Summary
Este protocolo proporciona un enfoque eficiente para medir la absorción de colesterol LDL con tasas de flujo en tiempo real usando un sistema en diversos tipos celulares de imagen vivo de la célula. Esta técnica proporciona una plataforma para la actividad farmacológica de compuestos que afectan flujo de LDL mientras para morfología de la célula y por lo tanto potencial citotoxicidad de la pantalla.
Abstract
La regulación de la absorción de colesterol LDL a través de endocitosis mediada por el LDLR es un área importante de estudio en diversas patologías principales incluyendo desorden metabólico, enfermedad cardiovascular y enfermedad renal. Actualmente, no hay ningún método disponible para evaluar la captación de LDL mientras simultáneamente para la salud de las células. El presente estudio presenta un protocolo, utilizando un sistema de análisis imágenes de células vivas, para adquirir las medidas seriales de la afluencia de LDL con monitoreo concurrente para la salud celular. Esta novedosa técnica se prueba en tres líneas celulares humanas (células endoteliales hepáticas, renal tubular epitelial y coronario de la arteria) sobre un curso de cuatro horas. Por otra parte, la sensibilidad de esta técnica es validada con conocidos inhibidores de captación de la LDL, Dynasore y recombinante proteína PCSK9, así como por un promotor de la absorción de LDL, simvastatina. Tomados en conjunto, este método proporciona una plataforma de mediano a alto rendimiento para detección simultáneamente actividad farmacológica así como monitoreo de morfología de la célula, por lo tanto la citotoxicidad de los compuestos que regulan el flujo de LDL. El análisis se puede utilizar con diferentes sistemas de proyección de imagen y software de análisis.
Introduction
La endocitosis de LDL mediada por la baja densidad de la lipoproteína del Receptor LDLR es un área importante de estudio ya que los niveles circulantes de colesterol LDL son la base de las enfermedades cardiovasculares1, riñón enfermedad2 así como una variedad de inflamatoria trastornos genéticos con mutaciones en el colesterol y enfermedades3 transportan genes4,5,6,7. Estudios en afluencia de colesterol mediada por LDLR han llevado a la identificación de múltiples herramientas de investigación, como los inhibidores de la dinamina la química Dynasore8,9,10, así como regulación de LDL proteínas como cualquiera convertasa Subtilisin/Kexin tipo 9 (PCSK9)11,12.
La vía de endocitosis de LDL LDLR comienza con el complejo LDL-LDLR en la superficie celular en fosas recubiertas de clatrina13el secuestro. Las vesículas se forman por invaginación de la membrana de superficie celular internalizar el complejo LDL-LDLR en vacuolas para el transporte dentro de la célula. Como la vesícula formada se madura en endosomas temprano y entonces último, el pH cae dentro del endosome finales, causando la disociación del LDL de su receptor14. En el pasado, los métodos de cuantificación de flujo de LDL dependen de incubación conjunta de etiqueta radio 125-LDL con células y posterior extracción de la proteína marcada con radio de las células para la cuantificación de15. Esto entonces fue substituida por el uso de fluorescencia con proteínas LDL como DiI-LDL y el immunostaining posterior o extracción de la proteína fluorescente lecturas utilizando un espectrofotómetro o placa lector15,16. Fluorescencia con LDL ha también utilizado en celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación para el análisis de la internalización de LDL y de la célula superficie LDL enlace17. Mientras que estos métodos permiten recopilación de datos después del tratamiento, supervisar la viabilidad de las células durante el tratamiento no es posible.
El pH ácido en el último endosome permite el uso de una sonda fluorescente activado por pH de LDL como pHrodo LDL rojo que aparece después de internalización18,19. Esta propiedad permite un curso de tiempo continuo de la evaluación de la absorción de LDL en células vivas. Por lo tanto, este protocolo utiliza la proyección de imagen de fluorescencia pHrodo rojo-LDL en un análisis de células vivas en serie medida LDL absorción con monitoreo concurrente para la salud celular. Los resultados indican la fiabilidad de esta técnica novedosa, probado durante un tiempo de cuatro horas en tres líneas diferentes de células humanas, las células del carcinoma hepático humano (HepG2), humano renal (HK2) las células epiteliales y células endoteliales arteriales coronarias humanas (HCAEC ). Estas líneas celulares son clínicamente significativas a LDL separación20,21,22,23,24,25,26,27 , riñón enfermedad28,29,30,31y32,de enfermedades del corazón33, respectivamente. Además de controlar el flujo de LDL, este protocolo incorpora tratamiento con dos inhibidores de la absorción de LDL conocidos, Dynasore hidrato y proteína recombinante PCSK9 así como un inductor de la estatina de LDLR expresión y captación de la LDL, simvastatina. Dynasore y recombinante PCSK9 cada trabajo a través de diferentes vías para reducir la absorción de LDL.
