonet ved GFP koden i pCMV-EGFP-plasmider. (2) vaksine konstruksjon er produsert microbiologically, konsentrert og renset. (3) 12 µg av plasmider injiseres i rygg muskler av en bedøvet voksen sebrafisk med en microinjector, og injeksjonsstedet er senere electroporated med seks 40-V, 50-ms pulser. (4) to til sju dager postvaccination, det GFP uttrykket av antigen-GFP fusion protein er visualisert med fluorescens mikroskop. (5) den selvlysende fargen del av det dorsal muskelen kan deles opp og brukt for protein utvinning. Størrelsen på fusion protein bekreftes med en western blot analyse og hvilket uttrykk med GFP-ELISA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: visualisere uttrykk for antigen-EGFP fusion protein. Injeksjonsstedet er electroporated, deretter med seks 40 V, 50 ms pulser bedøvet voksen sebrafisk er vaksinert med 12 µg av eksperimentelle vaksinen antigener (antigen 1-3). To til sju dager postvaccination, injeksjonsstedet er avbildet med et mikroskop. Først oppdages uttrykket av GFP under mikroskop fluorescens. Området er kontrollert ved hjelp av et 2 X omfanget mål og fotografert og lagret i TIFF-skjemaet. Lys mikroskop bildet av det samme området flettes med fluorescens bildet med ImageJ programvaren. Antallet og plasseringen av antigen uttrykket kan variere mellom antigener og fisk. For eksempel uttrykket av antigen 1 er observert over rygg muskelen og uttrykket av antigen 2 vises som små flekker, mens antigen 3 er sterkt uttrykt i en mer begrenset område. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Testing effektiviteten av vaksine kandidater mot en mycobacterial infeksjon. (1) voksen sebrafisk er vaksinert med eksperimentelle DNA vaksiner mot mycobacteriosis. (2) fem uker postvaccination, fisken er infisert med en lav dose av Mycobacterium marinum (~ 30 cfu). (3) fire uker senere, den interne organer er dissekert og brukes for DNA utvinning. (4) bakteriell greven i hver fisk er kvantifisert med qPCR bruker M. marinum-spesifikke primere. Immunisering med antigen 1 førte til en betydelig reduksjon i bakteriell teller (p < 0,01, toveis VARIANSANALYSE), mens antigener 2 og 3 hadde ingen effekt. (5) beskyttende effekten av mest lovende vaksine kandidaten (antigen 1) ytterligere evalueres i en overlevelse eksperimentet, hvor fisken er infisert med en høy dose (~ 10.000 cfu) bakterier og deres overlevelse overvåkes i 12 uker. Konsekvent med nedgangen i bakterielle belastningen observert i panelet 4, vaksinering med antigen 1 også forbedret overlevelse av fisken på en M. marinum infeksjon (p < 0,01), tyder denne antigen kan være en lovende kandidat for en ny vaksine mot tuberkulose. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: mengden plasmider DNA påvirker plasmider-avledet EGFP uttrykk i voksen sebrafisk. Grupper av fisk (n = 5 i hver gruppe) ble injisert med 0,5-20 μg av pCMV-EGFP, og electroporation (seks pulser 50 V) ble brukt til å forbedre transfection. Kontroll fisk (CTRL) ble injisert med 2 μg av Tom pCMV plasmider ikke inneholder EGFP genet. GFP-ELISA var utført 3 dager postinjection å definere relativ EGFP uttrykket i fisk homogenates. P-verdier: *p < 0,03, **p < 0.004. Feilfeltene-representerer standardavvik. NS = ikke betydelig. Dette tallet er tilpasset Oksanen35. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Prosedyren for immunisere voksen sebrafisk med DNA-baserte vaksiner krever noen teknisk ekspertise. Selv for en erfaren forsker tar vaccinating en enkelt fisk ca 3 min, unntatt forberedelser. Dermed kan maksimalt omtrent 100 fisk immunized innen en dag. Hvis mer enn 100 fisk er nødvendig for eksperimentet, kan immunizations deles mellom opp til 3 dager. Kvaliteten på eksperimentet er tilstrekkelig opplæring av researcher(s) for håndtering av fisken og utføre immunisering avgjørende for trivsel for fisken. Sørg for å følge lokale juridiske og dyr velferd regler og retningslinjer når det gjelder boliger fisken, eksperimenter, og kvalifikasjoner som kreves av personellet gjennomføre eksperimenter.
