À l’aide de contenu élevé d’imagerie afin de quantifier l’Engagement de cibles en cellules adhérentes

Lors de l’élaboration de nouveaux médicaments ou sondes chimiques, il est indispensable de coupler l’effet pharmacologique observé ou lecture fonctionnelle aux mesures de l’occupation de la cible ou l’engagement dans des cellules vivantes^1,2,3. Ces données sont nécessaires pour s’assurer que la petite molécule a en effet atteint sa cible recherchée tant pour valider l’hypothèse biologique derrière la protéine cible sélection^4,5. En outre, au cours du développement de médicaments, systèmes de modèles de complexité croissante servent à sélectionner et à corroborer un chef de file avant les essais cliniques. Pour confirmer la traduction de biologie dans l’ensemble de ces systèmes précliniques, les méthodes pour tracer les fiançailles de drogue-cible et accompagnant la biologie tout au long de ce processus de développement sont essentiels.

Engagement de drogue-cible est traditionnellement difficile à surveiller dans des cellules vivantes avec tétrahydrofuraniques de petites molécules et des protéines, notamment au niveau unicellulaire avec une résolution spatiale de^6,7. Une méthode récente pour observer l’interaction entre tels quels médicaments et protéines dans des cellules vivantes est l’analyse de cellulaire décalage thermique (CETSA) dans lequel stabilisation induite par le ligand d’une protéine native en réponse à un défi de chaleur est quantifiée^{8, 9,10}. Ceci est accompli en quantifiant les protéines solubles restantes après exposition à une épreuve de la chaleur. Dans la notification initiale de CETSA, tache occidentale a été utilisée pour la détection. Pour activer les campagnes de dépistage et a frappé le triage des plus grandes collections de composés, efforts pour augmenter le débit de CETSA expériences ont conduit à l’élaboration de plusieurs essais homogènes, axée sur la microplaque^10,11. Toutefois, une limitation avec ces méthodes est qu’elles sont actuellement mieux adaptées à un traitement composé des suspensions cellulaires et la détection exige la lyse cellulaire, conduisant à la perte de l’information spatiale. CETSA peut être appliqué expérimentalement soit comme un changement induite par le ligand température agrégation thermique (T_tot.) à une concentration unique de la petite molécule ou la concentration de ligand nécessaire pour stabiliser la protéine à une seule température. Ce dernier est appelé empreintes de réponse dose isotherme (ITDRF) pour signifier la dépendance à l’égard de ces mesures sur les conditions expérimentales spécifiques.

Le but du présent protocole est de mesurer l’engagement de cibles à l’aide de CETSA dans les cellules adhérentes de détection des anticorps par immunofluorescence (IF) avec la microscopie haute teneur¹². Cette procédure s’étend la plate-forme CETSA originale permettant la quantification unicellulaire de l’engagement de cibles avec conservation de la localisation subcellulaire. En particulier, contrairement à nombreux rapports précédents, dans cette procédure composé traitement est effectué dans des cellules vivantes adhérentes sans détachement de surface ou de lavage avant le défi de la chaleur, afin de préserver l’équilibre de liaison établis que nous voulons mesurer¹³. Actuellement, la méthode est validée pour une cible protéine p38α (MAPK14) en plusieurs lignées de cellules, et nous espérons qu’en partageant cette procédure la technique peut être appliquée largement à travers la fusion proteome. Nous prévoyons que ce protocole peut être adaptée dans l’ensemble du pipeline de développement de drogue de dépistage, hit triage grâce au suivi de cible engagement in vivo.

1. ensemencement de cellules

Remarque : Pour un aperçu général du flux de travail Voir la Figure 1. Une liste détaillée des matériels et réactifs sont disponibles dans la Table des matières.