Dynasore es un inhibidor de molécula pequeña de Dynamins10 y reduce la absorción de LDL mediante el bloqueo de endocytosis clathrin-dependiente de LDL LDLR complejo10,34. PCSK9 recombinante, por otra parte, es miembro de peptidasa familia S8 que se une a LDLR e inhibe su reciclaje a la superficie de la célula después de soltar el LDL del complejo internalizado mediante el bloqueo de cambios conformacionales necesarios35,36 . Densidad superficial de LDLR disminución celular finalmente lleva a la reducida captación de LDL por la célula. Las estatinas, mientras bloquea directamente la enzima reductasa de 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima (HMG-CoA) y así la biosíntesis de colesterol, también son conocidas que regular al alza la expresión de LDLR25,38 hacia la mayor captación de LDL. La sensibilidad de este protocolo es validada mediante la detección de reducciones significativas en el flujo de LDL en líneas celulares humanas clínicamente relevantes tres, HK2, HepG2 y HCAECs, por Dynasore o recombinante PCSK9 y un marcado aumento en la absorción de LDL en las células HepG2 por Simvastatina en un curso de cuatro horas con monitoreo de morfología de la célula o para la salud. Tomados en conjunto, este método proporciona una plataforma de mediano a alto rendimiento para la detección al mismo tiempo la actividad farmacológica y la citotoxicidad de los compuestos de regulación de la absorción de LDL en las células vivas.
Protocol
1. siembra de células en una placa de 24 pocillos
- Aspirar los medios de comunicación de las células, lavan las células con 5 mL de fosfato tampón salino de Dubelco (dPBS) y aspirar la dPBS. Para las células HepG2 en un plato de 100 mm, usar 1.5 mL 0.25% tripsina/EDTA, y para HK2 células o HCAECs 1,5 mL de solución de tripsina/EDTA 0.05% para separar las células.
- Incube la placa en una incubadora de 37 ° C durante 4 minutos o hasta que las células son separadas. Neutralizar la tripsina después de una incubación de 4 minutos añadiendo 3 mL de medio completo para HepG2 y HK2 o 3 mL de tripsina neutralizando la solución, dPBS plus 5% suero bovino fetal (FBS), para las células HCAEC.
- Las células de transferencia en tubos cónicos de 15 mL y centrifugar a 250 x g durante 5 min aspirar los medios de comunicación y Resuspenda el precipitado de células en medios completo.
- Filtrar la suspensión de células suavemente a través de un colador de malla de 40 μm para dispersar los grumos de células. No lave las células a través de la coladera.
- Contar las células y la placa a una densidad optimizada. Por ejemplo, 5.000 células por pocillo de células HepG2 o 10.000 células por pocillo de células HK2 o HCAECs en una placa de 24 pozos conducen a resultados óptimos.
- Incube la placa durante la noche a 37 ° C para permitir que las células a conectar.
- Al día siguiente, cambiar el medio de la célula a la base de los medios de comunicación para la línea de celular (sin equipos) más el 5% suero deficiente Lipo-proteína (LPDS) o baja (2%) Los medios de comunicación FBS dependiendo del tratamiento (ver 1.7). Continuar la incubación durante 24 h a morir de hambre las células. Use 500 μL de medio total por pozo de una placa de 24 pozos.
- Tratamiento de las células en una de tres formas: agregar 10 μg/mL de rPCSK9 (o vehículo) y devolver las células a la incubadora de 37 ° C durante 1 hora, añadir 40 μm de hidrato de Dynasore (o vehículo, sulfóxido de dimetilo) y volver a las células a la incubadora de 37 ° C durante 10 minutos , o agregar simvastatina 1 μm (o vehículo, sulfóxido de dimetilo) y volver a las células a la incubadora de 37 ° C por 12, 18 o 24 horas. Utilizar los medios de comunicación con el 5% LPDS para tratamientos Dynasore o rPCSK9. Uso bajo (2%) Equipos medios o medios con 5% simvastatina LPDS tratamientos.
Nota: Tratar las células con compuestos deseados, se puede hacer en el momento del cambio de los medios de comunicación para el hambre de la lipoproteína (criterio 1.6) para experimentos a largo plazo, o antes de los análisis para experimentos a corto plazo. Alternativamente, tiempos de tratamiento modificado para requisitos particulares pueden ser elegidos según el tipo y el propósito de los experimentos. - A continuación, añadir 5 μl de pHrodo LDL marcada con rojo (stock de 1 mg/mL) a cada pocillo para obtener una concentración final de 10 μg/mL. Entonces, retire cuidadosamente las burbujas de los pozos.
2. Análisis de la célula en vivo
- Inmediatamente después de agregar el LDL etiquetado, coloque la placa en la incubadora de sistema de análisis de células vivas (véase Tabla de materiales) y deje que la plancha se equilibren durante 15 minutos reducir la condensación en la placa.
- Mientras tanto, el software abierto y programar la exploración añadiendo el recipiente que contiene la placa. Imagen de 16 imágenes por pozo a intervalos de 1 hora en 10 X para 4 horas usando los canales rojo y fase.
- Crear un mapa de placa a utilizar para el procesamiento de datos.
- Haga clic en la ficha de propiedades Seleccione el mapa de la placa. Entrada del tipo de células y tratamientos en ficha de compuestos .
- Haga clic en la ficha de regiones , seleccione cada conjunto de réplicas y guarde como regiones.