I sammendraget finnes det flere viktige tiltak for å unngå komplikasjoner i immunisering protokollen. For vellykket immunisering, sikre at 1) fisken immunized er friske og tilstrekkelig alder og størrelse (immunisering mer juvenile fisk kan kreve ned skalering vaksine volumet og electroporation innstillingene); 2) fisken er riktig anesthetized uten sterkere enn 0.02% 3-aminobenzoic acid ethyl ester, og de forblir bedøvet gjennom hele prosedyren (anestesi bør holdes så kort som mulig slik utvinning av fisken); 3) svamp puten er skikkelig gjennomvåt; 4) væske injiseres i hver puls fra pneumatiske pumpen, og hvis ikke, puls lengden justeres (trekke nålen litt bakover langs y-aksen kan hjelpe); 5) det er ingen luftbobler med vaksine løsningen; 6) electroporation innstillingene og faktiske puls spenning og lengden er riktig. 7) elektrodene ikke forårsaker skade huden på webområdet electroporation (under electroporation, holde elektrodene i mild kontakt med fisken, og slippe fisken umiddelbart i utvinning tanken etter electroporation).
Det er viktig å overvåke fisken etter electroporation i utvinning tanken og å avlive noen fisk viser tegn på ubehag. Videre er det nødvendig å praktisere fremgangsmåten før du starter en storskala forsøk, for å sikre en flytende arbeidsflyt. Hvis mulig, spør en tilstrekkelig opplært kollega for hjelp med å fylle nålene og electroporation.
DNA vaksinasjon metoden gjør det mulig for skreddersydd design av vaksine antigener. Det er mulig å klone hele antigen eller, helst, velge deler av antigen basert på mobilnettet lokalisering og immunogenisitet24. I tillegg kan metoden kombinere flere antigener eller adjuvans i én vaksine konstruksjon eller sprøytebruk flere separate plasmider på samme tid2. Inkludert en stopp codon etter antigen rekkefølgen eller excising EGFP genet fra plasmider, er det mulig å benytte samme plasmider vektoren også for å uttrykke antigen uten etterfølgende N-terminal GFP koden. Dette kan være rimelig i bekrefter positive screening resultatene, den relativt store størrelsen på GFP kan påvirke folding av antigen, og dermed begrense humoral svar potensielt fremkalt av vaksinasjon.
Et høyere antigen uttrykk har vært knyttet til DNA vaksine immunogenisitet2. Electroporation etter injeksjon har dermed blitt inkludert i denne protokollen, som det har vist seg å øke uttrykk for antigener eller reporter gener fra firedelte til tidoblet i sebrafisk32. Videre forårsaker electroporation som en teknikk moderat vev skade, dermed indusere lokal betennelse som ytterligere fremmer vaksine-indusert immunreaksjoner2. På den annen side, er electroporation generelt godt tolerert. Med utstyret som brukes her, vil nesten 100% av voksen sebrafisk gjenopprette godt fra på seks pulser av 40 V brukes i denne protokollen35.
I tillegg til electroporation for å styrke oppføringen av vaksine plasmider inn i celler, bruker vi en sterk allestedsnærværende promoter vaksine plasmider og en polyA hale på 3 slutten av antigen for å forbedre antigen uttrykk i transfekterte fisk cellene. I noen tilfeller hvis codon bruken av målet patogen betydelig forskjellig fra vaksinert arter, har codon optimalisering funnet nyttig i økende ytterligere mål gene expression2. I denne sebrafisk -M. marinum modellen, men codon optimalisering hadde ingen signifikant effekt på uttrykk nivåene av to mycobacterial modell gener ESAT-6 og CFP-10, og har dermed blitt ansett unødvendig i denne modellen35 .
Målet genet uttrykket profiler har noen timelige variasjon mellom antigener, avhengig av, for eksempel størrelsen og strukturen i antigener i spørsmålet. Antigen uttrykk er imidlertid vanligvis lignende i en gruppe av fisken vaksineres med samme vaksine. Vanligvis lyse EGFP uttrykket er observert fire dager til ukes postvaccination, men en skala fra 2-10 dager er mulig. Det anbefales å validere uttrykket hver antigen-EGFP fusion protein i en liten gruppe av fisk (2-3) før du inkluderer antigen i en storskala forsøk. Hvis ingen GFP uttrykk er observert på noe punkt 2-10 dager etter immunisering, kontrollerer du at 1) immunisering protokollen ble nøye fulgt. Alltid har en gruppe av fisken vaksineres med Tom pCMV-EGFP-plasmider som en positiv og kontroller at 2) antigen design og molekylære kloning ble utført riktig (tilstrekkelig primer design, antigen og EGFP koden er begge i samme lese ramme og ingen mellomliggende stopp kodon er inkludert). I noen tilfeller tross riktig antigen design, kan GFP ikke oppdages. Dette kan skyldes feil folding eller rask sammenbrudd av fusion protein. Under disse omstendigheter kan det være nødvendig å omstrukturere antigen.
