Summary
Qui, presentiamo un protocollo per ottenere frazione vascolari stromali da tessuto adiposo attraverso una serie di processi meccanici, che includono emulsificazione e centrifugazioni multiple.
Abstract
Frazione vascolare stromal (SVF) è diventato uno strumento rigenerativo per varie malattie; Tuttavia, la legislazione disciplina rigorosamente l'applicazione clinica dei prodotti delle cellule usando collagenosi. Qui, presentiamo un protocollo per generare una miscela iniettabile di SVF cellule e matrice extracellulare nativa dal tessuto adiposo di un processo puramente meccanico. Lipoaspirates sono messi in una centrifuga e filata a 1.200 x g per 3 min. Lo strato intermedio è raccolto e separato in due strati (ad alta densità grasso nella parte inferiore) e grasso a bassa densità in alto a sinistra. Lo strato superiore è emulsionato direttamente spostando intersyringe, ad un tasso di 20 mL/s per 6 x a 8 x. Il grasso emulsionato viene centrifugato a 2.000 x g per 3 min, e la sostanza appiccicosa sotto lo strato di olio è raccolto e definita come la matrice extracellulare (ECM) / SVF-gel. L'olio sullo strato superiore è raccolto. Circa 5 mL di olio è aggiunto a 15 mL di grasso ad alta densità ed emulsionati spostando intersyringe, ad un tasso di 20 mL/s per 6 x a 8 x. Il grasso emulsionato viene centrifugato a 2.000 x g per 3 min, e la sostanza appiccicosa è anche ECM/SVF-gel. Dopo il trapianto di ECM/SVF-gel in topi nudi, l'innesto è raccolto e valutato da esame istologico. Il risultato mostra che questo prodotto ha il potenziale per rigenerare nel normale tessuto adiposo. Questa procedura è una procedura di dissociazione meccanica semplice ed efficace per condensare le cellule SVF incorporate nel loro naturale ECM solidale per scopi rigenerativi.
Introduction
Terapie con cellule staminali forniscono un cambio di paradigma per la rigenerazione e riparazione tissutale, affinché possano offrire un regime terapeutico alternativo per varie malattie1. Cellule staminali (ad es., cellule staminali pluripotenti indotte e cellule staminali embrionali) hanno un grande potenziale terapeutico, ma sono limitate a causa di regolazione cellulare e considerazioni etiche. Adiposo-derivate mesenchimali stromali/cellule staminali (ASCs) sono facili da ottenere da lipoaspirates e non sono soggetti alle stesse restrizioni; così, è diventata un tipo di cellula ideale per la pratica della medicina rigenerativa2. Inoltre, sono nonimmunogenic e hanno abbondanti risorse da grasso autologo3.
Attualmente, ASC sono ottenute principalmente con la digestione della collagenosi-mediata del tessuto adiposo. La frazione di vascolare stromal (SVF) del tessuto adiposo contiene ASCs, cellule endoteliali progenitrici, periciti e cellule del sistema immunitario. Anche se ottenere un'alta densità di SVF/ASC enzimaticamente è stato indicato per avere effetti benefici, la legislazione in diversi paesi disciplina rigorosamente l'applicazione clinica dei prodotti cellulari utilizzando collagenosi4. Digerendo il tessuto adiposo con collagenasi per 30 min a 1 h per ottenere cellule SVF aumenta il rischio di entrambi materiale esogeno nella preparazione e nella contaminazione biologica. La cultura aderente e la purificazione di ASC, che richiede giorni a settimane, richiede attrezzature specifiche di laboratorio. Inoltre, nella maggior parte degli studi, le cellule SVF e ASC sono utilizzati in sospensione. Senza la protezione della matrice extracellulare (ECM) o un altro vettore, celle libere sono vulnerabili, causare una ritenzione di povera cella dopo l'iniezione e compromettere il risultato terapeutico5. Tutti questi motivi limitare l'ulteriore applicazione della terapia con cellule staminali.