3. configurar los parámetros de análisis
- Una vez finalizada una carrera experimental, crear un conjunto de imágenes en el software para entrenar el equipo para cuantificar cada parámetro incluido en el conjunto de cuenta.
- En el software, abra la placa y, a continuación, en el cuadro de Análisis de trabajo utilidades seleccione crear o añadir a la colección de imágenes.
- Seleccione Nueva colección de imágenes, escriba un nombre para la colección de imágenes y elegir los canales rojo y fase marcando las casillas junto a los canales.
- Seleccione 5 más imágenes y añadir a la colección de imágenes mediante la adición a la colección actual de la imagen.
- Crear una definición de procesamiento de las células. La tabla 1 incluye los parámetros para el celular HepG2, HK2 y HCAE procesamiento de definiciones de este protocolo de flujo de LDL.
- En el cuadro de Análisis de trabajo utilidades , elegir Nueva definición de proceso. Elegir la colección de imágenes denominado en el paso 2.1.2 desde el menú desplegable. Entrada de los parámetros para el tipo de células a partir de la tabla 1.
- En el cuadro de vista previa, utilice el menú desplegable para seleccionar Escuchar todos.
- En el cuadro Máscara de análisis , comprobar la Máscara de la confluencia y las cajas Objeto máscara de Red para ver la zona incluida en el análisis para la definición de proceso. Vea la figura 1.
- Desplácese por la colección de imágenes para que las células y el LDL están incluidos en la máscara. Seleccione el archivo y Guardar la definición de procesamiento.
- Analizar el conjunto de imágenes de la carrera experimental.
- Abra el experimento en la vista de la placa. En el cuadro de Análisis de trabajo utilidades , elegir Iniciar nuevo análisis puesto de trabajo. Seleccione la definición de procesamiento guardados.
- Nombre el trabajo de análisis, seleccione el intervalo de tiempo para el análisis y destacar los pozos experimentales para analizar. Haga clic en el botón iniciar .
4. Análisis y procesamiento de datos
- Una vez finalizado el trabajo de análisis, exportar los datos:
- Seleccione los análisis terminados y presione Ver. En el menú utilidades , seleccione/Gráfico de exportación.
- En el menú de las regiones , elegir Todos los pozosy en el menú de Grupo , para obtener los valores promedio para cada conjunto de pozos como grupo elegir Replica y para la exportación de los valores individuales de cada bien eligen ninguno.
- En el menú de objeto de Red métrica , elegir la Red objeto integrado intensidad Total (UCR x µm2/noextra). Este parámetro indica la suma de los tiempos de intensidad (en dependencia) de la señal roja del área de la señal roja (en μm2) en todas las imágenes a través de cada bien, que corresponde a la total captación de LDL por las células.
- Haga clic en el botón Exportar datos . Compruebe dividir datos en imágenes individuales. Los datos se copiaron automáticamente en un portapapeles y se pueden pegar en un nuevo archivo de hoja de cálculo.
- En el menú de la fase objeto de métrica , elija la confluencia (por ciento). Compruebe dividir datos en imágenes individuales. Haga clic en el botón Exportar datos . Los datos se copiaron automáticamente en un portapapeles y pueden copiarse en el archivo de hoja de cálculo que contiene datos de intensidad integrado del objeto Total de rojo.
- Aplicar la conversión de la confluencia por ciento de superficie total con la siguiente ecuación.
Área de fase (μm2/noextra) total = confluencia (%) × (altura de la imagen (píxeles) × resolución) (× ancho de imagen (píxeles) de resolución)
Nota: el parámetro de confluencia (%) indica la confluencia por ciento de la superficie de fase por la imagen que corresponde a la zona de las células en cada pozo. Esta métrica debe ser convertida en zona de fase total cada imagen una vez exportado. Las especificaciones de imagen para el canal de fase (altura de la imagen, anchura y resolución) para ser utilizado con la fórmula anterior para cada buque experimental pueden encontrarse por Propiedades vaso bajo Canales de imagen. - Normalizar la intensidad Total rojo objeto integrado a la zona de fase Total calculado de 4.1.6 utilizando la siguiente fórmula para cada imagen individual para eliminar la variabilidad en la densidad celular en los pozos.
- Dividir los valores de Rojo objeto integrado intensidad Total (UCR x µm2/noextra) de cada imagen por su correspondiente Área de fase Total (μm2/noextra) para obtener valores de Captación de la LDL (UCR) por imagen.
- Entonces, un promedio de los datos de Captación de la LDL (UCR) de todas las imágenes de cada pozo para obtener la captación de LDL promedio en cada pozo y luego media de los valores de absorción de LDL de todos los pozos replicados para obtener medios de grupo. Estos datos son los valores finales de la absorción de LDL y pueden utilizarse para la ilustración y el análisis estadístico utilizando el software de elección.
