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पारंपरिक आरटी-पीसीआर और SYBR ग्रीन आरटी-qPCR का उपयोग कर Tilapia झील वायरस का पता लगाने

Published: November 10, 2018 doi: 10.3791/58596
Automatic Translation
1, 2, 2
1Institute of Veterinary Bacteriology Vetsuisse Faculty, University of Bern, 2Department of Veterinary Microbiology and Immunology and Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Kasetsart University Institute for Advanced Studies, Kasetsart University

Summary

यह प्रोटोकॉल आरटी-पीसीआर के तरीके का उपयोग करके Tilapia ऊतकों में Tilapia लेक वायरस (TiLV) का निदान करते हैं । पूरे विधि ऊतक विच्छेदन से कुल आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण और या तो पारंपरिक पीसीआर या मात्रात्मक पीसीआर dsDNA एक फ्लोरोसेंट बाध्यकारी डाई बाध्यकारी का उपयोग करके TiLV का पता लगाने के बाद से वर्णित है ।

Abstract

इस विधि का उद्देश्य Tilapia ऊतकों में Tilapia लेक वायरस (TiLV) के तेज, संवेदनशील और विशिष्ट पता लगाने की सुविधा है । इस प्रोटोकॉल निगरानी कार्यक्रमों के भाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, सुरक्षा उपायों और TiLV बुनियादी अनुसंधान प्रयोगशालाओं में । वायरस निदान के स्वर्ण मानक आमतौर पर आगे सत्यापन के लिए रिवर्स-प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) के रूप में पूरक तकनीक के बाद वायरस अलगाव शामिल है । यह बोझिल हो सकता है, समय लेने वाली और आम तौर पर ऊतक भारी वायरस से संक्रमित नमूनों की आवश्यकता है । आर टी-मात्रात्मक (क्यू) वायरस का पता लगाने में पीसीआर के उपयोग के कारण अपने मात्रात्मक प्रकृति, उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता, दरिद्रता और इसकी तेजी से समय परिणाम के लिए लाभप्रद है । यहां, TiLV पता लगाने के लिए पीसीआर आधारित दृष्टिकोण की पूरी विधि वर्णित है, tilapia अंग से खोदी, कुल ribonucleic एसिड (आरएनए) निष्कर्षण एक guanidium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म समाधान का उपयोग कर, आरएनए ठहराव, एक दो कदम पीसीआर द्वारा पीछा किया प्रोटोकॉल जरूरत पर जोर, पूरक deoxyribonucleic एसिड (सीडीएनए) संश्लेषण और TiLV का पता लगाने के द्वारा या तो पारंपरिक पीसीआर या मात्रात्मक पहचान SYBR ग्रीन मैं डाई का उपयोग qPCR के माध्यम से. पारंपरिक पीसीआर के बाद पीसीआर कदम की आवश्यकता है और बस वायरस की उपस्थिति के बारे में सूचित करेंगे । उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण TiLV के निरपेक्ष ठहराव के लिए नीचे के रूप में छोटे रूप में 2 प्रतियां और इस प्रकार उप में TiLV निदान के लिए असाधारण उपयोगी है नैदानिक मामलों की अनुमति होगी । दो पीसीआर दृष्टिकोण का एक विस्तृत विवरण, दो प्रयोगशालाओं से प्रतिनिधि परिणाम और दोनों के महत्वपूर्ण मापदंडों की एक गहन चर्चा यह सुनिश्चित करने के लिए शामिल किया गया है कि शोधकर्ताओं और diagnosticians खोजने के लिए उनके सबसे उपयुक्त और लागू TiLV का पता लगाने की विधि ।

Introduction

वैश्विक व्यक्ति मछली आपूर्ति २०१४ में 20 किलो के एक नए रिकॉर्ड पर पहुंच गया और यह जलीय कृषि में जोरदार वृद्धि के कारण था । जलीय कृषि दुनिया भर में सबसे तेजी से बढ़ती पशु खाद्य क्षेत्रों में से एक है और केवल पशु खाद्य क्षेत्र है कि तेजी से मानव आबादी1से बढ़ रहा है उत्पादन है । Tilapiine cichilds दूसरे सबसे महत्वपूर्ण ताजा पानी की मछली ६,४००,००० टन (मीट्रिक टन) और २०१५2में ९,८००,०००,००० अमेरिकी डॉलर का अनुमानित मूल्य के कुल वैश्विक उत्पादन के साथ दुनिया भर में कृषि शामिल हैं । tilapia के शीर्ष दस उत्पादकों चीन (१.७८ मीट्रिक टन), इंडोनेशिया (१.१२ मीट्रिक टन) और मिस्र (०.८८ मीट्रिक टन), बांग्लादेश, वियतनाम, फिलीपींस, ब्राजील, थाईलैंड, कोलंबिया और युगांडा2द्वारा पीछा कर रहे हैं । उम्मीद की जा रही है कि वैश्विक tilapia उत्पादन २०३०3से करीब ७.३ मीट्रिक टन होगा । Tilapia इस तरह के एक महत्वपूर्ण वैश्विक खाद्य स्रोत बन गए है न केवल क्योंकि वे4 प्रोटीन का एक सस्ता स्रोत हैं, लेकिन यह भी है क्योंकि वे पानी और जलवायु की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत क्षमता में नस्ल के लिए आसान कर रहे है5,6। अभी कुछ दशक पहले, यह माना जाता था कि वहां कुछ व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण tilapia खेती की धमकी बीमारियों थे, लेकिन यह अब सच है । tilapia लेक वायरस रोग (TiLVD) नामक एक उभरती हुई वायरल बीमारी tilapia में पाई जाने वाली पहली गंभीर बीमारी महामारी है और संपूर्ण उद्योग खतरे में है । इस बीमारी के गंभीर सामाजिक-आर्थिक परिणाम हैं और अफ्रीका के7, एशिया और दक्षिण अमेरिका में लाखों लोगों के लिए खाद्य सुरक्षा पर सीधा खतरा है । २०१८ के शुरू में, विश्व पशु स्वास्थ्य (OIE) के लिए संगठन की रिपोर्ट है कि इस रोग के etiological एजेंट, TiLV, आधिकारिक तौर पर आठ8 देशों को कवर तीन महाद्वीपों पर पाया गया था और के बाद से इस रोगज़नक़ जानकारी कार्ड था वहां अद्यतन तंजानिया, युगांडा9, इंडोनेशिया10, ताइवान11 और पेरू12में TiLV की अधिक रिपोर्ट किया गया है । TiLV एक उपंयास एकल कतरा आरएनए वायरस एक orthomyxo वायरस की तरह होने का वर्णन किया है, क्योंकि यह अंय orthomyoxoviruses जैसे इंफ्लूएंजा या संक्रामक सामन रक्ताल्पता वायरस (इससव)13के रूप में याद ताजा विशेषताओं की एक किस्म शामिल है । यह पहले गलील, इसराइल14की झील में जंगली और farmed tilapia के बड़े पैमाने पर नुकसान के बाद में पहचाना गया था । इसके बाद, इसी तरह के रोग के प्रकोप को ग्रीष्मकालीन मृत्यु के रूप में संदर्भित किया जाता है और एक महीने TiLV संक्रमण से जुड़े मृत्यु दर सिंड्रोम15 और नील नदी और लाल संकर tilapia में नील नदी में tilapia (Oreochromis niloticus) में सूचना दी गई (Oreochromis एसपीपी.) थाईलैंड में16, क्रमशः । जलीय पशु वायरसों का पता लगाना ऐतिहासिक रूप से कोशिका संस्कृति में विकास और वायरस के अलगाव द्वारा किया जाता है । विभिंन सेल लाइनों के प्रचार और अलगाव सहित TiLV के लिए परीक्षण किया गया है, ई-11 snakehead मछली से व्युत्पंन कोशिकाओं (Ophiocephalus striatus)17,18, OmB और TmB से मूल Oreochromis mossambicus18, और OnlB और OnlL से उद्भव नील tilapia (ओ. niloticus)19. जबकि वायरस संस्कृति लाभ है कि यह आगे प्रयोगों के लिए सामग्री प्रदान करता है, यह नुकसान है कि यह कम से 4-7 दिनों की आवश्यकता है cytopathic प्रभाव (सीपीई) के गठन का पालन करने के लिए और महत्वपूर्ण, अलग piscine वायरस, कि और अधिक फिट करने के लिए कर रहे हैं दोहराने प्रचारित किया जा सकता है और इसी तरह सीपीई उत्पादन ।

पिछले कुछ दशकों में, वहां एक कदम पारंपरिक से दूर किया गया है, अक्सर ऐसे सेल संस्कृति, सीरोलॉजी और प्रतिजन का पता लगाने और तेजी से और अधिक संवेदनशील न्यूक्लिक एसिड आधारित डिटेक्शन परीक्षण के साथ प्रतिस्थापन के रूप में समय लेने वाली नैदानिक तरीकों20, 21. शी. इस तथ्य से स्पष्ट है कि कई qPCR परख जैसे जलीय पशुओं में वायरल रोगों की एक भीड़ के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक तरीकों के रूप में विकसित किया गया है, जैसे इससव के लिए22,23, वायरल गलघोंटू सेप्टीसीमिया वायरस (VHSV)24 ,25, betanodavirus26,27 salmonid alphavirus28, मछली iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30, और Lymphocystis रोग विषाणु (LCDV)31 . निदान और रोगज़नक़ निगरानी के लिए मजबूत तरीके तत्काल TiLV के प्रसार को कम करने के लिए आवश्यक हैं । इस तरह के तरीकों नैदानिक संकेत विकसित करने और कम वायरस के भार का पता लगाने से पहले संक्रमण का जल्दी पता लगाने की अनुमति चाहिए । तारीख करने के लिए, आर टी-पीसीआर14,३२, नेस्टेड आरटी-पीसीआर18, अर्द्ध नेस्टेड आरटी-पीसीआर३३, और आरटी-qPCR३२,३४ सहित अलग पीसीआर प्रोटोकॉल TiLV का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है मछली के ऊतकों में । rt-qPCR और TiLV डिटेक्शन के लिए अतिसंवेदनशील कक्ष पंक्तियों में वायरस अलगाव की तुलना पता चला कि rt-qPCR १,००० बार वायरस अलगाव३२से अधिक संवेदनशील था । हालांकि प्रत्येक प्रकाशित पीसीआर प्रोटोकॉल TiLV का पता लगाने के लिए अलग संवेदनशीलता की सूचना दी है, ज्यादातर परख वायरल प्रतियां की पहचान सीमा के साथ अति संवेदनशील ७.५ प्रतियां३३, 7 प्रतियां18 या 2 प्रतियां३२ प्रति प्रतिक्रिया.