Per ottenere ASCs dal tessuto adiposo senza digestione della collagenosi-mediata, parecchie procedure di lavorazione meccanica, tra cui centrifugazione, meccanica, tagliere, triturazione, sminuzzare e tritare, sono stati sviluppati6,7 , 8 , 9. questi metodi sono pensati per condensare tessuto e ASC interrompendo meccanicamente adipocytes maturi e loro vescicole contenenti olio. Inoltre, queste preparazioni, contenenti elevate concentrazioni di ASC, ha mostrato un notevole potenziale terapeutico come medicina rigenerativa in animale modelli8,9,10.
Nel 2013, Tonnard et al ha introdotto il nanofat innesto tecnica che prevede di produrre emulsionati lipoaspirates intersyringe elaborazione11. La forza di taglio creata da intersyringe spostando in modo selettivo può rompere adipocytes maturi. Basato sui loro risultati, abbiamo sviluppato un metodo di lavorazione puramente meccanici che rimuove la maggior parte del lipido e liquido in lipoaspirates, lasciando solo le cellule SVF ed ECM frazionato, che è ECM/SVF-gel12. Qui, descriviamo i dettagli del processo meccanico di derivazione umana di tessuto adiposo per produrre il ECM/SVF-gel.
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Protocol
Questa ricerca è stata approvata dal comitato etico recensione in Nanfang Hospital, Guangzhou, Cina. Il tessuto adiposo è stato raccolto da donatori sani che ha dato il consenso informato scritti di prendere parte allo studio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato di uso e Nanfang Hospital istituzionale Animal Care ed eseguiti secondo le direttive del National Health and Medical Research Council (Cina).
1. preparazione ECM/SVF-gel
- Raccogli grasso.
- Eseguire la liposuzione su un essere umano con una cannula multiporta di 3 mm, che contiene diversi fori taglienti laterali di 1 mm di diametro, a -0.75 atm di pressione di aspirazione.
- Raccogliere 200 mL di lipoaspirates in un sacchetto sterile.
- Preparare Coleman grasso.
- Trasferire la lipoaspirates in quattro provette da 50 mL e consentire il grasso raccolto riposare ancora per 10 min.
- Raccogliere il grasso sullo strato superiore in due provette da 50 mL utilizzando una pipetta wide-suggerimento per trasferire e scartare il liquido al livello inferiore.
- Utilizzando provette da 50 mL, centrifugate lo strato di grasso a 1.200 x g a temperatura ambiente (TA) per 3 min.
- Definire il livello superiore (circa 80 mL) come grasso di Coleman.
- Trasferire il superiore 2/3 del grasso Coleman in una provetta da 20 mL utilizzando una pipetta wide-punta e definire questa porzione come grasso a bassa densità.
- 1/3 inferiori del grasso Coleman di trasferimento ad un altro tubo 20 mL utilizzando una pipetta wide-punta e definire questa porzione come grasso ad alta densità.
- Produrre ECM/SVF-gel da grasso a bassa densità.
- Utilizzando due siringhe da 20 mL, collegate da un connettore Luer-Lock femmina-femmina (con un diametro interno di 2,4 mm) per intershift 20 mL di grasso a bassa densità.
- Mantenere la velocità di cambiata stabile (a 20 mL/s) e ripetere per 6 x a 8 x.
- Centrifugare la miscela a 2.000 x g per 3 min a RT.
- Raccogliere la porzione di olio sulla parte superiore in una provetta 10 mL utilizzando una pipetta wide-punta al RT per un ulteriore uso.
- Raccogliere la sostanza appiccicosa nello strato intermedio, che è ECM/SVF-gel (Figura 1A), utilizzando una pipetta wide-punta e scartare il liquido al livello inferiore.
- Produrre ECM/SVF-gel da grasso ad alta densità.
- Aggiungere 5 mL di olio (raccolto dal punto 1.3.4) a 15 mL di grasso ad alta densità.
- Intershift il grasso misto tra siringhe 6 x a 8 x fino a quando non si osservano un flocculati l'emulsione.
- Centrifugare la miscela a 2.000 x g per 3 min a RT.
- Scartare l'olio sulla parte superiore.
- Raccogliere la sostanza appiccicosa nello strato intermedio (ECM/SVF-gel) utilizzando una pipetta wide-punta e scartare il liquido al livello inferiore.
- Mescolare il ECM/SVF-gel da passaggi 1.3.5 e 1.4.5.