Representative Results
Vivo de la célula permite la proyección de imagen para el monitoreo confiable de la salud de la célula durante estudios de afluencia de colesterol en tres líneas celulares humanas
Validamos nuestro análisis en tres líneas de células humanas que colesterol regulación de la homeostasis desempeña un papel fisiopatológico importante, incluyendo las células del carcinoma hepático humano (HepG2), humano renal (HK2) las células epiteliales y células endoteliales de la arteria coronaria humana (HCAECs). Utilizamos un sistema de imágenes de células vivas para realizar el ensayo de absorción de LDL en un curso de tiempo de 4 h con seriales mediciones a intervalos de 1 h. Nuestros resultados indican que todos los tipos de celular probados eran compatibles con esta nueva técnica y resultado en curvas indicando continua captación de LDL por la duración del estudio de afluencia con 4,33 h como el extremo final (figura 2). Los datos de flujo se muestra en la figura 2 se obtuvieron mediante la normalización de la pHrodo total fluorescencia LDL marcados con rojo (total intensidad rojo objeto integrado por imagen en UCR x µm2/imagen) al área total de la célula en cada imagen de cada pozo (área de objeto de fase por imagen en μ m2/noextra) para eliminar la variabilidad en la densidad celular en los pozos. Además, para validar la sensibilidad del ensayo de flujo de LDL para detección de compuestos que afectan a la absorción de colesterol LDL, utilizamos dos controles positivos conocidos por inhibir la afluencia de LDL, Dynasore y rPCSK9 y un control positivo conocido para inducir a LDL absorción, simvastatina. Como validada por nuestros resultados, después del tratamiento con Dynasore y rPCSK9, los tres probaron líneas celulares humanas (HepG2, HK2 y HCAEC) demostradas reducciones significativas en el flujo de LDL sobre un curso de tiempo de 4 h (figura 2A-C). Por ejemplo, figura 2A se muestra que el flujo de LDL se reduce en las células HepG2 con tratamiento de Dynasore en el transcurso del tiempo, en comparación con las células tratadas con DMSO; mientras que el DMSO como el control del vehículo para Dynasore control no tuvo efectos significativos en el flujo de LDL comparado con el grupo control no tratado. Además, los resultados demostraron un aumento marcado en la captación de LDL por las células HepG2 después del tratamiento con simvastatina (figura 3), el apoyo a la sensibilidad de este método para detectar alteraciones significativas en el flujo de LDL. En sobre el punto de tiempo 4.5 h, que es un momento típico en estudios de absorción de LDL, la afluencia de LDL es significativamente reducida con tratamiento Dynasore o rPCSK9 y aumentada por el tratamiento de simvastatina (figura 4).
Una ventaja importante al uso de celular directo imágenes para estudios de absorción de LDL es que este sistema proporciona imágenes en tiempo real de las células en cada pozo que podría utilizarse para monitorizar la posible citotoxicidad de los compuestos examinados. Figuras 5 a 7 ilustran imágenes representativas de las líneas de tres celulares investigadas en el momento inicial (0,33 h) y el extremo final (4,33 h) como una referencia visual de la afluencia neta de LDL. Las imágenes confirman la morfología normal de las células siguen tratamientos Dynasore o rPCSK9, que indica la efectividad y la seguridad de estos compuestos.
Vivo de la célula análisis da colesterol cuantitativa Serial confiable afluencia medidas con diversos tratamientos
Una ventaja importante de utilizar este protocolo con un sistema de imagen vivo de la célula es la capacidad de recopilar datos durante el curso del tiempo y comparar el flujo de LDL en varios puntos del tiempo en lugar de un solo punto de tiempo final que como tradicionalmente se hace. Mediante este protocolo, que son capaces de calcular la afluencia de reductionin porcentaje de LDL en el momento terminal, así como a intervalos de 1 h durante el curso del tiempo. La tabla 2 resume la reducción en el flujo de LDL en tres líneas de células humanas probadas después de tratamiento previo de 10 minutos con 40 μm Dynasore o tratamiento previo 1 h con 10 μg/mL rPCSK9. A 4,33 h como el punto final del estudio, el tratamiento con Dynasore en 40 μm redujo significativamente la afluencia de LDL en las células HepG2, células HK2 y HCAECs de 53%, 68% y 54%, respectivamente (Tabla 2A-C) y tratamiento con rPCSK9 a 10 μg/mL dio lugar a 55% reducción LDL afluencia en HK2 células (tabla 2B). Además de cuantificar el momento terminal como en los análisis tradicionales, que son capaces de realizar un análisis cuantitativo en la reducción de la afluencia de LDL debido al tratamiento en cada momento del experimento. Por ejemplo, la tabla 2B muestra que el tratamiento con rPCSK9 en HK2 células dio lugar a una reducción de la absorción de LDL por el 79% a 1,33 h, 67% a 2,33 h, 59% a 3,33 h después del tratamiento en comparación con las células no tratadas. Este protocolo proporciona un método confiable para el análisis cuantitativo del flujo de LDL después del tratamiento.