इस विधि लेख के उद्देश्य को समझाने के लिए है, विस्तार में, कैसे TiLV जांच परख प्रदर्शन करने के लिए, tilapia ऊतक संग्रह के साथ शुरू, कुल आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण और फिर TiLV विशिष्ट पीसीआर आधारित परख । विशेष रूप से, दोनों पारंपरिक rt-पीसीआर और भी SYBR ग्रीन आधारित आरटी-qPCR के व्यापक प्रोटोकॉल के लिए TiLV का पता लगाने के लक्ष्य वैज्ञानिकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अपील करने के लिए वर्णित किया गया है । पूर्व कम संवेदनशील है, लेकिन आम तौर पर एक सस्ता खोज विकल्प है । बाद में एक मात्रात्मक पीसीआर मशीन और अधिक महंगा रिएजेंट के रूप में और अधिक विस्तृत बुनियादी ढांचे की आवश्यकता है, लेकिन यह मात्रात्मक, तेजी से और अति संवेदनशील होने का लाभ है, जिसका अर्थ है कि यह उप में TiLV का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चिकित्सकीय संक्रमित मछली । आर टी-पीसीआर और आरटी-qPCR प्रोटोकॉल अलग भौगोलिक TiLV के अलग और शामिल परिणामों के साथ दो विभिंन प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन किया गया संवेदनशीलता और यहां वर्णित परख की reproducibility पर प्रकाश डाला ।

Protocol

इस अध्ययन के लिए पशु उपयोग प्रोटोकॉल Kasetsart विश्वविद्यालय पशु नैतिकता समिति द्वारा परमिट संख्या ACKU ५९-पशु चिकित्सक-016 के तहत अनुमोदित किया गया था ।

नोट: कृपया इस प्रोटोकॉल के लिए सुझाए गए रिएजेंट और उपकरणों से संबंधित विस्तृत जानकारी के लिए सामग्री तालिका देखें ।

1. ऊतक नमूना संग्रह

  1. Euthanize लौंग के तेल का ओवरडोज का उपयोग मछली (मात्रा मछली और उत्पादों की एकाग्रता के आकार पर निर्भर करता है, आमतौर पर अधिक से अधिक 3 मिलीलीटर/ ९५% (v/v) में संदंश और मेयो कैंची के एक चौथाई विसर्जित एक शराब बर्नर का उपयोग उपकरण को निष्फल करने के लिए उपकरण जलने के बाद इथेनॉल ।
    नोट: Tricaine methanesulfonate (MS-२२२) लौंग के तेल की जगह इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. जिगर का पता लगाएं और एक छोटा सा टुकड़ा काट (लगभग 20-100 मिलीग्राम) या बलगम की २०० µ एल इकट्ठा कवर ग्लास या सर्जिकल ब्लेड का उपयोग पूर्वकाल से tilapia मछली के पीछे करने के लिए बलगम को हटाने और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में नमूने जगह है ।
  3. तुरंत प्रक्रिया नमूने, एक आरएनए स्थिर समाधान में स्टोर या उन्हें ले जाने के लिए-८० ° c आगे का उपयोग जब तक.
    नोट: आरएनए के साथ काम करने में सबसे बड़ा काम बरकरार आरएनए अणु की तैयारी कर रहा है और उन्हें किसी भी बाद से निपटने भर में नुकसान नहीं रखते. आरएनए रीढ़ डीएनए से नुकसान के लिए अधिक संवेदनशील है । निष्कर्षण और कुल आरएनए के अलगाव ऊतक कोशिकाओं आवश्यक सावधान प्रयोगशाला तकनीक से; सभी प्रावधानों दस्ताने पहन कर RNase संदूषण को रोकने के लिए ले लो, RNase मुफ्त पानी का उपयोग, रिएजेंट, उपकरण, प्लास्टिक वेयर, कांच के बर्तन, काम अंतरिक्ष और pipetting के लिए फिल्टर सुझावों का उपयोग करके ।

2. Guanidium Thiocyanate-Phenol-आरएनए के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण

  1. खंड 1 से ऊतक नमूने युक्त ट्यूब में phenol और guanidine isothiocyanate युक्त monophasic समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    चेतावनी: यह समाधान बहुत विषाक्त है और सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक लामिना प्रवाह हुड में देखभाल के साथ और उचित सुरक्षात्मक eyewear, कपड़े और सुरक्षा दस्ताने पहनने से नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  2. समरूप तक एक ऊतक खल homogenizer का उपयोग ऊतक नमूने पीस ।
    नोट: नमूने भी एक शक्ति homogenizer सिरेमिक मोतियों के साथ संयुक्त का उपयोग कर homogenized जा सकता है । सुनिश्चित करें कि ऊतक का नमूना अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले पूरी तरह से homogenized है या प्रोटोकॉल यहां बंद है और पूरी तरह से homogenized नमूने पर-८० ° c आगे उपयोग तक स्टोर ।
  3. चरण पृथक्करण के लिए क्लोरोफॉर्म के २०० µ l को जोड़ें ।
    सावधानी क्लोरोफॉर्म एक संभावित मादक है और बेहद खतरनाक है । यह सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ ही उचित सुरक्षात्मक eyewear, कपड़े और सुरक्षा दस्ताने पहनने से एक लामिना प्रवाह हुड में देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए । एक कम विषाक्त विकल्प के रूप में, 1-ब्रोमो-3-chloropropane भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    नोट: वॉल्यूम को ऊपर या नीचे जहां उपयुक्त स्केल करें । उदाहरण के लिए, यदि phenol और guanidine isothiocyanate युक्त monophasic समाधान के केवल ५०० µ l का उपयोग किया गया था, तो इस चरण में केवल µ के १०० क्लोरोफॉर्म l को जोड़ें.
    1. मिश्रण अच्छी तरह से 15 एस के लिए उलटा द्वारा नमूने ।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) में 3 मिनट के लिए मशीन नमूने ।
  4. १२,००० × g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    नोट: एक कम कार्बनिक चरण, एक सफेद चरण और आरएनए युक्त एक ऊपरी जलीय चरण में एक स्पष्ट जुदाई होना चाहिए. इस शीर्ष चरण सामांय रूप से बेरंग है, लेकिन प्रकार और homogenized ऊतक की राशि पर निर्भर करता है, यह एक हल्के गुलाबी उपस्थिति हो सकता है ।
  5. ऊपरी जलीय परत (लगभग ५०० µ एल) स्थानांतरण एक ताजा microcentrifuge ट्यूब करने के लिए चरण परेशान बिना ।
    नोट: पूरे जलीय चरण हस्तांतरण करने की कोशिश मत करो, एक छोटी राशि के कार्बनिक या चरण के साथ जलीय चरण युक्त आरएनए के किसी भी संभावित संदूषण को रोकने के लिए छोड़ दें ।
  6. आरएनए को तेज़ करने के लिए १००% isopropanol का 1 वॉल्यूम जोड़ें ।
    1. वैकल्पिक रूप से, यदि ऊतक के बहुत कम मात्रा में इस्तेमाल किया गया, तो कुशल आरएनए वर्षण को बढ़ावा देने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए RNase मुक्त ग्लाइकोजन के 1 µ l (5-10 µ g) जोड़ें । यह २.८ चरण में आरएनए गोली की पहचान सहायता करेगा ।
      नोट: ग्लाइकोजन आरएनए के एक वाहक के रूप में कार्य करता है और ट्यूब के पक्ष में चिपके से आरएनए की छोटी मात्रा को रोकने जाएगा ।
    2. मिश्रण ट्यूबों अच्छी तरह से उलटा द्वारा कई बार ।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए 2 घंटे के लिए नमूनों की दुकान ।
  7. १२,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक ।
  8. supernatant त्यागें, microcentrifuge ट्यूब के तल पर आरएनए गोली को उखाड़ देना नहीं सावधान किया जा रहा है ।
  9. ७५% इथेनॉल (v/v) की 1 मिलीलीटर जोड़ें और कई बार ट्यूब को पलटने से आरएनए नमूने मिश्रण ।
  10. १०,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है और ७५% इथेनॉल में आरएनए गोली शामिल नमूने आगे उपयोग जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  11. supernatant को त्यागें, microcentrifuge ट्यूब के तल पर आरएनए गोली दर्ज करने के लिए नहीं देखा जा रहा है ।
    1. वैकल्पिक रूप से, चरण २.९-२.११ ७०% इथेनॉल का उपयोग कर (v/ अच्छी तरह से आरएनए गोली धोने किसी भी नमक या contaminant को कम करने के लिए ले जाएगा कि संवेदनशील बहाव अनुप्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकते हैं ।
  12. शेष इथेनॉल एक पिपेट का उपयोग कर बाहर ड्रा और फिर हवा सूखी आरएनए गोली से नहीं अब 5 से 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ।
    नोट: ओवर-सूखे छर्रों फिर से निलंबित करने के लिए मुश्किल हो जाएगा.
  13. आरएनए गोली solubilize करने के लिए RNase-मुक्त पानी, पूर्व 55-60 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म के 30-60 µ एल जोड़ें ।
  14. बाद में उपयोग के लिए-८० ° c पर तत्काल उपयोग या स्टोर के लिए बर्फ पर आरएनए रखें ।