1. Avant le semis des cellules, percer des trous avec un foret standard dans le cadre de 384 puits d’imagerie dosage plaques noires pour éviter les bulles d’air étant pris au piège sous la plaque plus tard au cours de l’étape de chauffage. Pour éviter des particules en plastique qui entrent dans les puits au cours de cette étape et pour maintenir des conditions stériles, sceller les plaques avec une feuille d’aluminium adhésive ou couvrir la plaque avant de le faire sous une hotte de culture de tissus. En général, 3 trous d’un diamètre de 3,5 mm sur chaque côté de la plaque (bords courts) suffisant.
2. Préparer un banc de flux laminaire en le nettoyant avec l’éthanol à 70 %. Suite à des techniques de culture de tissu aseptique standard, enlevez média flacon cellulaire ou plat. Laver les cellules avec 5-10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis ajoutez la trypsine 2 mL au ballon. Incuber le ballon à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules A-431 se détachement. Compter les cellules soit en utilisant un compteur hémocytomètre ou cellulaire. Préparer une suspension cellulaire de 50 000 cellules/mL dans le milieu de culture.
3. Administrer 40 µL de suspension de cellules (qui donne une densité de cellules final de 2 000 cellules / puits) dans chaque puits d’une plaque d’essai à l’aide d’un distributeur de réactif en vrac ou une pipette multicanaux, selon l’importance de l’expérience. Brièvement, déplacez le plateau de côte-à-côte pour disperser les cellules uniformément sur le fond de la plaque.
4. Pour minimiser les effets de bord de la plaque, laissez les cellules à s’installer au bas de la plaque d’essai pendant 20 minutes à température ambiante dans le dos de la hotte à flux laminaire. Ensuite, placer la plaque dans un récipient en plastique avec un essuie-tout humide afin d’assurer une atmosphère humide. Avant utilisation, nettoyez le récipient en plastique avec l’éthanol à 70 %.
5. Incuber la boîte avec la plaque de test pendant 2 ou 3 jours à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié classique. Surveiller la confluence des cellules jusqu'à 50-75 %, tel qu’évalué par l’inspection visuelle avec un microscope optique.

2. composé de traitement

1. Le jour de l’expérience, aspirer le milieu de chaque bien en utilisant un laveur de plaques. Placer la plaque sur le laveur de plaques et sélectionnez le programme de l’aspiration. Si un laveur de plaques n’est pas disponible, le liquide peut être retiré en inversant la plaque avec un coup de main rapide sur un évier ou bac à déchets. L’élimination complète du liquide est essentielle pour de bonnes performances. Tout le liquide en excès est ensuite retiré en tamponnant avec du papier absorbant.
2. Ajouter 30 µL de composés diluée à la concentration appropriée dans le milieu de culture cellulaire à l’aide de distribution automatisé ou une pipette multicanaux selon l’importance de l’expérience. Vérifier que vous ajoutez un négatif (DMSO) et le contrôle positif (ligand connu) à plusieurs puits sur chaque plaque de test. Puisqu’il s’agit d’une analyse de décalage thermique, il est nécessaire que la concentration du composé est supérieure à la constante de dissociation pour observer la stabilisation de la protéine. Ainsi, une indication approximative pour la concentration en composé est 50 à 100 fois la ci₅₀, mais plus en détail pour les concentrations de composés sont décrites dans la section « Discussion ».
   Remarque : La tolérabilité de DMSO des lignées cellulaires doit être testée avant l’expérience.
3. Joint de la plaque de dosage composé-traitait avec une plaque respirante sceller et incuber à 37 ° C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié pendant 30 minutes.

3. Faites chauffer Challenge

1. Tout d’abord, définir le bain d’eau à la température souhaitée. Notez que la température finale qui intervient à l’intérieur du puits de la plaque d’essai peut être différente de la température finale dans un bain-marie. Étudier au préalable le décalage avec un thermomètre à plaque et thermocouple factice. En général, il faut 30 minutes pour le bain pour se stabiliser à la température désirée.
2. Pour vérifier que la température désirée est atteinte dans les puits de la plaque de test lors de l’étape de chauffage, préparer une plaque factice non scellée contenant le même volume de milieu que la plaque de test.
3. Enlever les plaques de dosage de l’incubateur. Décoller le joint respirant et refermer la plaque d’essai contenant les cellules traitées composé avec un papier d’aluminium adhésive serré pour s’assurer que l’eau ne fuira dans les puits pendant le chauffage subséquent dans l’eau du bain. Vérifiez que les orifices percés dans le cadre de la plaque sont accessibles.
4. Placer les plaques de dosage et le mannequin dans le bain d’eau avec le fond de la plaque inclinée vers la surface de l’eau pour forcer tout air restant dehors sous les plaques.
5. Surveillez la température à l’intérieur du puits d’une nouvelle plaque factice à l’aide d’un thermomètre à thermocouple.
6. Faire chauffer la plaque de test dans le bain d’eau pendant 3 minutes. Transférer immédiatement le dosage et la plaque factice pour un autre bain marie avec chambre trempé de l’eau se refroidir pendant 5 minutes. La plaque de test est maintenant prête pour un traitement ultérieur.