2. modello dell'innesto ECM/SVF-gel nudo del topo
- Anestetizzare i topi nudi (8 settimane, di sesso femminile) con isoflurano (1% - 3%) anestesia per inalazione in una stanza di funzionamento degli animali.
- Trasferire il ECM/SVF-gel in una siringa da 1 mL.
- Collegare la siringa da 1 mL con cannula smussato infiltrazione.
- Inserire la cannula per via sottocutanea in ciascun fianco del mouse.
- Iniettare 0,3 mL di ECM/SVF-gel.
3. tessuto raccolta su 3, 15 e 90 giorni dopo l'iniezione di ECM/SVF-gel
- Anestetizzare i topi con isoflurano (1% - 3%) anestesia per inalazione.
- Sacrificare i topi dal metodo dislocazione cervicale.
- Praticare un'incisione al midline della pelle dorsale del mouse con forbici chirurgiche.
- Sezionare e raccogliere gli innesti grassi su entrambi i lati del mouse. Incorporare gli innesti di grasso in 4% paraformaldeide al RT durante la notte.
- Disidratare il tessuto in aumento delle concentrazioni di etanolo: etanolo al 70%, due modifiche, 1h ciascuna; 80% di etanolo, un cambiamento, 1h; etanolo al 95%, un cambiamento, 1h; 100% etanolo, tre cambiamenti, 1,5 h ciascuno; xilene, tre cambiamenti, 1,5 h ciascuna.
- Infiltrare il tessuto con cera di paraffina (58-60 ° C), due modifiche, ogni 2h.
- Incorporare il tessuto in blocchi di paraffina. Tagliare sezioni con uno spessore di circa 4 µm e metterli sulle diapositive.
4. ematossilina ed eosina
- Deparaffinizzare le diapositive di blocco di paraffina immergendo in xilene in I, II e III (ogni 10 min.).
- Reidratare le sezioni di tessuto passandoli through facendo diminuire le concentrazioni (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) delle Terme di etanolo per 3 minuti ciascuno.
- Risciacquare le sezioni di tessuto in acqua distillata (5 min).
- Macchia le sezioni di tessuto in ematossilina per 5 min.
- Risciacquare le sezioni di tessuto in acqua corrente per 20 min. Decolorize in alcool acido 1% (1% HCl in 70% di alcool) per 5 s. Sciacquare in acqua corrente fino a quando le sezioni sono ancora blue.
- Aggiungere due o tre gocce di tintura di eosina Y diretta sui vetrini mediante pipetta e lasciare che il colorante impostato per 10 min.
- Lavare i vetrini in acqua corrente per 1-5 min.
- Disidratare i vetrini in aumento delle concentrazioni (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) di etanolo per 3 minuti ciascuno.
- Cancellare le diapositive in xilene I e II per 5 minuti ciascuno.
- Montare i vetrini in supporti di montaggio.
5. immunofluorescenza colorazione
- Deparaffinizzare le sezioni di tessuto in xilene I, II e III (ogni 5 min.).
- Reidratare le sezioni di tessuto passandoli attraverso diverse concentrazioni (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) delle Terme di alcool per 3 minuti ciascuno.
- Incubare le sezioni in una soluzione di2 O 3% H2in metanolo a temperatura ambiente per 10 min.
- Sciacquare le diapositive 2 x con acqua distillata, 5 minuti ciascuno.
- Eliminare le diapositive in un cestino di diapositiva. Aggiungere 300 mL di tampone citrato di 10 mM (pH 6.0) e incubare a 95-100 ° C per 10 min.
- Raffreddare i vetrini in RT per 20 min.
- Sciacquare le diapositive 2 x con tampone fosfato salino (PBS), 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere 100 µ l di 10% siero bovino fetale sulle diapositive e incubare in una camera umidificata a RT per 1 h.
- Incubare le sezioni con soluzione di anticorpo primario (cavia anti-topo Perilipina, 1: 400) a 4 ° C durante la notte.
- Sciacquare i vetrini con PBS 3 x, 5 min ciascuna.
- Incubare le sezioni con soluzione di anticorpo secondario (IgG di capra anti-guinea pig-488) per 2 h a TA.
- Sciacquare i vetrini con PBS 3 x, 5 min ciascuna.
- Asciugare la condensa attorno alla sezione con una velina pulita.