3. एक सूक्ष्म मात्रा Spectrophotometer का उपयोग कर आरएनए एकाग्रता बढ़ाता है

  1. आरएनए के लिए spectrophotometer की सेटिंग स्विच.
  2. RNase-नि: शुल्क जल के 1-2 µ l का उपयोग एक रिक् त के रूप में करें ।
  3. आरएनए मात्रा का आकलन करने के लिए प्रत्येक आरएनए नमूना के 1-2 µ एल का उपयोग करें.
  4. २३० एनएम, २६० एनएम और प्रत्येक नमूने के लिए २८० एनएम पर रीडिंग रिकॉर्ड ।
  5. २०० एनजी/µ एल के लिए आरएनए पतला RNase मुक्त पानी का उपयोग ।

4. कुल आरएनए का उपयोग पूरक डीएनए (सीडीएनए) का संश्लेषण

  1. कुल आरएनए के 1 µ g को प्रोटोकॉल 2, 2 µ m oligo (dT), ०.५ mM dNTPs मिक्सचर से मिलाएं और µ से मुक्त पानी के साथ 10 nuclease l तक अंतिम मात्रा में लाएं । इसके लिए, परीक्षण किए जाने वाले नमूनों और नियंत्रणों की संख्या के अनुसार RT-मास्टर-मिश्रण तैयार करें.
    नोट: नियंत्रण है एक शूंय-रिवर्स transcriptase नमूना (-rt) जिसमें rt एंजाइम nuclease-मुक्त पानी के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है (चरण ४.३ देखें) और कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) जिसमें nuclease-मुक्त पानी के बजाय मास्टर-मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया है आरएनए टेम्पलेट.
    1. pipetting द्वारा अच्छी तरह से नमूने मिश्रण एक संक्षिप्त केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया ।
  2. 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर नमूनों की गर्मी बर्फ पर एक 2 मिनट की मशीन द्वारा पीछा किया ।
    1. संक्षेप में नमूनों ट्यूबों के तल में तरल के सभी इकट्ठा करने के लिए ।
  3. 1x रिवर्स transcriptase बफर, १०० यू रिवर्स transcriptase जोड़ें और 20 µ एल nuclease मुक्त पानी का उपयोग करने के लिए प्रत्येक नमूने के अंतिम मात्रा लाने के लिए ।
    1. pipetting द्वारा अच्छी तरह से नमूने मिश्रण एक संक्षिप्त केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया ।
  4. 5 मिनट के लिए ८५ डिग्री सेल्सियस के बाद ६० मिनट के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन ।
  5. nuclease-मुफ्त पानी की एक उपयुक्त मात्रा जोड़कर एक वांछित एकाग्रता के लिए संश्लेषित सीडीएनए पतला और तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर सीडीएनए जगह या बाद में उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।

5. TiLV परम्परागत पीसीआर

  1. सीडीएनए, नमूनों और नियंत्रणों का उपयोग करें, प्रोटोकॉल अनुभाग 4 में उत्पंन एक पीसीआर की प्रतिक्रिया के लिए टेंपलेट्स के रूप में स्थापित प्राइमरी जोड़े में से किसी का उपयोग कर 1 तालिकामें विस्तृत, साथ पसंद की एक डीएनए पोलीमरेज़ के साथ ।
    नोट: एक अतिरिक्त no-टेंपलेट नियंत्रण (एनटीसी) यहां पीसीआर प्रतिक्रिया में nuclease-मुक्त पानी के लिए प्रतिस्थापन सीडीएनए द्वारा शामिल किया जाना चाहिए । एक सकारात्मक नियंत्रण, अगर उपलब्ध है, भी शामिल किया जाना चाहिए पहले से सत्यापित TiLV सकारात्मक नमूनों या उचित TiLV सीडीएनए एक प्लाज्मिड में क्लोन टुकड़ा ।
  2. उपयोग में डीएनए पोलीमरेज़ प्रणाली के दिशानिर्देशों और परीक्षण किए जाने वाले नमूनों और नियंत्रणों की संख्या के अनुसार एक पीसीआर मास्टर-मिश्रण तैयार करें । इस मिश्रण को आगे प्राइमर, रिवर्स प्राइमर, dNTPs, MgCl2 और चयनित डीएनए पोलीमरेज़, इसके बफर के साथ शामिल करना चाहिए ।
  3. चयनित डीएनए पोलीमरेज़ के दिशानिर्देशों के अनुसार, सीडीएनए नमूनों और नियंत्रण नमूनों की सुझाई गई राशि के साथ मास्टर-मिश्रण की निर्दिष्ट मात्रा को संयोजित करें.
    नोट: एक 0.5 x प्रतिक्रिया अतिरिक्त तैयारी अक्सर pipetting के दौरान खो जाता है मास्टर-मिश्रण में से कुछ के बाद से लाभप्रद है ।
  4. उपयोग किया डीएनए पोलीमरेज़ प्रणाली के दिशा निर्देशों के अनुसार और प्रयोग में प्राइमरों के लिए एक उपयुक्त एनीलिंग तापमान का उपयोग कर (तालिका 1) पीसीआर सायक्लिंग शर्तों प्रदर्शन । आमतौर पर, इस तरह के एक कार्यक्रम 2-5 मिनट के लिए ९५ ° c पर एक प्रारंभिक विकार शामिल होगा, विकार के 30-40 चक्र के बाद ९५ ° c 30 एस के लिए, 30 एस के लिए अनुशंसित तापमान पर एनीलिंग और 30 एस के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाव, ७२ डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम बढ़ाव के बाद 5-10 के लिए न्यूनतम.
  5. प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के 5-15 µ एल लोड और एक 1-2% agarose जेल के कुओं में एक उपयुक्त डीएनए सीढ़ी, अपेक्षित पीसीआर उत्पाद आकार पर निर्भर करता है । जेल ट्रो द्वारा प्रवर्धित डीएनए अलग और ethidium ब्रोमाइड (EthBr) द्वारा जेल दाग यूवी प्रकाश का उपयोग कर एक जेल प्रलेखन मशीन में अपेक्षित आकार (टेबल 1) के डीएनए बैंड के दृश्य की सुविधा के लिए ।
    सावधानी: EtBr विषाक्त है; यह उचित सुरक्षात्मक कपड़े और सुरक्षा दस्ताने पहनने के द्वारा देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए ।
लक्ष्य TiLV जीनोम सेगमेंट फॉरवर्ड प्राइमर
5 '-3 '		 रिवर्स प्राइमर
5 '-3 '		 पीसीआर उत्पाद आकार (बी. पी.) टीएम
° c		 मूल संदर्भ
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10 TCCTCTCTGTCCCTTCTGTT CAGGATGAGTGTGGCAGATTAT २७६ ६२ Mugimba एट अल., २०१८

तालिका 1. TiLV सीडीएनए के प्रवर्धन के लिए प्राइमरी जोड़े प्रकाशित समापन बिंदु पीसीआर का उपयोग कर । प्राइमर सेट बोल्ड में दिखाया गया प्रतिनिधि के लिए चित्र 3 ए में दिखाए गए परिणाम उत्पंन करते थे ।