Figura 1 : Proceso de definición de máscara. Imágenes representativas de células HK2 se describen después de la aplicación de la definición de tratamiento apropiado (detallada en la tabla 1). Se muestra las células areHK2 sin enmascarar (A), con fase Maskapplied (B), con rojo objeto máscara aplicada (C), o con objeto de rojo y fase máscaras aplicadas (D). Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Reducción en el LDL captación uso directo celular sistema de imagen en un transcurso de tiempo 4,33 h. Vivir el sistema se utiliza para medir el flujo de LDL en las células del carcinoma hepático humano (HEPG2) (A), humanas células tubulares renales epiteliales (HK2) (B) y las células endoteliales de la arteria coronaria humana (HCAE) (C) análisis de la célula. Las células fueron tratadas con Dynasore (10 minutos antes de la carrera) o rPCSK9 (1 h antes de la carrera) como controles positivos. DMSO se utilizó como un vehículo para los tratamientos de Dynasore. Controles positivos disminuyeron significativamente la afluencia de LDL en todas las líneas de la célula 3. Se obtuvieron valores de afluencia de LDL por la normalización de la intensidad total objeto rojo integrado (RCUxµm2/noextra) para el área de objeto de la fase total (μm2/noextra). Los datos son ±SEM. N = grupo de pozos 6. Los datos son representativos de 2 o 3 experimentos independientes. p < 0.0001 vs en blanco, y ###p < 0.0001 vs DMSO, utilizando ANOVA de dos vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Aumento en la absorción de LDL usando células vivas, sistema de imagen en un transcurso de tiempo 4,33 h. Análisis de la célula sistema se utiliza para medir el flujo de LDL en las células del carcinoma hepático humano (HEPG2) en vivo. Captación de LDL se incrementa significativamente después del tratamiento con simvastatina para 12 h (A), 18 h (B) o 24 h (C) utilizando los medios de comunicación que contiene 2% FBS. El punto de tiempo de 24 h también se realizó con medios que contienen 5% LPDS (sin equipos). DMSO se utilizó como control negativo. Se obtuvieron valores de afluencia de LDL por la normalización de la intensidad total objeto rojo integrado (UCR x µm2/noextra) para el área de objeto de la fase total (μm2/noextra). Los datos son ±SEM. N = grupo de pozos 6. Los datos son representativos de un experimento independiente. p < 0.0001 vs DMSO, utilizando la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Reducción significativa del flujo de LDL por agentes reductores de la absorción de LDL en el momento de 4,3 h. Afluencia de LDL se redujeron significativamente en las células del carcinoma hepático humano (HepG2) (A), humanas células tubulares renales epiteliales (HK2) (B) y la arteria coronaria humana (HCAE) las células endoteliales (C) después del tratamiento con la absorción de LDL inhibidores de la Dynasore por 10 minutos o rPCSK9 durante 1 hora. Afluencia de LDL se incrementa marcadamente de simvastatina en las células HepG2 después 12, 18 o 24 h (D). Los datos son ±SEM. N = grupo de pozos 6. Los datos son representativos de 2 o 3 experimentos independientes. p < 0.0001 utilizando ANOVA de dos vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Reducida afluencia de LDL en las células del carcinoma (HepG2) hepatocelular por agente reductor de la absorción de LDL, Dynasore. Muestran imágenes representativas de la fase objeto y objeto rojo para las células HepG2 a 0,33 h (paneles de la izquierda) y extremo h 4,33 (paneles de la derecha) Mostrar el estado saludable de las células. 40 μm Dynasore, sabido que puede reducir la absorción de LDL-colesterol, se utilizó como control positivo (C). Imágenes fueron tomadas a 10 aumentos. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Reducida afluencia de LDL en humanas células tubulares renales epiteliales (HK2) por agentes reductores de la absorción de LDL, Dynasore y rPCSK9. Imágenes representativas de la fase objeto y objeto rojo para células HK2 representado en 0,33 h (paneles de la izquierda) y el extremo de 4,33 h (paneles de la derecha) Mostrar el estado saludable de las células. 40 μm Dynasore (C), o 10 μg/mL rPCSK9 (D), conocido para reducir la absorción de colesterol de LDL, se utilizaron como control positivo. Imágenes son tomadas con 10 aumentos. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 . Reducida afluencia de LDL en las células endoteliales de la arteria coronaria humana (HCAECs) por agente reductor de la absorción de LDL, Dynasore. Imágenes representativas de la fase objeto y objeto rojo para HCAECs representado en 0,33 h (paneles de la izquierda) y el extremo de 4,33 h (paneles de la derecha) Mostrar el estado saludable de las células. 40 μm Dynasore, sabido que puede reducir la absorción de LDL-colesterol, se utilizó como control positivo (C). Imágenes fueron tomadas a 10 aumentos. Barra de escala = 100 μm. datos son ±SEM. N = grupo de pozos 6. Los datos son representativos de 2 o 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: parámetros de definición de elaboración. Estos parámetros son específicos para el sistema de análisis utilizado en este protocolo. Parámetros se deben establecer a analizar área roja en el canal rojo y la zona de la célula en el canal de fase. Configuración de los parámetros para HepG2, HK2, presentan líneas de celulares HCAE.
Tabla 2: cambio porcentual en la afluencia de LDL en las células HepG2, HK2 y HCAE tratados con Dynasore, rPCSK9 o simvastatina en h. 4,3 HepG2 (A) células, células HK2 (B), (C) HCAE células y células HepG2 (D).