- Drop 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e coniugati Alexa Fluor 488 isolectin nel cerchio per coprire la sezione sulla diapositiva.
- Montare i vetrini coprioggetto e lasciarli asciugare al buio.
- Osservare i vetrini con un microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
Dopo aver elaborato il grasso di Coleman a ECM/SVF-gel, il volume di olio scartato occupa 80% del volume finale, e solo il 20% del tessuto adiposo conservato sotto lo strato di olio è considerato come ECM/SVF-gel (Figura 1A). ECM/SVF-gel ha una consistenza morbida simil-liquido che permette di passare attraverso un ago sottile 27 G; Tuttavia, Coleman grasso è composto da una struttura adiposa integrale con grandi fibre e può passare solo attraverso una cannula 18 G (Figura 1B).
Il giorno 3 dopo il trapianto, è apparso un numero elevato di piccole dimensioni preadipocytes con le goccioline del lipido intracellulare, vasto tessuto connettivo ben vascolarizzato e infiltrato di cellule infiammatorie. Inizio il giorno 15, il numero di cellule infiammatorie cominciò a ridotto gradualmente, e adipociti maturi. Di giorno 90, la maggior parte del tessuto connettivo vascolarizzato in innesti era stata sostituita da adipociti maturi (Figura 2, pannello superiore).
ECM/SVF-gel innesti contenevano alcuni adipociti perilipina-positivi, 3 giorni dopo il trapianto. Piccole dimensioni preadipocytes con le goccioline di lipidi intracellulari più hanno cominciato a comparire il giorno 15. Ogni campo del ECM/SVF-gel dell'innesto sezioni il giorno 90 ha mostrato numerosi adipocytes perilipina-positivo e vasi sanguigni neonate (Figura 2, pannello inferiore).
Figura 1 : Immagini di ECM/SVF-gel. Coleman grasso centrifugato ed ECM/SVF-gel dopo l'elaborazione (A). ECM/SVF-gel può essere facilmente iniettato attraverso un ago 27 G; Tuttavia, Coleman grasso può passare solo attraverso una cannula 18 G (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Cambiamento istologico in ECM/SVF-gel dopo trapianto. ECM/SVF-gel ha mostrato vasto tessuto connettivo ben vascolarizzato e infiltrazione di cellule infiammatorie il giorno 3. Successivamente, la maggior parte del tessuto connettivo vascolarizzato è stato sostituito da una struttura contenente adipocytes maturi (pannello superiore). Immunofluorescenza colorazione spettacoli che la maggior parte del tessuto è composto da zona perilipina-negativo il giorno 3. Dal giorno 15, apparve una grande porzione della perilipina + adipocytes. Numerosi adipocytes perilipina-positivi sono stati trovati dopo 90 giorni (pannello inferiore). Le barre di scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Terapia rigenerativa basata su cellule staminali ha mostrato un grande potenziale beneficio in diverse malattie. ASC sono i candidati terapeutici eccezionali perché sono facili da ottenere e avere la capacità di riparazione dei tessuti e la rigenerazione di tessuti romanzo15. Tuttavia, esistono limitazioni ad espandere la sua applicazione clinica, poiché richiede complicate procedure per isolare le cellule e la collagenosi per l'elaborazione di6. Quindi, è essenziale per sviluppare una tecnica semplice per ottenere cellule staminali senza l'uso di collagenasi.
In questo studio, abbiamo presentato un processo puramente meccanico del tessuto adiposo per ottenere cellule SVF, che sono protetti dal nativo ECM adiposa. Inoltre, questo processo è privo di collagenasi. Un precedente studio ha confrontato diversi intersyringe i tempi di lavorazione e ha dimostrato che il sistema di elaborazione intersyringe di grasso standard Coleman per 1 min ad una portata di 10 mL/s è il protocollo ottimale per la produzione di ECM/SVF-gel12. Utilizzando lo spostamento intersyringe, maggior parte dei adipocytes nella lipoaspirates vengono distrutti, con la maggior parte delle cellule SVF ed ECM conservato. Così, intersyringe lo spostamento è il passo fondamentale dell'intero processo. La velocità di cambiata intersyringe e il tempo speso per condurre lo spostamento determinano il livello di distruzione del tessuto adiposo perché la forza semi trasparente creata dal processo di intersyringe è associata con la velocità di cambiata. Suggeriamo che la velocità di cambiata dovrebbe essere stabile a 20 mL/s. distruzione insufficiente porta a restanti adipociti indesiderate, mentre overdestruction si traduce in danneggiando le cellule SVF. Il prodotto del presente protocollo può essere definito come ECM/SVF-gel solo se ha raggiunto i seguenti criteri: 1) il suo volume finale è di ~ 20% del volume iniziale; 2) facilmente viene iniettato attraverso un ago 27G. Uno studio precedente ha dimostrato che il ECM/SVF-gel contiene alte densità di entrambi CD45-/ CD31- / CD34 + ASC e la densità delle cellule SVF è > 4,0 x 105 cellule/mL12.