6. TiLV मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR)

  1. एक मानक के रूप में उपयुक्त TiLV जीनोमिक खंड 3 सीडीएनए युक्त प्लाज्मिड का उपयोग करना, जैसे pTiLV३२, एक दोहराया या triplicated 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करते हैं ।
  2. सभी नमूनों के लिए एक qPCR मास्टर-मिश्रण तैयार करें, मानक और नियंत्रण, कि प्रतिक्रियाओं को डुप्लिकेट या तपसिल उपयोग में किया जाना चाहिए खाते में लेने के ०.४ µ l के nuclease-मुफ्त पानी, ०.३ µ एल के फॉरवर्ड प्राइमरी, ०.३ µ l के रिवर्स प्राइमर और 5 µ एल के एल 2x SYBR ग्रीन डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर-प्रतिक्रिया प्रति मिश्रण.
    1. 10 µ एम की एकाग्रता में प्राइमरों का प्रयोग करें, और प्राइमरी जानकारी और मानक pTiLV निंनानुसार:
      फॉरवर्ड प्राइमरी: TiLV-112F (5 '-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3 ')
      रिवर्स प्राइमर: TiLV-112R (5 '-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3 ')
      मानक pTiLV: 10 pg/µ l
      नोट: यदि नमूने और नियंत्रण की कुल संख्या 10 है और triplicates में किया जाएगा, इस समानता के लिए एक qPCR मास्टर-मिश्रण शामिल 12 µ l nuclease-मुफ्त पानी, 9 µ एल फॉरवर्ड प्राइमर, 9 µ एल रिवर्स प्राइमर और १५० µ एल के SYBR ग्रीन डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर-मिश्रण. व्यावसायिक रूप से खरीदा 2x यूनिवर्सल SYBR ग्रीन डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर घोला जा सकता है qPCR प्रतिक्रिया के लिए सभी आवश्यक घटक होते हैं, अर्थात्, SYBR ग्रीन मैं डाई, गर्म शुरू Taq डीएनए पोलीमरेज़, dNTPs, MgCl2 और निष्क्रिय संदर्भ रंजक । प्रकाश से SYBR ग्रीन मास्टर मिश्रण को सुरक्षित रखें ।
  3. qPCR मास्टर के 6 µ एल वितरण-qPCR पट्टी ट्यूबों में मिश्रण या एक ९६ अच्छी तरह से उपयोग में qPCR मशीन के साथ संगत थाली ।
  4. सीडीएनए टेम्पलेट के 4 µ एल जोड़ें, नियंत्रण या ९६ अच्छी तरह से थाली के ट्यूबों या कुओं में प्रश्नपत्र पतला TiLV मानकों.
  5. qPCR ट्यूबों बंद करें या उपयोग में qPCR मशीन के लिए एक संगत प्लेट कवर के साथ ९६ अच्छी तरह से प्लेट सील
    1. धीरे qPCR ट्यूबों झटका समाधान मिश्रण करने के लिए और नीचे qPCR ट्यूबों या ९६ अच्छी तरह से थाली एक केंद्रापसारक का उपयोग करने के लिए जहाजों के तल में तरल के सभी इकट्ठा करने के लिए स्पिन ।
  6. वास्तविक समय थर्मल साइकिल चालक में ट्यूबों या थाली प्लेस ।
    1. कार्यक्रम qPCR thermocycler 3 मिनट के लिए ९५ ° c पर एक प्रारंभिक विकार प्रदर्शन करने के लिए, के लिए ९५ ° c के ४० चक्र के बाद 10 एस और ६० डिग्री सेल्सियस के लिए 30 एस के लिए प्राइमर एनीलिंग और बढ़ाव, एक पिघलने वक्र कदम के साथ समाप्त ६५ ° c के लिए ९५ ° c की एक वृद्धि के साथ ०.५ डिग्री सेल्सियस/ एस.
    2. एक fluorophore डाई के रूप में SYBR का चयन करें, फिर एक नमूना प्रकार के रूप में अज्ञात का चयन करें और एक नमूना नाम बॉक्स में एक नाम डालें ।
    3. आरटी-qPCR मशीन के ढक्कन खोल कर qPCR पट्टी को नियत कुएँ में रखें, फिर ढक्कन बंद कर दीजिये.
  7. चयनित स्थितियों के साथ RT-qPCR परख निष्पादित करें । ढक्कन वांछित तापमान पर पहुंचने के बाद मशीन चलानी शुरू हो जाएगी । प्रत्येक नमूने के प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया की प्रगति की निगरानी करने के लिए प्रत्येक विस्तार कदम के बाद इकट्ठा ।
    नोट: qPCR मशीन और संबंधित सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से परख के सभी मापदंडों की गणना और वास्तविक समय में प्रवर्धन घटता प्रदर्शित करेगा, जबकि मानक वक्र और पिघलने वक्र qPCR चक्र के अंत में उत्पंन किया जाएगा ।
  8. डेटा विश्लेषण और अधिग्रहण पहले सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक नमूने के लिए पिघलने घटता और मानक amplicon के लिए अपेक्षित तापमान पर एक समान चोटी है प्रदर्शन करते हैं ।
    1. नमूनों और मानकों के प्रवर्धन घटता का मूल्यांकन और एक क्षेत्र में सीमा निर्धारित किया गया cDNAs के प्रवर्धन दर सभी नमूनों में एक ही है. यह सामांय रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से किया जाता है, लेकिन ध्यान से जांच की जानी चाहिए ।
    2. मानक वक्र का उपयोग कर TiLV प्रतियां की संख्या की गणना करें ।

Representative Results

खंड 1 में वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, मरणासन्न लाल संकर tilapia TiLV संक्रमण के नैदानिक लक्षण प्रदर्शित (आंकड़ा 1a) लौंग के तेल की एक उच्च एकाग्रता में स्नान द्वारा euthanized थे, जो एक संवेदनाहारी के रूप में कार्य करता है । रिपोर्ट नैदानिक लक्षण चर रहे हैं, लेकिन सामान्य लक्षण सुस्ती दिखाई देते हैं, त्वचा कटाव और disease, exophthalmia, अलग तराजू, खुले घाव/घाव और असामान्य व्यवहार15,16,३३, ३५,३६, इनमें से कुछ को स्पष्ट रूप से चित्र 1aमें देखा जा सकता है । पेट की दीवार जैसे जिगर, तिल्ली या सिर गुर्दे (चित्रा 1b) के रूप में आंतरिक अंगों को इकट्ठा करने के लिए हटा दिया गया था । बलगम के नमूने भी धीरे से पूर्वकाल से त्वचा एक कवर ग्लास या सर्जिकल ब्लेड३७का उपयोग कर मछली के पीछे परिमार्जन द्वारा इस स्तर पर एकत्र किए गए थे ।

Figure 1
चित्रा 1 . Tilapia विच्छेदन और नमूना संग्रह । A. TiLV-त्वचा leisons के साथ संक्रमित लाल संकर tilapia, मुंह और operculum, त्वचा कटाव और corneal अस्पष्टता के आसपास लालिमा । बी(नीले तीर के बिंदु पर) जिगर से ऊतक संग्रह के लिए अनुमति देने के लिए खोदी लाल संकर tilapia, तिल्ली या सिर गुर्दे के अंगों. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इसके बाद, Guanidium Thiocyanate के लिए खंड 2 में विस्तृत प्रोटोकॉल, कुल आरएनए के Phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का पालन किया गया और धारा 3 में उल्लिखित आरएनए ठहराव शुद्धता अनुपात की गणना द्वारा नमूना शुद्धता का आकलन करने के लिए किया गया था और वर्णक्रमीय प्रोफाइल की परीक्षा (चित्रा 2) । चित्रा 2a एक सफल कुल आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया से एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है, जबकि चित्रा बी एक गरीब आरएनए तैयारी का प्रतिनिधित्व करता है. न्यूक्लिक एसिड २६० पर अवशोषक maxima है, जबकि प्रोटीन २८० एनएम पर उनकी है । २६० एनएम और २८० एनएम पर माप का अनुपात प्रत्येक नमूने की शुद्धता का संकेत है और १.९ २.१ के अनुपात शुद्ध आरएनए संकेत के रूप में चित्रा 2aमें नमूना के लिए मामला है । लोअर A260/280 अनुपात में चित्र बी में मनाया संभव प्रोटीन या आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया से phenol संक्रमण बचे हुए संकेत मिलता है । २३० एनएम पर अवशोषक नमूना संदूषण का परिणाम हो सकता है और A260/230 एनएम अनुपात भी इस कारण के लिए गणना की है । चित्रा 2aमें नमूने के लिए २.०३ के एक मूल्य से सचित्र के रूप में शुद्ध आरएनए तैयारी के लिए यह अनुपात 2.0-2.2 की सीमा में होना चाहिए, जबकि चित्रा बी १.०७ के एक कम A260/230 अनुपात है और वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल २४० की ओर २३० एनएम के गर्त में एक पारी से पता चलता है एनएम जो नमूने में अवशिष्ट guanidine या phenol का संकेत है । चित्रा बीमें दिखाए गए नमूने के लिए, पुन: आरएनए के संक्रमण को दूर करने के लिए नमूना की शुद्धता में सुधार हो सकता है.

Figure 2
चित्रा 2 . रोगग्रस्त tilapia ऊतकों से निकाली गई कुल आरएनए की स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ठहराव. a. पवित्रता अनुपात और एक सफल आरएनए तैयारी से वर्णक्रमीय प्रोफाइल. B. एक गरीब आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के प्रतिनिधि को छोड़कर के रूप में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