Discussion
En el protocolo actual, se demuestra la utilización de imágenes de células vivas como un método nuevo y más eficaz para medir la absorción de LDL en tiempo real en un transcurso de tiempo en varias líneas celulares humanas. Las células del carcinoma hepático humano (HepG2) son comúnmente utilizadas en estudios de investigación para reducir el colesterol therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Por lo tanto, elegimos este tipo de células para la prueba de la capacidad de un sistema de imágenes de células vivas para estudios de flujo de LDL. Nuestros resultados indican que las células HepG2 son compatibles con esta nueva técnica y resultado en una curva sigmoidea como indicando continua captación de LDL por la duración de la prueba de flujo hasta 4,33 h como el extremo final (figura 2A y figura 3 ).
Homeostasis del colesterol desempeña un papel importante en la fisiopatología de diversas nefropatías. En efecto, la acumulación de colesterol en el tejido renal es un contribuyente importante a la fibrosis renal a enfermedad renal crónica y es una patología importante en diversas nefropatías28,,29,30,31. Por lo tanto, examinamos nuestro método humano renal (HK2) las células epiteliales como una línea de celular popular y confiable en el campo de la Nefrología. Nuestros datos también apoyaron la viabilidad de lo sistema de imágenes de células vivas para medir el flujo de LDL en las células HK2. Como se muestra en la figura 2B, las células HK2 tomaron el colesterol LDL linealmente a lo largo de la duración del estudio de afluencia (4 horas).
Debido a la importancia del metabolismo del colesterol en el desarrollo y progresión de la aterosclerosis32,33,41, la principal causa de enfermedades cardiovasculares, que a su vez son el asesino número uno en todo el mundo 42, el objetivo fue validar el método en un tipo de células relevantes para ateroesclerosis. Utilizamos células endoteliales arteriales coronarias humanas (HCAECs), ya que son uno de los primeros tipos de células a estar expuesto a un insulto de colesterol en el lumen de la arteria coronaria de un paciente de la aterosclerosis. Nuestros datos que se muestra en la figura 2C indican que este método de flujo de LDL también funciona eficazmente con HCAECs. La gráfica resultante es una curva sigmoidea como similar a la de las células HepG2.
Para probar la validez y la sensibilidad de este ensayo de afluencia de LDL mejorada para la detección de compuestos que afectan a la absorción de LDL-colesterol, se utilizaron tres controles, agentes reductores de la absorción de LDL Dynasore y rPCSK9 y activador de la afluencia de LDL simvastatina. Aquí, hemos tratado lo anterior mencionado líneas celulares (HepG2, HK2 y HCAECs) con las concentraciones optimizadas de Dynasore o rPCSK9 antes del ensayo de afluencia. Nuestros resultados demostraron que todas las líneas celulares probadas respondieron a los tratamientos con reducciones significativas en el flujo de LDL durante un tiempo de 4 horas (figura 2). Por ejemplo, a 4,33 h como el momento final, tratamiento con Dynasore a 40 μm redujo significativamente afluencia de LDL en las células HepG2, células HK2 y HCAECs en 53%, 68% y 54%, respectivamente (p < 0.0001; Figura 2 A-C y Tabla 2A-C). Además, rPCSK9 en 10 μg/mL causó una marcada reducción del 55% en afluencia de LDL en las células HK2 (p < 0.0001; Figura 2 B y tabla 2B). Por otra parte, nuestros resultados demostraron que tratar células HepG2 con simvastatina resultó en un marcado aumento en la absorción de LDL (figura 3), apoyo a la sensibilidad de este método para detectar alteraciones significativas en el flujo de LDL. Estudios de tratamiento con rPCSK9 en células HepG2 y HCAEC no están incluidos en este protocolo como rPCSK9 se utiliza como un tratamiento de control adicional con resultados bien documentados, pero es costoso para comprar en pequeñas cantidades. Por lo tanto rPCSK9 sólo se utilizó para validar este protocolo en células HK2.
En vivo imagen análisis, junto con la medición funcional y oportuna del flujo de LDL, para monitoreo continuo de la salud y la morfología de las células de la célula. Esta ventaja puede detectar eficientemente la citotoxicidad potencial de los compuestos aplicados, haciendo este método una técnica ideal para monitorear simultáneamente la citotoxicidad y actividad farmacológica. Figuras 5 a 7 ilustran imágenes representativas de las tres líneas de celular probado en el extremo final (4,33 h) como una referencia visual para el efecto de los tratamientos en afluencia neta de LDL y también muestra la morfología saludable de las células después de la prueba tratamientos. Recomendamos una inspección visual de todas las imágenes de cada pozo para asegurar la heathy morfología de las células para la duración del estudio. Por ejemplo, en datos que no se muestran, cuando imágenes de células HepG2 trataron con 80 μM Dynasore fueron inspeccionados, se observaron indicios de separación de células como los bordes de las células parecen ser levantando la placa, lo que sugiere la separación de la célula en concentraciones más altas de Dynasore. Además, altas concentraciones de simvastatina (3-10 μM) también llevado a morfología alterada indicando indujeron apoptosis según lo divulgado para dosis altas de estatinas45. Este protocolo fue utilizado para llevar a cabo una valoración del tratamiento Dynasore en 20-80 μM y simvastatina en concentración de 0.5-10 μM, después de que las imágenes de la célula fueron utilizadas para analizar la salud de las células y determinar posibles ctotoxicity de los tratamientos en diferentes concentraciones. Resultados sugirieron el uso de 40 μM para Dyansore y 1 μM para simvastatina como concentración óptima.