4. fixation

1. Pipeter paraformaldéhyde à 16 % (p/v) 10 µL (PFA) directement sur la plaque d’essai à l’aide d’un distributeur de réactif en vrac ou une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
   Remarque : Certains fixatifs sont classés comme cancérogènes et institutionnels consignes de sécurité doivent être suivies.
2. Aspirer la solution PFA et laver les cellules avec 300 µL PBS à l’aide d’un laveur de plaques. Placer la plaque sur le laveur de plaques et sélectionnez le programme de l’aspiration.
   Remarque : Cette procédure a été optimisée en utilisant un protocole de débordement sur la rondelle plaque dans laquelle liquide est en même temps distribué et enlevé. Si une procédure similaire ou un laveur de plaques n’est pas disponible, l’étape de lavage peut alternativement être faite manuellement.
3. Procédure de lavage manuel : Retirer le liquide provenant des puits en retournant la plaque avec un coup de main rapide sur un évier ou bac à déchets. L’élimination complète du liquide est essentielle pour de bonnes performances. Ajouter 80 µL de PBS avec une pipette multicanaux et inverser la plaque à nouveau comme décrit ci-dessus, répétez la procédure de nettoyage deux fois. Après le dernier lavage, séchez la plaque contre un essuie-tout propre pour enlever tout excès de liquide.

5. perméabilisation

1. Ajouter 20 µL de 0,1 % (v/v) : NP-40 pour les puits avec une pipette multicanaux et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Laver les cellules utilisant la même procédure comme décrit plus haut (étape 4.2).
2. Autrement, le cas échéant, appliquer un protocole de récupération de l’antigène, par exemple:
   1. Ajouter 20 µL du SDS de 1 % dans les puits avec une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant 5 minutes et lavez selon la procédure décrite ci-dessus (étape 4.2).
   2. Ajouter 80 μL de glycine de 10 mM à pH 7,2 et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirer la solution de glycine à l’aide d’un laveur de plaques en plaçant sur le laveur de plaques et de sélectionner le protocole de l’aspiration. Voir les notes aux points 2.1 et 4.2 Si un laveur de plaques n’est pas disponible.

6. blocage

1. Ajouter 15 µL de 1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS dans les puits à l’aide d’un distributeur de réactif en vrac ou une pipette multicanaux. Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 heure ou toute la nuit à 4 ° C, avec un joint de la plaque d’aluminium foil.

7. primaire anticorps

1. Aspirer la solution de blocage à l’aide d’un laveur de plaques en plaçant sur le laveur de plaques et de sélectionner le protocole de l’aspiration. Voir les notes aux points 2.1 et 4.2 Si un laveur de plaques n’est pas disponible.
2. Ajouter 10 µL d’anticorps primaire dilué en conséquence à 1 % (p/v) BSA dans du PBS dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 heure ou toute la nuit à 4 ° C, avec un joint de la plaque d’aluminium foil.

8. secondaires anticorps

1. Aspirer la solution de l’anticorps primaire et laver les puits selon la même procédure comme décrit plus haut (étape 4.2).
2. Ajouter 10 µL de Alexa 488 anticorps secondaire dilué en conséquence à 1 % (p/v) : BSA dans du PBS. Incuber à température ambiante pendant 1 heure. Sceller la plaque avec un opercule en aluminium adhésif pour protéger de la lumière.
   NOTE : Protéger la plaque de la lumière pendant ce temps et les étapes suivantes.

9. coloration nucléaire et masque cellulaire

1. Ajouter 10 µL de colorant nucléaire dilué à 0,05 mg/mL dans du PBS dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant encore 10 minutes.
2. Aspirer la solution de Hoechst et un anticorps secondaire et laver les puits à l’aide de la même procédure comme décrit plus haut (étape 4.2).
3. Ajouter 10 µL de cellules masque dilué à 200 ng/mL dans du PBS dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
4. Aspirer la solution de masque cellulaire et laver les puits à l’aide de la même procédure comme décrit plus haut (étape 4.2).
5. Distribuer 60 µL de PBS dans tous les puits à l’aide de la rondelle de la plaque, un distributeur de réactif en vrac ou une pipette multicanaux et scelle les plaques avec une feuille d’aluminium adhésive.