RT-पीसीआर द्वारा TiLV का पता लगाने के लिए, चित्रा 2a में दर्शाए गए जैसे शुद्ध नमूनों को सीडीएनए में उल्टा (प्रोटोकॉल 4) किया गया था और पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में प्रयुक्त अनुभाग 5 में विस्तृत और प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3ए में दिखाए गए हैं । प्राइमरों तालिका 1 में बोल्ड में दिखाया TiLV जीनोमिक खंड 314के एक ४९१ बीपी टुकड़ा बढ़ाना इस्तेमाल किया गया । पीसीआर उत्पादों जेल ट्रो और दृश्य के लिए EtBr के साथ दाग से अलग किया गया । 3 ए चित्रा एक दो कदम आरटी-पीसीआर के परिणाम से पता चलता है 4 सीडीएनए नमूनों का उपयोग (एस 1-S4), थाईलैंड में अलग रोगग्रस्त tilapia के जिगर से व्युत्पंन, और प्रत्येक नमूने में, लगभग ५०० बीपी की एक साफ एकल बैंड देखा जा सकता है और इस प्रकार, नमूने 1-4 TiLV हैं सकारात्मक. एक ही पीसीआर उत्पाद सकारात्मक नियंत्रण नमूना से प्राप्त किया गया था, TiLV खंड के सीडीएनए शामिल 3 एक प्लाज्मिड३२ में क्लोन जबकि कोई टेंपलेट नियंत्रण (एनटीसी) पीसीआर उत्पादों की उपज नहीं था । चित्र 3 बी में परख के रूप में एक ही प्राइमरों का उपयोग किया गया था, लेकिन एक अलग प्रयोगशाला में, एक कदम आरटी-पीसीआर दृष्टिकोण का उपयोग कर और 5 आरएनए मिस्र जलीय कृषि में उद्भव tilapia के सिर गुर्दे के ऊतकों से व्युत्पंन नमूने के साथ 15. यह पता लगाने परख का उपयोग कर निर्धारित किया गया था कि नमूने 1, 3 और 5 TiLV सकारात्मक रहे हैं, जबकि नमूने 2 और 4 TiLV नकारात्मक है के बाद से कोई पीसीआर उत्पाद सही आकार पर पाया गया । दो ऋण रिवर्स transcriptase नियंत्रण और दो NTCs सहित नकारात्मक नियंत्रण, किसी भी पीसीआर उत्पादों उत्पन्न नहीं किया । एक कदम आरटी-पीसीआर परख भी tilapia ActinB जीन लक्ष्यीकरण प्रदर्शन किया गया । २१७ bp के amplicon आकार हर नमूना (s-S5) में३८अपेक्षित के रूप में उत्पन्न किया गया था । यह एक आरएनए नमूनों की अखंडता के लिए एक नियंत्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से TiLV सकारात्मक नमूनों की अर्द्ध मात्रात्मक परीक्षा के लिए अनुमति परख सेवा की । यह देखते हुए कि उत्पंन Tilapia ActB उत्पाद अपेक्षाकृत बराबर है, तो TiLV विशिष्ट पीसीआर उत्पाद उत्पंन की मात्रा में अंतर एक दिया ऊतक नमूने में TiLV की मात्रा का एक सच प्रतिबिंब के रूप में व्याख्या की जा सकती है ।

Figure 3
चित्रा 3 . TiLV आरटी-पीसीआर । एसीडीएनए रोगग्रस्त tilapia के जिगर के ऊतकों से उत्पादित नमूनों, थाईलैंड से एकत्र TiLV संक्रमण के लिए स्क्रीन 3 खंड के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर रहे थे ( 1 तालिकामें बोल्ड में दिखाया गया है) TiLV का उपयोग कर एक 2 कदम आरटी पीसीआर परख । एम = आधार-जोड़े में दिखाया मार्कर; एस 4-S4 = नमूने 1-4; C1 = सकारात्मक नियंत्रण एक पीसीआर टेम्पलेट के रूप में pTiLV का उपयोग; और C2 = कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी). बीएक कदम आरटी-पीसीआर एक और सिर से रोगग्रस्त tilapia के गुर्दे के ऊतकों से नमूने में के रूप में ही प्राइमरों का उपयोग कर15मिस्र से एकत्र हुए । एम = आधार-जोड़े में दिखाया मार्कर; s-S5 = नमूने 1-5 । नियंत्रण C1-C2 ऋण रिवर्स transcriptase नियंत्रण हैं और C3-C4 NTCs हैं. नीचे पैनल एक एक कदम आरटी-पीसीआर tilapia ActinB३८ के खिलाफ निर्देशित प्राइमरों का उपयोग कर रहा है (विवरण के लिए पाठ देखें) २१७ आधार के एक पीसीआर उत्पाद का निर्माण-जोड़े । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समापन बिंदु पीसीआर के विपरीत चित्रा 3, qPCR परख जो प्रोटोकॉल 6 में समझाया जाता है में प्रतिनिधित्व किया, प्रत्येक पीसीआर चक्र के बाद पीसीआर उत्पाद की राशि को मापने । लक्ष्य डीएनए के प्रवर्धन फ्लोरोसेंट अणुओं है कि प्रतिक्रिया के प्रत्येक दौर से उत्पंन डीएनए के साथ बातचीत का उपयोग कर पाया है । यहां, SYBR ग्रीन मैं डाई का उपयोग किया गया था, जो डबल-कतरा डीएनए के साथ intercalates । फ्लोरोसेंट संकेत प्रतिक्रिया के दौरान पीछा किया और इसकी तीव्रता उत्पाद की राशि का गठन ३९,४०,४१,४२,४३से संबंधित है । TiLV qPCR परख विभिंन देशों से अलग SYBR ग्रीन रिएजेंट, qPCR मशीनों और नमूनों का उपयोग अलग प्रयोगशालाओं में प्रोटोकॉल 6 में वर्णित के रूप में किए गए थे । जिसके परिणामस्वरूप प्रवर्धन घटता चित्रा 4a और 4Bमें दिखाए जाते हैं । यह देखा जा सकता है कि प्रत्येक परख के लिए, प्रयोग के पाठ्यक्रम के चार चरणों: रैखिक जमीन चरण, जल्दी घातीय चरण, देर घातीय चरण और पठार चरण है । रैखिक जमीन चरण प्रारंभिक चक्र के दौरान होता है जहां डीएनए दोहराव अभी तक डीएनए मात्रा अपर्याप्त संकेत का निर्माण/ इस चरण के दौरान आधारभूत प्रतिदीप्ति की गणना की जाती है. इसके बाद, लक्ष्य डीएनए प्रत्येक संकेत उत्प्रेरण चक्र पृष्ठभूमि के ऊपर detectable बनने के लिए और तेजी से वृद्धि के साथ एकाग्रता में दोगुना करने के लिए शुरू होता है । एक अच्छी तरह से अनुकूलित qPCR परख के प्रवर्धन क्षमता (ई) बहुत अधिक है (१००% के पास प्रतिक्रिया की शुरुआत में और प्रवर्धन के इस प्रारंभिक घातीय चरण के दौरान स्थिर रहता है और यह इस बिंदु पर है कि ठहराव किया जाता है, जब प्रतिक्रिया दक्षता अभी भी स्थिर है । बाद के चक्रों में संकेत पठार के लिए शुरू होता है, और प्रतिदीप्ति की तीव्रता अब शुरू टेम्पलेट की प्रतिलिपि संख्या के लिए संबंधित नहीं है क्योंकि प्रतिक्रिया घटकों४४थक रहे हैं. संतृप्ति भी पुनः से प्रतियोगिता के कारण हो सकता है एनीलिंग प्रतिक्रियाओं, घटकों के बदलते एकाग्रता अनुपात, या एंजाइम इकाइयों की राशि के लिए डीएनए सब्सट्रेट अणुओं. संभवतः, इस तरह के मापदंडों चित्रा 4a और 4Bमें दिखाया परख के लिए प्रवर्धन घटता के बीच मतभेदों के लिए खाते । शामिल नियंत्रण इन विशेषता प्रवर्धन घटता उत्पंन नहीं किया ।

Figure 4
चित्र 4 . प्रवर्धन भूखंडों वास्तविक समय पीसीआर परख की अवधि में उत्पाद का संचय दिखाने के लिए । a. TiLV-सकारात्मक थाईलैंड, NTCs, और सकारात्मक प्लाज्मिड नियंत्रण से व्युत्पंन के नमूने के प्रवर्धन घटता एक SYBR-ग्रीन मैं 2 कदम qPCR परख का उपयोग कर । चार्ट सापेक्ष प्रतिदीप्ति (RFU) बनाम चक्र संख्या प्लॉटिंग द्वारा जनरेट किया गया था । B. मिस्र से व्युत्पंन TiLV सकारात्मक नमूनों की प्रवर्धन घटता, चित्र के रूप में बी और एक एनटीसी में । प्रवर्धन वक्र रिपोर्टर निष्क्रिय ROX डाई के प्रतिदीप्ति को सामान्यीकृत संकेत के प्रतिदीप्ति है परख (आरएन) बनाम चक्र संख्या में शामिल थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रत्येक प्रयोगशाला में विभिन्न मशीनों पर qPCR thermocycling के अंत में, डेटा का अधिग्रहण और विश्लेषण किया गया था. चित्र 5 ए और 5B दिखाएं प्रतिनिधि पिघलने से curves परख प्रत्येक प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया । प्रत्येक qPCR मशीन अंत में एक पिघलने वक्र विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए क्रमादेशित किया गया था । इस मक़सद से तापमान में वृद्धि और तापमान के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति की निगरानी द्वारा प्राप्त किया गया था । जब तापमान dsDNA स्वभाव के लिए पर्याप्त उच्च है, प्रतिदीप्ति में एक बड़ी गिरावट दर्ज की गई है क्योंकि fluorophore अणु जारी की है । प्रत्येक qPCR साधन के सॉफ्टवेयर नकारात्मक पहले व्युत्पंन बनाम तापमान (चित्रा 5) की साजिश रचने के द्वारा पिघलने वक्र डेटा से एनीलिंग तापमान (टीएम) की गणना । यह देखा जा सकता है कि चित्रा 5 और 5B में विभिंन नमूना सेट में स्थापित उत्पादों की परख के लिए लगभग ८० डिग्री सेल्सियस की उंमीद तापमान पर एक समान पिघलने संक्रमण है । कम तापमान पर अन्य कोई चोटियों नहीं मनाया गया । उनके छोटे आकार के कारण, प्राइमर के टीएम -dimers आम तौर पर लक्ष्य डीएनए अनुक्रम की तुलना में कम है । इसलिए, टीएमके बीच यह अंतर आसान करने के लिए संभावित प्राइमर-dimers या अंय गैर विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादों की पहचान बनाता है । नियंत्रण TiLV सकारात्मक नमूनों और मानकों की तरह पिघल curves उत्पन्न नहीं किया है और चित्रा 5 ए और 5Bमें चार्ट के तल पर एक लगभग क्षैतिज रेखा के रूप में देखा जा सकता है.