I vaksiner som brukes Immunize oppdrettsfisk, er plasmider dosen brukes vanligvis 1 µg eller mindre7,33,34. I sebrafisk, kan reporter genuttrykk også gjenkjennes etter minst 0,5 µg plasmider injeksjon etter electroporation; genuttrykk relative mål øker imidlertid betydelig med et høyere beløp av plasmider per fisk (supplerende figur 1). I fisk injisert med pCMV-EGFP reporter plasmider, resulterte en injeksjon med 5-20 µg av plasmider i fire til åtte ganger høyere EGFP nivåer med fisk injisert med 0,5 µg. Derfor, for å sikre en høy nok mål genuttrykk, men har injeksjon volumer som er små nok (≤7 µL) å forhindre overflødig vevsskade eller vaksine lekkasje, valgte vi å bruke 5 til 12 µg per fisk for å foreløpig screening. I tillegg til vaksine immunogenisitet, en høy nok mål genuttrykk er nødvendig for å oppdage reporter genuttrykk fluorescens mikroskop og western blot, som er nødvendig for screening formål å bekrefte riktig i vivo oversettelse av målet antigen. Imidlertid lavere plasmider doser (0,5-1 µg) kan være nyttig for andre typer eksperimentelle bruker.
Avslutningsvis kan denne protokollen for immunisering av voksen sebrafisk med en DNA plasmider brukes i preklinisk testing av romanen vaksine kandidater mot ulike bakterielle eller virale infeksjoner. Uttrykket av vaksine antigen som en GFP-fusion protein kan effekten av et vellykket immunisering hendelse og antigen uttrykk. Vi bruker denne metoden for prekliniske screening av romanen vaksine antigen kandidater mot tuberkulose. For dette vi infisere sebrafisk fem uker postvaccination og bestemme bakterielle teller i hver fisk med qPCR20,24.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlig til medlemmer av eksperimentelle immunologi research group, og spesielt til Leena Mäkinen og Hannaleena Piippo, for alt arbeidet de har gjort i å utvikle og optimalisere vaksinasjon protokoll, og deres hjelp i faktiske eksperimenter ved hjelp av protokollen.
Dette arbeidet ble støttet av Jane ja Wen Erkon Säätiö (Jane og Wen Erkko Foundation; til Mr), Sigrid Juséliuksen Säätiö (Sigrid Juselius Foundation; Mr), konkurransedyktig staten forskning finansiering av ekspert ansvar Tampere University Hospital (til Mr), Tampereen Tuberkuloosisäätiö (Tampere tuberkulose Foundation; Mr, HM, og M.N.), Suomen Kulttuurirahasto (finsk Kulturstiftelse; H.M.), Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (finsk Anti-tuberkulose Foundation; til H.M.), kom ja Laina Kiven säätiö (kom og Laina Kivi Foundation; til M.N.) og Tampere City Science Foundation (til M.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCMV-GFP plasmid | Addgene | #11153 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475-2L | DNA extraction |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166-5G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.2500 | DNA extraction |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| FastPrep-24 5G | MP Biomedicals | 116005500 | homogenizer |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Pulling of needles |
| GeneJet PCR Purification kit | ThermoFischer Scientific | K0701 | |
| GFP ELISA kit | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Guanidine thiocyanate (FW 118.2) | Sigma-Aldrich | G9277-500G | DNA extraction |
| ImageJ2 | imagej.net/Downloads | freely available software | |
| LB Agar | Sigma | L2897-1kg | |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1kg | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Nikon | AZ100 | fluorescense microscope |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| Nightsea Full adapter system w/Royal Blue Color light head | Electron Microscopy Sciences | SFA-RB | |
| PBS tablets | VWR Chemicals | E404-200TABL. | |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| PV830 Phneumatic Pico Pump | WPI | SYS-PV830 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi kit | Qiagen | ID:12163 | plasmid extraction |
| Sodium citrate (FW294.1) | VWR Chemicals | 27833.294 | DNA extraction |
| Tri Reagent | Molecular Research Center, Inc. | TR 118 | DNA extraction |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tris (free base) (FW121.14) | VWR Life Science | 0497-500G | DNA extraction |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| 2.8 mm Ceramic beads | Omni International | 19-646-3 | DNA extraction |
| 2 mL Tough tubes with caps | Omni International | 19-649 | DNA extraction |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Microloader 20 µL | eppendorf | 5242956.003 | loading tips |
| Petri dishes, 16 mm | Sarsted | 82.1473 | |
| Scalpels | Swan Morton | 0501 | |
| Parafilm | Bemis | laboratory film | |
| Pins | |||
| Plastic spoon | |||
| Spatula | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench | |||
| Tweezers |
References
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356 (6365), 152-154 (1992).
- Tregoning, J. S., Kinnear, E. Using Plasmids as DNA Vaccines for Infectious Diseases. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Evensen, O., Leong, J. A. DNA vaccines against viral diseases of farmed fish. Fish Shellfish Immunology. 35 (6), 1751-1758 (2013).