10. Acquisition et analyse d’images

1. Capturer des images sur un imageur contenu élevé en utilisant 3 canaux fluorescent : DAPI (387/447), GFP (472/520) et TexasRed (562/624). Acquisition de 4 images / puits utilisant l’objectif 10 X. Utiliser l’autofocus automatique laser et appliquez binning 2 lors de l’acquisition. Stocker des images comme fichiers tiff 16 bits, gris en échelle ainsi que des métadonnées.
2. Analyser les images à l’aide de logiciels disponibles. Identifier les limites d’une cellule utilisant un algorithme de cellule marquant avec DAPI (noyau) et TexasRed (cytoplasme).
3. Extrait d’intensité moyenne pour toutes les longueurs d’onde acquises pour une analyse ultérieure des données.
4. Calculer le facteur Z afin d’assurer la robustesse du dosage.
5. Calculer le % de stabilisation à l’aide de la formule suivante : 100 * (1-(bien intensité – intensité moyenne des puits témoin négatif) / (moyen régulateur d’intensité positive control-moyenne intensité négative)). Voici contrôle négatif et de DMSO et contrôle positif est la substance de référence. Étant donné que la stabilisation maximale entre les composés peut varier et en fait être plus grande que le contrôle positif pour les courbes de ITDRF, les intensités maximales et minimales de stabilisation pour chaque composé sont parfois utilisées en lieu et place les valeurs d’intensité des puits de contrôle .

Le protocole décrit dans la Figure 1 décrit le workflow de base pour l’exécution des essais CETSA sur des cellules adhérentes avec détection de protéines solubles restantes en imagerie contenu élevé. Ce flux de travail peut être facilement adapté à tous les stades de développement de l’analyse en modifiant le schéma des composés ou des réactifs14. Nous détaillons les résultats escomptés car plusieurs prévoit utilisent cas ci-dessous.

Identification d’anticorps et le développement de l’analyse. Une condition sine qua non pour obtenir des résultats est l’identification d’un anticorps primaire ou autre réactif approprié d’affinité qui reconnaît sélectivement la forme native de la protéine en présence de la protéine agrégée et précipitée formée lors de la manche défi à l’étape 3. Pour établir le dosage d’imagerie CETSA décrit ici, nous avons projeté un panel de 9 anticorps ciblant p38α à 52° C pour la fenêtre de signal entre les contrôles positifs et négatifs. Nous avons ensuite titré les anticorps meilleurs et s’installèrent sur les modalités indiquées dans la Figure 2 A, B , représentant des images d’immunofluorescence pour p38α stabilisé par un ligand connu (contrôle positif) et DMSO (témoin négatif). Reconnaissance des anticorps ne devrait également pas être perturbée par les changements de conformation de la protéine cible qui peut être induite par le ligand liant (Figure 2). Par exemple, BIRB796 a une longue sur tarif et quantification de l’engagement de cibles n’est possible en appliquant une étape de récupération de l’antigène (5.2 ; Figure 2D). Il est important de valider la performance de l’anticorps primaire avec des ligands connus couvrant différents accepteurs de la protéine cible si elle est disponible. La validation d’anticorps se faite préférablement avec et sans l’étape de récupération de l’antigène.

Tagg et courbes ITDRF. Comme mentionné ci-dessus, CETSA expériences peuvent être exécutés dans deux modes différents, les courbesagg T et les expériences ITDRF. Les deux variantes utilisent le même protocole de base est indiqué à la Figure 1 dans la section protocole. Dans la première configuration, le but est de contester les cellules avec un gradient de température et de comparer les courbes deagg T en présence et en absence d’une concentration unique de ligand. Pour effectuer une courbe deagg T, plaques séparées sont chauffés pendant 3 minutes dans un éventail de températures. Dans le cadre de cette expérience, il est important de chronométrer la durée de traitement composé pour chaque plaque avec le temps qu’il faut pour le bain d’eau se stabilise à la nouvelle température. À cet égard, réaliser le défi de chaleur pas dans l’eau du bain est plus long que le chauffage des tubes dans une machine PCR. Le chemin expérimental correspond à des courbes de réponse de concentration exécution prochaines d’un ligand à une température fixe de générer des courbes ITDRF. En général, lorsque vous testez plusieurs composés, dosage plaques prêtes pour l’ajout de composés sont préparés selon manutention automatisée de liquide pour atteindre les données plus reproductibles. Composés sont dilués en série dans le DMSO et ensuite dissous dans les milieux de culture cellulaire à la concentration désirée. Nous avons testé typiquement série de concentration de 11 points à partir de 50-100 µM de dilution de pli de 3 ou 4, mais cela dépend de la puissance des ligands utilisés. Il est conseillé d’abord tracer la courbed’agg T tant en absence et en présence d’un ligand et de choisir la température pour des expériences isothermes subséquentes où vous pourrez observer un décalage entre les courbes. La température choisie devrait être autour ou juste au-dessus de Tagg. Les deux formats permettent pour la confirmation de l’engagement de la cible, mais pour le classement des composés affinités ITDRF expériences sont souvent plus adapté. Figure 3 a montre une illustration des résultats quantifiés attendus pour une courbe deagg T et Figure 3 b quantifie les résultats d’une expérience typique de ITDRF.