Figure 5
चित्रा 5 . पिघल वक्र विश्लेषण परख विशिष्टता और विभिंन पीसीआर उत्पादों को सुनिश्चित करने के लिए उनके पिघलने सुविधाओं द्वारा विभेदित किया जा सकता है । A. पिघल TiLV-सकारात्मक नमूने थाईलैंड, नकारात्मक नियंत्रण, और सकारात्मक प्लाज्मिड नियंत्रण से शुरू की वक्र विश्लेषण । ख. पिघल TiLV सकारात्मक मिस्र, pTiLV मानकों और एक एनटीसी से व्युत्पंन नमूनों की वक्र विश्लेषण । एक और बी दोनों में चार्ट तापमान में परिवर्तन से विभाजित प्रतिदीप्ति में परिवर्तन दिखाने के तापमान के खिलाफ साजिश रची पिघलने गतिशीलता का एक स्पष्ट चित्र का उत्पादन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सबसे qPCR मशीनों एक सॉफ्टवेयर आगे मूल्यांकन qPCR चलाने की सुविधा के साथ आते है और स्वचालित रूप से चक्र दहलीज (सीटी) pTiLV ' मानक टेम्पलेट के लघुगणक के खिलाफ साजिश रचने के द्वारा एक मानक वक्र पैदा करके नमूनों को मात्रात्मक होगा दो स्वतंत्र प्रयोगशालाओं के लिए चित्रा 6A और घमण्ड में दर्शाए अनुसार प्रतिलिपि संख्या । संक्षेप में, सीटी qPCR परिणामों के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल इकाई है । Ct मान एक सेट थ्रेशोल्ड प्रतिदीप्ति संकेत स्तर तक पहुँचने के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या को नोट । टेंपलेट शुरू करने की अधिक से अधिक राशि, कम चक्र यह एक जासूसी प्रतिदीप्ति स्तर प्राप्त करने के लिए लेता है । दरअसल, TiLV के एक उच्च लोड के साथ नमूनों में एक उप नैदानिक संक्रमण के साथ मछली में जैसे TiLV का एक कम भार के साथ नमूनों की तुलना में कम सीटी मूल्यों होगा. Ct मान को निर्धारित करने के लिए, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर पहले raw डेटा से काट दिए जाते हैं । अगले, qPCR डिवाइस के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से प्रत्येक नमूने के लिए डेटा घटता खोज द्वारा एक प्रतिदीप्ति दहलीज का चयन करें और एक सीटी शामिल जहां नमूना सीमा पार कर का प्रतिनिधित्व करेगा । यह अलग से प्रत्येक परख के लिए किया जाता है और प्रत्येक सीमा सावधानी से मूल्यांकन किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करना है कि दहलीज प्रवर्धन घटता के लघुगणक भाग में और एक जगह है जहां सभी घटता समानांतर कर रहे है पर स्थापित किया गया है । इस प्रकार, विशिष्ट सीटी अधिग्रहीत एक रिश्तेदार मूल्य है और यह शुरू टेंपलेट प्रति संख्या४५के सापेक्ष है, लेकिन यह भी qPCR मशीन और एजेंट इस्तेमाल किया, पीसीआर प्रवर्धन की दक्षता और पता लगाने की संवेदनशीलता के लिए विशिष्ट है । इन मापदंडों अंतर में योगदान 6 चित्रामें एक ही परख का उपयोग कर मनाया ।

मानक वक्र ढलानों (एम) और अवरोधन, प्रवर्धन क्षमता (१०० x (101/एम -1))४६ और प्रतिक्रिया की रैखिकता की गणना सहित प्रतिगमन विश्लेषण, 6 चित्रामें स्टैंडर्ड घटता से प्रदर्शन किया गया । मानक वक्र विश्लेषण भी संवेदनशीलता की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया (सीमा का पता लगाने की), दोहराव और परख के reproducibility । सैद्धांतिक रूप से डीएनए की मात्रा हर पीसीआर चक्र से दोगुनी होती है, जिसका अर्थ है कि दक्षता (ई) १००% के बराबर है । हालांकि, व्यवहार में इस तरह के एक आदर्श दक्षता शायद ही कभी उप-इष्टतम पीसीआर की स्थिति के कारण जैसे, डीएनए पोलीमरेज़ अवरोध, संदूषण, बहुत ज्यादा सीडीएनए और pipetting त्रुटि४७तक पहुंच गया है । आम तौर पर, अच्छा परख के लिए 90-110% से प्रवर्धन ई श्रेणी, चित्रा 6A में ९४.५% की एक दक्षता 8 प्रश्नपत्र पतला pTiLV नमूनों का उपयोग कर गणना की गई थी, जबकि, परख में दिखाया परख आंकड़ा घमण्ड का उपयोग कर 7 प्रश्नपत्र पतला pTiLV नमूने १०१.२% था । १००% से अधिक की एक दक्षता आमतौर पर परख में पीसीआर अवरोधकों की उपस्थिति के कारण है । रैखिक प्रतिगमन मानक प्लॉट का विश्लेषण भी प्रत्येक नमूने में TiLV प्रतियों की संख्या की गणना के लिए अनुमति देता है४१,४२,४५, के रूप में देखा जा सकता है तीन TiLV के लिए चित्र में लाल रंग में दिखाया नमूने जो के नमूनों के लिए परिणामों के साथ लाइन में है एस s, S3 और S5 चित्र में दिखाया बी.

Figure 6
चित्रा 6 . RT-qPCR मानक घटता है. pTiLV के 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने की वास्तविक समय पीसीआर, दोनों प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल मानक । A. 8 प्रश्नपत्र पतला pTiLV नमूनों का परीक्षण किया गया, ज्ञात एकाग्रता के सभी और TiLV प्रतियों की संख्या से संबंधित/ मानक वक्र लॉग प्रति संख्या बनाम सायकल थ्रेशोल्ड (Ct) प्लॉट कर रहा द्वारा जनरेट किया गया था । ढलान =-३.४६२, आर2 = ०.९९९२ और दक्षता ९४.४७% है । B. के रूप में एक में, सिवाय 7 प्रश्नपत्र पतला pTiLV नमूनों (हरा) का परीक्षण किया गया और चार्ट पर सीमा चक्र प्रदर्शित करता है y-अक्ष और TiLV की प्रतिलिपि संख्या (मात्रा) x-अक्ष पर । y-अवरोधन = ३२.३२७, ढलान =-३.२९२, R2 = ०.९८ और दक्षता १०१.२% है । दोनों मानकों के लिए एक और बी में घटता है, ढलान, y-अवरोधन और सहसंबंध गुणांक मान (R2) परख के प्रदर्शन को समझने के लिए उपयोग किया जाता है । महत्वपूर्ण बात, आर2 मूल्य के करीब होना चाहिए 1 के बाद से यह मानक वक्र के रैखिकता का एक उपाय है । ढलान को पीसीआर क्षमता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है जिसमें १००% दक्षता-३.३२ की एक ढलान से मेल खाती है, समीकरण और अधिक विवरण के लिए मुख्य पाठ देखें । एक अच्छी qPCR प्रतिक्रिया आम तौर पर के बीच की एक ढाल के लिए 90-110% correlating के बीच एक क्षमता है-३.५८ और-३.१० । मानक वक्र अज्ञात TiLV सकारात्मक नमूनों की निरपेक्ष ठहराव के लिए प्रयोग किया जाता है और TiLV प्रतियां/प्रतिक्रिया की सही संख्या निर्धारित करता है, के रूप में बी में लाल रंग के तीन TiLV सकारात्मक नमूनों के लिए मामला है

Discussion

TiLV पहले इसराइल14 में २०१४ में बताया गया था और तब से, यह मिस्र, कोलंबिया, भारत, मलेशिया, युगांडा, तंजानिया और थाईलैंड सहित कई देशों में पहचान की गई है15,16,18, ३५ , ४८. वैश्विक जागरूकता, विशेष रूप से, tilapia उत्पादक देशों में वायरस पर अधिक ध्यान रखा गया है और सरकारी अधिकारियों से विभिन्न प्रतिबंधों और नियंत्रण उपायों को TiLV के प्रसार को रोकने के प्रयास को लागू किया गया है. यहां, tilapia ऊतक में TiLV का पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, नमूना संग्रह को कवर, आरएनए अलगाव, सीडीएनए संश्लेषण, पीसीआर और qPCR परख समझाया गया है । इन तरीकों कि विशेष चर्चा वारंट के लिए विभिंन पहलुओं रहे हैं । TiLV कीपहचान की गई है मछली में फैले एक किस्म के आकार9,12,14,15,४९ और tilapia की प्रजातियों अब तक, farmed संकर tilapia सहित (हे । niloticus x ओ. aureus)11,14, नील tilapia (ओ. niloticus)9,10,14,15,16, ३३ , ३५ , ३६ , ४९ , ५० और लाल tilapia (Oreochromis sp.)16,३३,४८,५१, साथ ही जंगली नील नदी में tilapia9,12, काला tilapia५१, zilli14,15, एस. galilaeus, ओ. aureus और टी. simonis मीडिया14 और बहुत हाल ही में TiLV जंगली कार्प में पहचान की गई थी (Barbonymus schwanenfeldii)५२. आंतरिक अंगों से ऊतक के नमूनों (गिल, तिल्ली, जिगर, दिल, सिर गुर्दे) या बलगम३७ स्वस्थ से एकत्र किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से उम्र, आकार या प्रजातियों की परवाह किए बिना मरणासन्न tilapia और आरएनए अलगाव के लिए कार्रवाई की । यहाँ उल्लिखित कुल आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल phenol और guanidinium thiocyanate के एक monophasic समाधान का उपयोग करता है, जो एक chaotropic denaturing एजेंट है । ऊतकों को इस समाधान में सीधे homogenized है क्लोरोफॉर्म और केंद्रापसारक के अलावा चरण जुदाई को प्राप्त करने के लिए जिसमें एक स्पष्ट ऊपरी जलीय चरण युक्त आरएनए, एक चरण और एक कम कार्बनिक चरण उत्पंन होता है । आरएनए isopropanol वर्षा से जलीय चरण से पृथक है, बरामद आरएनए की धुलाई के बाद दूषित पदार्थों से छुटकारा पाने के लिए. इस पद्धति द्वारा आरएनए के अलगाव Piotr Chomczynski और Nicoletta Sacchi द्वारा उठाया गया था और guanidinium thiocyanate-phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण५३,५४के रूप में भेजा गया था । आरएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया एजेंट के इस प्रकार व्यावसायिक रूप से खरीदा या प्रयोगशाला में किया जा सकता है (अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें). यह प्रोटोकॉल सिलिका आधारित शुद्धि जैसे स्तंभ-आधारित पद्धतियों से थोड़ा अधिक समय लेता है, लेकिन सामान्य तौर पर यह अधिक लागत प्रभावी होती है और अधिक आरएनए की पैदावार होती है ।

