Analyse af Shear Flow-induceret Migration af Murine Marginal Zone B-celler In Vitro
Summary
Marginal zone B celler (MZBs) reagere på kraften af shear flow ved re orientere deres overflytningssti op for strømmen. Denne protokol viser, hvordan man registrere og analysere migration ved hjælp af en fluidics enhed, pumpe, mikroskop billedbehandlingssystem og fri software.
Abstract
Marginal zone B celler (MZBs) er en befolkning af B-celler, der findes i de mus milt marginale zoner, at indhylle follikler. For at nå follikler, skal MZBs overflytte op shear kraften af blodgennemstrømningen. Vi præsenterer her en metode til at analysere dette flow-induceret MZB migration in vitro. Første er MZBs isoleret fra mus milten. Det andet er MZBs fast på integrin ligander i flow kammer dias, udsat for shear flow, og afbildet under et mikroskop under overflytning. Tredje, billeder af de overfører MZBs behandles ved hjælp af den MTrack2 automatiske celle tracking plugin for ImageJ, og de resulterende celle spor er kvantificeret ved hjælp af værktøjet Ibidi chemotaxis. Overførselsdataene afsløre hvor hurtigt cellerne bevæger sig, hvor ofte de skifter retning, om shear flow vektor påvirker deres migration retning og hvilken integrin ligander er involveret. Selv om vi bruger MZBs, kan metoden let tilpasses til at analysere migration af enhver leukocyt, der reagerer på kraften af shear flow.
Introduction
Immunceller er de mest motile celler i den menneskelige krop og ofte skal slås med shear kraft fra blod og lymfe flow. Men der er forholdsvis få undersøgelser på shear kraft-induceret migration af leukocytter1,2,3,4,5. Her præsenterer vi en pålidelig og kvantitative protokol for at analysere svar af en immun celle til flow in vitro. Udfører analysen kræver ikke fabrikation af komponenter, og alt udstyr og forbrugsmaterialer er kommercielt tilgængelige. Protokollen, herunder celle rensning og migration analyse, kan udføres på en enkelt dag. Endelig, selv om vi beskrive migration af marginale zone B-celler (MZBs), protokollen kan tilpasses for at analysere migration mod strømmen af andre typer af immunceller. Derfor er det muligt at bruge denne analyse til systematisk analysere en bred vifte af leukocytter med en omfattende panel af betingelser.
MZBs er en befolkning af B-celler, der i musen, findes kun i milt og transport mellem indre af follikler og marginale zoner6,7,8,9. Den marginale zone er et lag af immunceller ca 5-10 celler tykke. Cellelag indhyller hårsækken og består primært af MZBs og makrofager, men også invariante natural killer T (iNKT) celler, dendritiske celler (DCs) og neutrofiler, blandt andre10. Cellerne i den marginale zone er udsat for ensrettet blodgennemstrømning med oprindelse fra milt arterier, der afsluttes i en marginale sinus omkring hårsækken. Blodet løber fra huller i den marginale sinus gennem den marginale zone og derefter indsamlet i venøse bihuler i den røde papirmasse og restaureret til omsætning11. Gratis strømmen af blod vasker over MZBs og udsætter dem for antigener transporteres i blodet. MZBs bære antigenet i hårsækken af shuttling automatisk mellem den marginale zone og inde i hårsækken, som ikke er udsat for blod. Således som MZBs lufthavnstransport mod hårsækken, skal de overflytte op shear kraften af blod flow12 (figur 1A).
I denne protokol, vi beskriver, hvordan at bestemme kvantitativt, hvordan immun celler som MZBs reagere på enten ingen flow eller højt flow in vitro-, for at afsløre, hvordan de er programmeret til at overflytte in vivo. I det første trin, er MZBs renset fra en mus milten ved hjælp af magnetiske perler koblet til antistoffer fra kommercielt tilgængelige kits. De frisk isolerede MZBs er indført i brønden af et flow kammer dias, lov til at bosætte sig på integrin ligander og udsat for strømmen af migration buffer ved hjælp af en pumpesystem (figur 2A). Cellerne er afbildet ved hjælp af en time-lapse video mikroskopi. Billeder behandles derefter til analyse med en gratis ImageJ plugin, MTrack213,14, til automatisk at spore celler. Spor kan derefter kvantificeres med gratis Ibidi Chemotaxis værktøj15 til at bestemme forskellige parametre, herunder hastighed, rethed og migration indeks. Disse værdier kan bruges til at fastslå virkningerne af migration hæmmere, celle Stimulatorer, kemokiner og andre kemikalier, der berører migration for shear-flow induceret migration for at forstå de kræfter, der styrer immun celle bevægelse in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her en metode til at analysere migration af celler, der registrerer kraften af shear flow og reagere ved at ændre deres migration. En analyse af MZBs viste, at MZBs vandrer spontant på ICAM-1 og flow, vil overflytte op for strømmen. I vores tidligere arbejde viste vi at MZBs Overfør ikke op for strømmen på VCAM-1 men i stedet have en fast på plads. Den murine milt marginale zone indeholder hovedsageligt ICAM-1, mens den røde papirmasse indeholder både ICAM-1 og VCAM-1. Fra disse data kunne det udled…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra “Deutsche Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11 til K. D.F.
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