Campagne de dépistage. Le protocole peut également être adapté aux campagnes pour identifier de nouveaux liants de la protéine cible de contrôle. Dans ce cas, défis de chaleur isothermes sont appliqués pour un grand nombre de composés à une seule concentration, suivi par des expériences de ITDRF pour des composés de stabilisation identifiés. Nous préparons test dépistage prêt plaques et transférer les composés dilués dans des milieux de culture pour les plaques de dosage utilisant la gestion automatisée de liquide. Comme avec tous les essais de stabilité thermique, il est nécessaire de dépasser la constante de dissociation pour observer la stabilisation de la protéine, et donc nous avons appliqué des banques de petites molécules à 50 µM pour faciliter l’identification de succès. Triage des succès à l’aide de ITDRF permettra plus tard de classement et hiérarchisation de ces composés. La figure 4 montre un résultat représentatif d’une plaque de dépistage.

Figure 1 . Aperçu schématique du protocole décrit dans cet article. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 . Développement d’identification et dosage anticorps. A) données d’exemple pour la détection de p38α humaine dans les cellules A-431. Des images représentatives de positif (1 µM AMG548) et négatifs (DMSO) contrôles. Rouge - la coloration des noyaux Hoechst, coloration vert-p38α. Images prises avec un grossissement de X 10 ; la barre d’échelle blanche représente 73 µm. B) exemple de données quantifiées, exprimées en moyenne intensité/cellule. Barres d’erreur représentent écart-type de la moyenne de 16 répétitions pour 6 plaques séparées. Chaque plaque a été chauffé à 52 ° C dans un bain d’eau suivi de la fixation des cellules, perméabilisation et immunostaining ultérieur. Intensité du signal Immunofluorescence C) mesurée après traitement de cellules A-431 avec 1 µM BIRB796 ou le DMSO comme décrit plus haut suivi directement par la fixation. En l’absence d’une étape de chauffage, le signal de BIRB796 est plus faible que le signal de DMSO, suggérant que BIRB796 perturbe la détection de p38α avec cet anticorps. D) courbesCETSA ITDRF pour les cellules traitement avec BIRB796 soit avec (triangle bleu) ou sans protocole de récupération de l’antigène (triangle gris). Ce chiffre a été modifié par Axelsson et coll. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 . Thermique agrégation et ITDRF experiments. A) expériences de courbe d’agrégation thermique des cellules traitement avec le positif (1 µM AMG548, en orange) et négatif des contrôles (DMSO en gris). Barres d’erreur représentent écart-type de la moyenne de 32 ou 464 répétitions. B) expérienceCETSA ITDRF effectuée à 52 ° C pour les cellules traitées avec des dilutions de SB203580 en bleu, Skepinone-L en vert et RWJ67657 en rouge. Barres d’erreur représentent écart-type de la moyenne des 6 répétitions. Données quantifiées sont exprimées en moyenne intensité/cellule et normalisées contre la plus forte concentration de composés respectifs. Ce chiffre a été modifié par Axelsson et coll. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 . Un aperçu représentatif d’une plaque de dépistage à un grossissement de 10 X. Les témoins positifs (1 µM AMG548) sont dans les colonnes 2 et 24 et du contrôle négatif (DMSO) dans les colonnes 1 et 23. Tous les autres puits contiennent 50 µM des Bibliothèque composés utilisés pour le dépistage avec plusieurs hits dénotés. Dans les figures de l’encart, la ligne blanche dans le coin inférieur droit représente 200 µm. Ce chiffre a été modifié par Axelsson et coll. 201812. Copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont aucune divulgation au rapport.