इस प्रोटोकॉल में, A260 मूल्यों का उपयोग करते हुए आरएनए को रेखांकित किया गया था जिससे spectrophotometry मान आरएनए गुणवत्ता का संकेत कर सकते हैं (A260/A280 = १.९-२.१). हालांकि इस विधि नमूना शुद्धता का एक अच्छा संकेत दे देंगे, यह पूरी तरह से निकाली आरएनए की गुणवत्ता के बारे में सूचित नहीं कर सकते. शाही सेना बरकरार है या आंशिक रूप से नीचा है कि ठीक से निर्धारित करने के लिए, नमूनों agarose जेल ट्रो द्वारा जुदाई हो सकता है जिसमें EtBr दाग 18S और 28S rRNA बैंड के धब्बा आरएनए क्षरण का संकेत मिलता है । आरएनए गुणवत्ता के आगे सत्यापन एक प्रयोगशाला पर एक चिप साधन का उपयोग कर शामिल हो सकते हैं. इसके अलावा, यह भी DNase मैं दूषित मेजबान जीनोमिक डीएनए है, जो बहाव अनुप्रयोगों के आधार पर झूठी परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते है हटाने के लिए के साथ शुद्ध आरएनए पचाने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि मेजबान gDNA अभी भी एक बड़ी हद तक आरएनए नमूना दूषित है, एक अतिरिक्त DNaseI उपचार भी आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के अंत में किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

पूरक डीएनए संश्लेषण बहुत समग्र qPCR परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं और इस विधि का एक पहलू है कि भिन्नता का परिचय कर सकते हैं. सीडीएनए प्रोटोकॉल की वकालत की यहां एक घटक सेट अप oligo (डीटी) का उपयोग कर के शामिल है और इस तरह केवल टाइप polyA पूंछ युक्त mRNAs । यह वास्तव में जो घटक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में उपयोग करने के लिए और सीडीएनए संश्लेषण की इस विधा के उपयोगकर्ता नियंत्रण की अनुमति देता है TiLV का पता लगाने३२के लिए सफल साबित कर दिया । इस सेट अप के लिए एक विकल्प एक व्यावसायिक रूप से खरीदा मास्टर-रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक सभी घटकों से युक्त मिश्रण है और बहुत तेजी से और सरल बिना सामांय बहु कदम, pipetting और बहु तापमान प्रोटोकॉल है । यह लाभप्रद है क्योंकि यह हैंडलिंग को कम करता है और सभी नमूनों में एकरूपता को बढ़ावा देता है । इस तरह के मास्टर घोला जा सकता है अक्सर दोनों oligo (डीटी) और यादृच्छिक प्राइमर यह अलग आरएनए टेम्पलेट्स के लिए लागू है और एक आबादी में RNAs की पूरी लंबाई से अनुक्रम के प्रतिनिधि सीडीएनए प्रतियां सृजन (वायरल और tilapia मेजबान mRNA) और सिद्धांत में शामिल हैं, हर वांछित आरएनए प्रजातियों फिर इस तरह के एक नमूने से पारंपरिक पीसीआर या qPCR द्वारा मापा जा सकता है । इस बहुमुखी प्रतिभा के एक 2 कदम आरटी-पीसीआर दृष्टिकोण का मुख्य लाभ है; यह एक दीर्घकालिक पूल है कि कई विभिंन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदान करता है । परिणामों में, एक कदम आरटी-पीसीआर दृष्टिकोण प्रतिनिधित्व किया गया है जिसमें अनुक्रम विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 1) का उपयोग किया गया और आर टी और पीसीआर एक ट्यूब में प्रदर्शन किया गया (सामग्री सूची देखें) । सामांय में, अनुक्रम विशिष्ट प्राइमर यादृच्छिक भड़काना का उपयोग कर से विशिष्ट लक्ष्य आरएनए की एक उच्च आरटी दक्षता के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन विशिष्ट लक्ष्य आरएनए केवल एक ही है कि इस तरह के एक सीडीएनए नमूना है जो कुछ प्रयोगशालाओं का ही उद्देश्य हो सकता है में quantified जा सकता है (देखें सीडीएनए संश्लेषण उत्पाद सुझावों के लिए सामग्री की तालिका).

जबकि पारंपरिक आरटी-पीसीआर आमतौर पर अब तक TiLV निदान9,13,14,15,16,17,18 में इस्तेमाल किया प्रतीत होता है, ३३ , ३५ , ४८ , ५५. RT-qPCR का पता लगाने और मछली के ऊतकों या बलगम३२,३७में TiLV की छोटी मात्रा के ठहराव के लिए एक अधिक शक्तिशाली उपकरण होने के लिए दिखाया गया है. सामांय में, qPCR व्यापक रूप से अपने उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता, अच्छा reproducibility, व्यापक गतिशील रेंज और21गति के कारण नैदानिक वायरोलॉजी नैदानिक प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है । जबकि qPCR शुरू में और अधिक पारंपरिक आरटी-पीसीआर से लागू करने के लिए महंगा हो सकता है, यह पारंपरिक पीसीआर पर कई महत्वपूर्ण लाभ की पेशकश करता है; यह नमूना से परिणाम के लिए समय के आसपास एक तेजी से बारी है और यह किसी के बाद पीसीआर कदम की आवश्यकता नहीं है । यह बाद बिंदु का मतलब है कि वहां प्रयोगशाला संदूषण के लिए ंयूनतम जोखिम है और यह अधिक आसानी से उच्च प्रवाह स्थितियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जैसे फैलने की स्थिति में । इसके अलावा, यह स्वाभाविक आर टी पीसीआर, जो महत्वपूर्ण महत्व का है उप नैदानिक संक्रमण21में कम वायरल भार का पता लगाने की तुलना में अधिक संवेदनशील है । यह एक नेस्टेड पीसीआर रिवर्स प्रतिलेखन, दो और पीसीआर प्रतिक्रियाओं और फिर agarose जेल ट्रो द्वारा विश्लेषण की आवश्यकता होती दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी । ये कई कदम समय की एक बहुत ले और त्रुटियों या दूषित होने की संभावना बढ़ जाती है । बहरहाल, इसके उच्च संवेदनशीलता के कारण, आर टी-qPCR मांग सावधानीपूर्वक प्रयोगात्मक डिजाइन और सटीक परिणाम५६,५७पैदा करने के लिए ठहराव तकनीकों की एक पूरी तरह से समझ ।

डीएनए बाइंडिंग fluorophore, SYBR ग्रीन मैं इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया गया है । यह एक dsDNA विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी डाई और इस तरह परख की विशिष्टता है प्राइमरों के सेट में पूरी तरह से झूठ है, जो झूठी सकारात्मक५८उत्पंन कर सकते हैं । इसलिए, जबकि dsDNA पिघलने वक्र विश्लेषण प्रत्येक पीसीआर के अंत में प्रदर्शन किया पीसीआर प्रतिक्रिया का एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण हिस्सा है क्योंकि यह पुष्टि करता है कि सही टीएम की केवल एक पीसीआर amplicon का उत्पादन किया है (यह भी जेल से प्राप्त होना चाहिए ट्रो जब नई परख लागू किया जा रहा है) । एक डीएनए टुकड़ा की टीएम अपनी लंबाई, जीसी संरचना, अनुक्रम, किनारा complementarity, एकाग्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बफर घटकों और पीसीआर बढ़ाने पर जैसे सुविधाओं की एक किस्म पर निर्भर है । दो प्रयोगशालाओं से दर्शाए गए प्रतिनिधि परिणामों में पिघलते वक्र विश्लेषणों में प्राइमरी-dimers या अन्य अवांछित पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति का खुलासा नहीं हुआ था, लेकिन यदि यह अन्य नमूनों और/या प्रयोगात्मक सेट-अप के साथ मनाया जाता है, तो परख होनी चाहिए पुनः अनुकूलित । और अधिक उंनत qPCR प्रौद्योगिकियों इस तरह के एक पिघलने वक्र कदम की आवश्यकता नहीं है और वास्तव में, के बाद से इस तरीके कागज, लिखा था एक TaqMan आधारित TiLV आरटी-qPCR दो प्राइमरों और एक जांच यह उच्च TiLV विशिष्ट३४बनाने का उपयोग विकसित किया गया है ।