- Sommerset, I., Lorenzen, E., Lorenzen, N., Bleie, H., Nerland, A. H. A DNA vaccine directed against a rainbow trout rhabdovirus induces early protection against a nodavirus challenge in turbot. Vaccine. 21 (32), 4661-4667 (2003).
- Li, L., Petrovsky, N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Review of Vaccines. 15 (3), 313-329 (2016).
- Embregts, C. W. E., et al. Intramuscular DNA Vaccination of Juvenile Carp against Spring Viremia of Carp Virus Induces Full Protection and Establishes a Virus-Specific B and T Cell Response. Frontiers in Immunology. 8, 1340 (2017).
- Lorenzen, N., LaPatra, S. E. DNA vaccines for aquacultured fish. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 24 (1), 201-213 (2005).
- Oksanen, K. E., et al. An adult zebrafish model for preclinical tuberculosis vaccine development. Vaccine. 31 (45), 5202-5209 (2013).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), (2004).
- Cho, J. H., Youn, J. W., Sung, Y. C. Cross-priming as a predominant mechanism for inducing CD8(+) T cell responses in gene gun DNA immunization. The Journal of Immunology. 167 (10), 5549-5557 (2001).
- Lewis, K. L., Del Cid, N., Traver, D. Perspectives on antigen presenting cells in zebrafish. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 63-73 (2014).
- Shao, T., et al. Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells. Developmental & Comparative Immunology. 49 (1), 38-43 (2015).
- Utke, K., et al. Cell-mediated immune responses in rainbow trout after DNA immunization against the viral hemorrhagic septicemia virus. Developmental & Comparative Immunology. 32 (3), 239-252 (2008).
- Cuesta, A., et al. An active DNA vaccine against infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) with a different mode of action than fish rhabdovirus DNA vaccines. Vaccine. 28 (19), 3291-3300 (2010).
- Castro, R., et al. DNA vaccination against a fish rhabdovirus promotes an early chemokine-related recruitment of B cells to the muscle. Vaccine. 32 (10), (2014).
- Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Experimental Hematology. 42 (8), 697-706 (2014).
- Patterson, H., et al. Adult zebrafish model of bacterial meningitis in Streptococcus agalactiae infection. Developmental & Comparative Immunology. 38 (3), 447-455 (2012).
- Cronan, M. R., Tobin, D. M. Fit for consumption: zebrafish as a model for tuberculosis. Disease Model & Mechanisms. 7 (7), 777-784 (2014).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Parikka, M., et al. Mycobacterium marinum causes a latent infection that can be reactivated by gamma irradiation in adult zebrafish. PLoS Pathogens. 8 (9), e1002944 (2012).
- Rounioja, S., et al. Defense of zebrafish embryos against Streptococcus pneumoniae infection is dependent on the phagocytic activity of leukocytes. Developmental & Comparative Immunology. 36 (2), 342-348 (2012).
- Myllymaki, H., Bauerlein, C. A., Ramet, M. The Zebrafish Breathes New Life into the Study of Tuberculosis. Frontiers in Immunology. 7, 196 (2016).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Ramet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Myllymaki, H., et al. Identification of novel antigen candidates for a tuberculosis vaccine in the adult zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 12 (7), e0181942 (2017).
- Myllymaki, H., Niskanen, M., Luukinen, H., Parikka, M., Ramet, M. Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish. Disease Model & Mechanisms. 11 (3), (2018).
- Ingolotti, M., Kawalekar, O., Shedlock, D. J., Muthumani, K., Weiner, D. B. DNA vaccines for targeting bacterial infections. Expert Review of Vaccines. 9 (7), 747-763 (2010).
- Kozak, M. Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. The EMBO Journal. 16 (9), 2482-2492 (1997).
- Matthews, M., Varga, Z. M.
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Hammaren, M. M., et al. Adequate Th2-type response associates with restricted bacterial growth in latent mycobacterial infection of zebrafish. PLoS Pathogens. 10 (6), e1004190 (2014).
- Rao, N. M., Rambabu, K. M., Rao, S. H.
- McCaffrey, J., Donnelly, R. F., McCarthy, H. O. Microneedles: an innovative platform for gene delivery. Drug Delivery and Translational Research. 5 (4), 424-437 (2015).
- Lorenzen, E., Lorenzen, N., Einer-Jensen, K., Brudeseth, B., Evensen, O. Time course study of in situ expression of antigens following DNA-vaccination against VHS in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) fry. Fish and Shellfish Immunology. 19 (1), 27-41 (2005).
- Oksanen, K. Adult Zebrafish Model for Studying DNA-based Vaccination against Mycobacterial Disease. Tampereen yliopisto. , Tampere, Finland. (2011).