Durante il processo di creazione di ECM/SVF-gel, centrifugazione era condotto 2 x, prima e dopo lo spostamento intersyringe. Prima la intersyringe spostando, usiamo la centrifugazione per creare "densità graduata" di grasso. Questo è un altro passo fondamentale. È stato dimostrato che lo strato di grasso ad alta densità nella parte inferiore, dopo centrifugazione, è ricco di ECM condensato ma ha meno olio, mentre lo strato di grasso a bassa densità in alto a sinistra è più olio ma meno ECM fibra16,17. Così, questi due strati devono essere elaborati in due modi diversi. Grasso a bassa densità possa subire direttamente al trattamento intersyringe per distruggere gli adipociti. Tuttavia, il grasso ad alta densità a livello inferiore richiede ulteriore olio per facilitare la distruzione degli adipociti. L'aggiunta di olio può fare diminuire la densità del grasso ad alta densità, rendendo molto più facile lo spostamento. Inoltre, l'olio può aiutare a estrarre più petrolio da adipociti rotti; Tuttavia, non possono liquidi acquosi. Così, abbiamo aggiunto olio extra il grasso ad alta densità. La centrifugazione dopo il intersyringe di spostamento è quello di separare la parte di olio dalle cellule SVF ed ECM. Olio dovrebbe essere evitato nel prodotto finale.
Il trapianto di ECM/SVF-gel è provocato da un tasso di ritenzione grande. Come abbiamo accennato in precedenza, il passo fondamentale dell'elaborazione di ECM/SVF-gel è intersyringe lo spostamento, che distrugge la maggior parte degli adipociti. Così, poco adipociti è rimasto in ECM/SVF-gel. Come illustrato nella Figura 2, una piccola area di perilipina-positiva è apparso nel ECM/SVF-gel trapiantato il giorno 3. Tuttavia, dopo 15 giorni, un sacco di adipociti perilipina-positivi apparve e divenne maturo dopo 90 giorni. Uno studio precedente ha dimostrato che il trapianto di ECM/SVF-gel indotto host cellulo-mediata del tessuto adiposo rigenerazione14. Utilizzando antigene anti-umano del leucocita per identificare l'origine degli adipociti formati di recente, abbiamo scoperto che, sebbene la maggior parte delle cellule nella SVF erano innesto-derivato, la maggior parte del tessuto adiposo neonata era ospite-derivato. ECM/SVF-gel ha una grande funzione rigenerativa, come abbiamo segnalato in precedenza. Questo prodotto ha avuto grandi effetti terapeutici in12di cicatrizzazione. Inoltre, ha contribuito a migliorare il tasso di sopravvivenza della falda libera in un modello murino accelerando l'angiogenesi10.
SVF-gel è un autologo iniettabile contenente nativo ECM e funzionali componenti cellulari. Il prodotto è generato da lipoaspirato da un semplice processo meccanico, che può essere eseguito facilmente senza alcuna preoccupazione per quanto riguarda questioni normative. Tuttavia, l'effetto rigenerativo di ECM/SVF-gel rimane poco chiaro. Per meglio caratterizzare gli effetti benefici di ECM/SVF-gel, ulteriori indagini per caratterizzare i meccanismi molecolari dell'effetto rigenerativo di ECM/SVF-gel sono sulla strada.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione di scienza natura nazionale della Cina (81471881, 81601702, 81671931), il fondamento di scienza naturale della provincia di Guangdong (2014A030310155) e l'amministratore Foundation di Nanfang Hospital (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
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