निस्संदेह, आरटी के लिए डिजाइन प्राइमरों-qPCR परख परख की सफलता के लिए मौलिक है और यहां प्राइमरों३२समय में सार्वजनिक रूप से उपलब्ध TiLV जीनोमिक डेटा पर आधारित डिजाइन किए गए थे । हालांकि, आरएनए वायरस इससव५९के लिए मनाया गया था, के रूप में उच्च उत्परिवर्तन दरों और संभावित उपभेदों वर्तमान नैदानिक परीक्षणों से बच जाएगा प्रदर्शन करने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है । यह हमेशा के लिए इस तरह के वायरस के प्रकार के लिए मुश्किल हो जाएगा एक सार्वभौमिक पैन-TiLV RT-qPCR परख और ऐसे परख केवल लगातार सुधार होगा अगर अधिक TiLV से जीनोमिक डेटा तक पहुंचने स्थानों और समय अवधि उपलब्ध हो उत्पंन करने के लिए ।

अंत में, यह डुप्लिकेट या यदि संभव हो तो चलाने के लिए आवश्यक है, दोनों इंट्रा और अंतर qPCR परख में तपसिल प्रतिक्रियाओं । यदि Ct मान बहुत अधिक है, तो प्रतिकृति का उपयोग विशेष रूप से पता लगाने के लिए कि पीसीआर प्रतिक्रिया विश्वसनीय और reproducible है महत्वपूर्ण है । सामान्य तौर पर, यदि दोहराने प्रतिक्रियाओं से डेटा ०.५ चक्र से अधिक भिन्न होता है, प्रतिक्रियाओं दोहराया जाना चाहिए और सीटी मूल्यों लगातार भिन्न होता है > ०.५ चक्रों में प्रतिकृति, परख फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए. एक एकीकृत qPCR pipetting रोबोट का उपयोग इस मुद्दे के साथ बेहद मदद करता है, लेकिन यह एक लक्जरी उपकरण है । किसी भी प्रयोग के साथ के रूप में, समावेश पर्याप्त और उचित नियंत्रण मजबूत आणविक परख के विकास के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैं, विशेष रूप से नैदानिक प्रयोगशालाओं में जहां ऐसे परख के लिए मांयता प्राप्त है । नियंत्रण सकारात्मक (सकारात्मक TiLV नमूना, TiLV प्लाज्मिड मानक) और नकारात्मक नियंत्रण (एनटीसी और आरटी) नमूने के रूप में अच्छी तरह से अंतर्जात tilapia गृह व्यवस्था जीन का पता लगाने के रूप में शामिल करना चाहिए । इस तरह के नियंत्रण को कम करके आंका नहीं जा सकता है और प्रत्येक परख में शामिल किया जाना चाहिए ठीक से परख के हर कदम की गुणवत्ता को समझने के लिए और ठीक से परिणाम की व्याख्या ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनके समर्थन के लिए पशु चिकित्सा वैक्टीरिया, Vetsuisse संकाय, बर्न विश्वविद्यालय के संस्थान के लिए आभारी हैं । इस काम के Vetsuisse संकाय में जल्दी कैरियर शोधकर्ताओं और लैंगिक समानता के अकादमिक संवर्धन के लिए समिति द्वारा वित्त पोषित किया गया, १२०% मॉडल अनुदान द्वारा बर्न के विश्वविद्यालय PN को संमानित किया । WS और पीआर कृषि और खाद्य के लिए उंनत अध्ययन के लिए केंद्र द्वारा समर्थित हैं, उंनत अध्ययन के लिए संस्थान, Kasetsart विश्वविद्यालय, बैंकॉक, उच्च शिक्षा अनुसंधान संवर्धन और थाईलैंड के राष्ट्रीय अनुसंधान विश्वविद्यालय परियोजना के तहत थाईलैंड, कार्यालय उच् च शिक्षा आयोग, शिक्षा मंत्रालय, थाइलैंड । हम वीडियो संपादन के लिए उसके कथन और Piyawatchara Sikarin के लिए Dr. Kwanrawee Sirikanchana शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue collection Step 1
Tricaine methanesulfonate Sigma-Aldrich E10521 An alternative to clove oil. 
Step 1.1
RNAlater stabilization solution Thermo Fisher Scientific   AM7020 For storing tissues if they cannot be processed immediately
Step 1.3
RNA extraction Step 2
TRIreagent Sigma-Aldrich  Step 2.1
TRIzol Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) 15596026 Step 2.1
GENEzol Geneaid GZR100 Step 2.1
Trisure Bioline BIO-38032 Step 2.1
Homemade solution  -  - 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate
30.45 g/L  (400 mM) ammonium thiocyanate
8.20 g/L  (100 mM) sodium acetate
380 mL/L  (38 % v/v) phenol
50 mL/L (5 % v/v) glycerol
1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0
Store up to 2 years at 4oC
Step 2.1
MagNA Lyser Green Beads Roche 3358941001 An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below
Step 2.2
Lysing Matrix D, 2 mL Tube MP BIOMEDICALS 116913050
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Step 2.3
Chloroform RCI Labscan AR1027E-G2.5L Step 2.3
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B9673 A less toxic alternative to chloroform
Step 2.3
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % Sigma-Aldrich 59300 Step 2.6
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.09634.2500 Step 2.6
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) R0551 Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation
optional
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % Sigma-Aldrich (EMD Millipore) 1.00983 Step 2.9
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) Merck (EMSURE) 1.00983.2500 Step 2.9
Nuclease-free water Promega P1193 Step 2.13
Nuclease-free water Multicell 809-115-CL Step 2.13
Ambion TURBO DNA-free kit  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) AM1907 Can be performed at the end of the RNA extraction protocol
optional
cDNA synthesis Step 4
Viva cDNA Synthesis Kit Vivantis cDSK01 Step 4.1 & 4.3
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover Toyobo A1172K An alternative option 
see discussion
ReverTra Ace qPCR RT Kit Toyobo FSQ-101 An alternative option 
see discussion
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase  Agilent Technologies 600107 An alternative option 
PCR Step 5
DNA polymerase systems: Step 5.2
   - Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X)  Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)  14001012a Step 5.2
   - GoTaq Mastermix Promega M7122 Step 5.2
Separate PCR mixture components: Step 5.2
10mM dNTP Mix Vivantis NP2409 Step 5.2
25mM MgCl2 Thermo Fisher Scientific R0971 Step 5.2
10X Taq Buffer with KCl Thermo Fisher Scientific 00348114 Step 5.2
Taq DNA polymerase Vivantis PL1202 Step 5.2
   - Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq Thermo Fisher Scientific  AB1454 One step RT-PCR exemplified in Figure 3B
Gel electrophoresis: For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) Thermo Fisher Scientific 17898 Step 5.5
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: Step 5.5
   - Tris Vivantis PR0612-1KG Step 5.5
   - Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) Merck KGaA (EMSURE) 1.00063.2500 Step 5.5
   - Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BIO-RAD 161-0729 Step 5.5
Agarose Vivantis PC0701-100G Step 5.5
DNA ladders and markers Vivantis NL1405 Step 5.5
DNA gel loading dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611 Step 5.5
qPCR Step 6
PowerUP SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) A25779 Exemplified in Figures 4-6B
Step 6.2
iTaq Universal SYBR Green Supermix BIO-RAD 1725120 Exemplified in the video and in Figures 4-6A
Step 6.2
Equipment 
Dounce tissue grinder pestle Sigma-Aldrich P1110 Protocol 2
MagNA Lyser Instrument Roche 3358976001 An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above
Step 2.2
FastPrep-24 5G Homogenizer MP BIOMEDICALS 116005500
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5427R Protocol 2
Step 2.4, 2.7 & 2.10
Refrigerated microcentrifuge Eppendorf Eppendorf 5418R
Heat box Labnet AccuBlock Digital Dry Bath Protocol 2
Step 2.13
Microvolume spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) Nanodrop 2000 Protocol 3
Step 3.1 - 3.4
PCR machine BIO-RAD T100 Thermal Cycler Protocol 5
Step 5.4
Power supply BIO-RAD PowerPac HC Protocol 5
Step 5.5
Horizontal gel electrophoresis BIO-RAD Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu Protocol 5
Step 5.5
Mini microcentrifuge Corning LSE 6766 Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6
Step 6.5.1
Microcentrifuge LioFuge LM-60 Step 6.5.1
qPCR machine and software Thermo Fisher Scientific 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 Protocol 6
Step 6.6-6.8
qPCR machine and software BIO-RAD CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software
General Materials 
Mayo scissors Step 1.1-1.2
Forceps Step 1.1-1.2
Pipette Rainin Pipette-Lite XLS
Aerosol-barrier pipette tips Sigma-Aldrich Z333328, Z333336, Z333344
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes Eppendorf

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पर्यावरण विज्ञान अंक १४१ Tilapia लेक वायरस Tilapia निदान आरटी-पीसीआर आरटी-qPCR orthomyxo-जैसे वायरस
पारंपरिक आरटी-पीसीआर और SYBR ग्रीन आरटी-qPCR का उपयोग कर Tilapia झील वायरस का पता लगाने
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Nicholson, P., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR. J. Vis. Exp. (141), e58596, doi:10.3791/58596 (2018).

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