Por último, se sugiere realizar un estudio de valoración de densidad celular si otra línea celular debe ser probado con este método para identificar el número óptimo de la célula por pozo para obtener resultados consistentes. Nuestro estudio de optimización de densidad celular mostró que 10.000 células/pocillo de una placa de 24 pozos llevan a resultados de afluencia de LDL consistente para células HK2 y HCAE. Es importante tener en cuenta que para este análisis de flujo de LDL utilizando células vivas, sistema de imagen, una monocapa de células no-confluentes distribuidos uniformemente en los pozos es deseable como agregados de células pueden dar lugar a errores en los valores de flujo finales de normalizadas LDL. La razón de esto es que para la normalización de los datos de afluencia, el área objeto de fase se utiliza como una medida de la densidad celular y este parámetro puede ser afectado cuando se forman grupos de células. Observamos que las células HepG2 tienen tendencia a forma grupos cuando se siembra en densidades superiores a 5.000 células/pozo causando resultados de afluencia incoherente; por lo tanto, se utilizan 5.000 células por pozo en una placa de 24 pocillos como densidad óptima de células HepG2.
Colectivamente, nuestro método ofrece una plataforma de mediano a alto rendimiento para la detección de la actividad farmacológica y la citotoxicidad de los compuestos regular afluencia de LDL al mismo tiempo. Este método puede ser fácilmente adaptado para su uso con otros ligandos marcados con fluorescencia que entran en el compartimento lisosomal para evaluar la absorción ligando en tiempo real. Este protocolo ofrece especificaciones para InCucyte en vivo imagen y sistema de análisis, el protocolo puede ser adaptado para sistemas alternativos de proyección de imagen tales como Celómica.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones para LAS: Instituto Nacional de salud (R56HL132209 y 1R01HL140468) y el Miami Heart Research Institute. KY es un recipiente de corazón Americano Asociación Beca Predoctoral (18PRE33960070). Las células HepG2 fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Emmanuel Thomas, Universidad de Miami Miller School de medicina46,47,48.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
| HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
| MEM | Sigma | M0325 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
| L-Glutamine 200 mM solution | Sigma | G7513 | |
| FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
| Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
| Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
| Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
| 24 well plate | Falcon | 353226 | |
| 40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
| Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
| Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
| Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
| PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |
References
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Trevisan, R., Dodesini, A. R., Lepore, G.
- Tall, A. R., Yvan-Charvet, L. Cholesterol, inflammation and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 15 (2), 104 (2015).
- Dedoussis, G. V., Schmidt, H., Genschel, J. LDL-receptor mutations in Europe. Human Mutation. 24 (6), 443-459 (2004).
- Sasaki, K., et al. ATP-binding cassette transporter A subfamily 8 is a sinusoidal efflux transporter for cholesterol and taurocholate in mouse and human liver. Molecular Pharmaceutics. , (2018).
- Storch, J., Xu, Z. Niemann-Pick C2 (NPC2) and intracellular cholesterol trafficking. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1791 (7), 671-678 (2009).
- Jansen, P. J., et al. Absence of ApoE upregulates murine brain ApoD and ABCA1 levels, but does not affect brain sterol levels, while human ApoE3 and human ApoE4 upregulate brain cholesterol precursor levels. Journal of Alzheimer's Disease. 18 (2), 319-329 (2009).
- Girard, E., et al. The dynamin chemical inhibitor dynasore impairs cholesterol trafficking and sterol-sensitive genes transcription in human HeLa cells and macrophages. PLoS One. 6 (12), 29042 (2011).
- Robinet, P., et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis. Traffic. 7 (7), 811-823 (2006).
- Macia, E., et al. Dynasore, a cell-permeable inhibitor of dynamin. Developmental Cell. 10 (6), 839-850 (2006).
- Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the LDLR and LDL-cholesterol. Journal of Biological Chemistry. , (2004).
- Qian, Y. -W., et al. Secreted PCSK9 downregulates low density lipoprotein receptor through receptor-mediated endocytosis. Journal of Lipid Research. 48 (7), 1488-1498 (2007).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. History of discovery: the LDL receptor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (4), 431 (2009).
- Stephan, Z. F., Yurachek, E. C. Rapid fluorometric assay of LDL receptor activity by DiI-labeled LDL. Journal of Lipid Research. 34 (2), 325-330 (1993).
- Fisher, T. S., et al. Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. Journal of Biological Chemistry. 282 (28), 20502-20512 (2007).
- Atrahimovich, D., Khatib, S., Sela, S., Vaya, J., Samson, A. O. Punicalagin induces serum low-density lipoprotein influx to macrophages. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, (2016).
- Xu, M., et al. δ-Tocopherol reduces lipid accumulation in Niemann-Pick type C1 and Wolman cholesterol storage disorders. Journal of Biological Chemistry. 112, (2012).
- Bonilla, D. L., et al. Autophagy regulates phagocytosis by modulating the expression of scavenger receptors. Immunity. 39 (3), 537-547 (2013).
- Guo, M., et al. Apelin-13 Decreases Lipid Storage in Hypertrophic Adipocytes In vitro Through the Upregulation of AQP7 Expression by the PI3K Signaling Pathway. Medical Science Monitor : International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 20, 1345-1352 (2014).
- Guillemot, J., Asselin, M. C., Susan-Resiga, D., Essalmani, R., Seidah, N. G. Deferoxamine stimulates LDLR expression and LDL uptake in HepG2 cells. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (3), 600-608 (2016).
- Javitt, N. B. Hep G2 cells as a resource for metabolic studies: lipoprotein, cholesterol, and bile acids. The FASEB Journal. 4 (2), 161-168 (1990).
- Mullen, P. J., Lüscher, B., Scharnagl, H., Krähenbühl, S., Brecht, K. Effect of simvastatin on cholesterol metabolism in C2C12 myotubes and HepG2 cells, and consequences for statin-induced myopathy. Biochemical Pharmacology. 79 (8), 1200-1209 (2010).
- McNutt, M. C., et al. Antagonism of secreted PCSK9 increases low density lipoprotein receptor expression in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10561-10570 (2009).
- Scharnagl, H., et al. Effect of atorvastatin, simvastatin, and lovastatin on the metabolism of cholesterol and triacylglycerides in HepG2 cells. Biochemical Pharmacology. 62 (11), 1545-1555 (2001).
- Scharnagl, H., et al. The effects of lifibrol (K12. 148) on the cholesterol metabolism of cultured cells: evidence for sterol independent stimulation of the LDL receptor pathway. Atherosclerosis. 153 (1), 69-80 (2000).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Ding, W., et al. Osteopontin deficiency ameliorates Alport pathology by preventing tubular metabolic deficits. JCI Insight. 3 (6), (2018).
- Herman-Edelstein, M., Scherzer, P., Tobar, A., Levi, M., Gafter, U. Altered renal lipid metabolism and renal lipid accumulation in human diabetic nephropathy. Journal of Lipid Research. 55 (3), 561-572 (2014).
- Su, H., et al. Lipid Deposition in Kidney Diseases: Interplay Among Redox, Lipid Mediators, and Renal Impairment. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (10), 1027-1043 (2018).
- Agrawal, S., Zaritsky, J. J., Fornoni, A., Smoyer, W. E. Dyslipidaemia in nephrotic syndrome: mechanisms and treatment. Nature Reviews Nephrology. 14 (1), 57 (2018).
- Babiak, J., Rudel, L. L. Lipoproteins and atherosclerosis. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 1 (3), 515-550 (1987).
- Wang, H. H., Garruti, G., Liu, M., Portincasa, P., Wang, D. Cholesterol and Lipoprotein Metabolism and Atherosclerosis: Recent Advances in Reverse Cholesterol Transport. Annals of Hepatology. 16 (1), 28-42 (2018).
- Preta, G., Cronin, J. G., Sheldon, I. M.
- Horton, J. D., Cohen, J. C., Hobbs, H. H. Molecular biology of PCSK9: its role in LDL metabolism. Trends in Biochemical Sciences. 32 (2), 71-77 (2007).
- Abifadel, M., et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature Genetics. 34 (2), 154 (2003).
- Goldstein, J. L., Brown, M. S. Regulation of the mevalonate pathway. Nature. 343 (6257), 425 (1990).
- Dong, B., Wu, M., Cao, A., Li, H., Liu, J. Suppression of Idol expression is an additional mechanism underlying statin-induced up-regulation of hepatic LDL receptor expression. International Journal of Molecular Medicine. 27 (1), 103-110 (2011).
- Song, K. H., Kim, Y. H., Im, A. -R., Kim, Y. H. Black Raspberry Extract Enhances LDL Uptake in HepG2 Cells by Suppressing PCSK9 Expression to Upregulate LDLR Expression. Journal of Medicinal Food. , (2018).
- Chan, J. C., et al. A proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 neutralizing antibody reduces serum cholesterol in mice and nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9820-9825 (2009).
- Tabas, I., Williams, K. J., Borén, J. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation. 116 (16), 1832-1844 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 89 (3), 331-340 (1997).
- Horton, J. D., Goldstein, J. L., Brown, M. S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. The Journal of Clinical Investigation. 109 (9), 1125-1131 (2002).
- Tavintharan, S., et al. Reduced mitochondrial coenzyme Q10 levels in HepG2 cells treated with high-dose simvastatin: A possible role in statin-induced hepatotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. 223 (2), 173-179 (2007).
- Thomas, E., et al. HCV infection induces a unique hepatic innate immune response associated with robust production of type III interferons. Gastroenterology. 142 (4), 978-988 (2012).
- Thomas, E., Liang, T. J. Experimental models of hepatitis B and C-new insights and progress. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (6), 362 (2016).
- Yoneda, M., et al. Hepatitis B Virus and DNA Stimulation Trigger a Rapid Innate Immune Response through NF-κB. The Journal of Immunology. , 1502677 (2016).
