Dosage de Polyphosphate inorganique chez les bactéries

Polyphosphate inorganique (polype) est un biopolymère linéaire d’unités de phosphate lié à phosphoanhydride que l'on retrouve dans tous les domaines de la vie^1,2,3. Diverses bactéries, polype est essentiel pour la réponse au stress, motilité, la formation de biofilm, contrôle du cycle cellulaire, la résistance aux antibiotique et virulence^{4,5,6,7,8 ,9,10,11}. Études du polype métabolisme chez les bactéries ont donc la possibilité de déboucher sur des connaissances fondamentales sur la capacité des bactéries causent la maladie et se développent dans divers environnements. Dans de nombreux cas, toutefois, les méthodes permettant de quantifier polype dans les cellules bactériennes sont un facteur limitant dans ces études.

Il y a plusieurs méthodes actuellement utilisées pour mesurer les niveaux de polype en matières biologiques. Ces méthodes impliquent généralement deux étapes distinctes : extraction de polype et quantifier le polype présent dans ces extraits. La méthode actuelle de l’étalon-or, développé pour la levure Saccharomyces cerevisiae par Bru et ses collègues¹², polype extraits ainsi que l’ADN et l’ARN à l’aide de phénol et de chloroforme, suivie par précipitation à l’éthanol, le traitement par désoxyribonucléase (DNase) et ribonucléase (RNase) et la digestion du polype purifiée obtenue avec le S. cerevisiae dégradant le polype enzyme exopolyphosphatase (ScPPX)¹³ à céder gratuitement phosphate, qui est ensuite quantifié à l’aide une Malachite verte essai reposant sur la colorimétrie. Cette procédure est très quantitative, mais fastidieux, limitant le nombre d’échantillons qui peuvent être traitées dans une expérience simple, n’est pas optimisé pour les échantillons bactériens. D’autres ont rapporté extraction polype d’une variété de cellules et de tissus à l’aide de perles de silice (« glassmilk ») ou silice membrane colonnes^{6,14,15,16,17, 18}. Ces méthodes ne retirer pas efficacement à chaîne courte polype (moins de 60 unités de phosphate)^12,14,15, bien que cela soit moins préoccupante pour les bactéries, qui sont généralement réputés pour synthétiser principalement polype de longue chaîne³. Anciennes méthodes d’extraction de polype à l’aide d’acides forts^19,20 sont n’est plus largement utilisés, étant donné que le polype est instable sous conditions acides¹².

Il existe également une variété de méthodes déclarées pour quantifier polype. Parmi les plus courantes est 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), un colorant fluorescent plus généralement utilisé pour colorer les ADN. DAPI-polype complexes ont des maxima d’excitation et d’émission de fluorescence différente que DAPI-ADN complexes^21,22, mais il y a beaucoup d’autres composants cellulaires, y compris les ARN, nucléotides et inositol phosphates^12,15,16,23, réduisant la spécificité et la sensibilité des mesures de polype effectuées à l’aide de cette méthode. Alternativement, les polypes et adénosine diphosphate (ADP) peuvent être convertis en adénosine triphosphate (ATP) à l’aide de purifiée Escherichia coli kinase polype (PPK) et l’ATP qui en résulte, quantifiée à l’aide de la luciférase^{14,17 ,},¹⁸. Cela permet la détection de très petites quantités de polype, mais nécessite deux étapes de la réaction enzymatique et luciférine et ADP très pure, qui sont des réactifs coûteux. ScPPX spécifiquement digestions polype en phosphate libre^6,12,13,24, qui peut être détectée par des méthodes plus simples, mais ScPPX est inhibée par l’ADN et l’ARN¹², nécessitant un traitement DNase et RNase polype contenant des extraits. PPK ni ScPPX sont disponibles dans le commerce, et purification de PPK est relativement complexe^25,26.

Polype dans les lysats cellulaires ou des extraits aussi peut être visualisée sur gel de polyacrylamide par DAPI^27,28,29,30, une méthode qui permet l’évaluation de la longueur de la chaîne, mais est une coloration négatif bas-débit et mal quantitative.

Nous rapportons un dosage de polype moyen débit, peu coûteux et rapide qui permet la quantification rapide de polype niveaux chez diverses espèces bactériennes. Cette méthode commence par la lyse des cellules bactériennes à 95 ° C en 4 M guanidine isothiocyanate (GITC)¹⁴ pour inactiver des phosphatases cellulaires, suivies d’une extraction de colonne silice membrane optimisée pour le traitement rapide des échantillons multiples. L’extrait contenant du polype qui en résulte est ensuite digéré avec un grand excès de ScPPX, éliminant le besoin de traitement DNase et RNase. Nous incluons un protocole pour simple purification d’affinité de nickel de quantités de mg de ScPPX. Enfin, phosphate libre dérivé de polype est quantifié avec un dosage colorimétrique simple, sensible, à base d’acide ascorbique²⁴ et normalisée à total des protéines cellulaires. Cette méthode simplifie la mesure de polype dans des cellules bactériennes, et nous montrer son utilisation avec des espèces représentatives des bactéries à gram négatif, bactéries gram-positives et mycobactéries.

1. purification de levure Exopolyphosphatase (ScPPX)

1. Transformer la souche de la surexpression de protéines Escherichia coli BL21 (de3)³¹ avec le plasmide pScPPX2⁶ par électroporation³² ou³³de la transformation chimique.
2. Ensemencer 1 L de bouillon de lysogénie (LB) contenant 100 µg, ampicilline des^-1 mL dans une fiole débafflé 2 L avec une seule colonie de BL21 (de3) contenant pScPPX2 et incuber une nuit à 37 ° C, sans agitation, à une absorbance à 600 nm (une₆₀₀) d’environ 0,3, tel que mesuré dans un spectrophotomètre.
3. Commencer la culture secouant (180 tr/min) et incuber 30 min à 37 ° C, au cours de laquelle les cellules passera à un A₆₀₀ de 0,4 - 0,5.
4. Ajouter isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM et le des 100 µg mL^-1 ampicilline, puis incuber pendant 4 h à 37 ° C sous agitation à 180 tr/min.
   Remarque : Ce protocole surexpression génère une grande quantité de ScPPX soluble. Toutefois, la surexpression de ScPPX est très indulgente, et une variété d’autres protocoles de la surexpression de protéines communes ont été utilisés pour purifier avec succès ScPPX.
5. Transférer les cellules dans une bouteille de centrifugeuse de 1 L et leur capture par centrifugation pendant 20 min à 5 000 x g à 4 ° C. Retirez le surnageant et le culot de transfert à un tube conique de 50 mL.
   Remarque : Boulettes de cellule peuvent être stockés indéfiniment à-80 ° C.
6. Décongeler le culot sur la glace, puis il resuspendre dans 9 mL de 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl et imidazole de 5 mM (pH 8) pour un volume total d’environ 10 mL.
7. Ajouter (concentration finale) 1 mg mL^-1 lysozyme, 2 mM MgCl₂et 50 unités mL^-1 d’une endonucléase ADN-dégradant le RNA et (voir Table des matières) et incuber pendant 30 minutes sur la glace.
   Remarque : ScPPX lie les acides nucléiques (données non présentées), traitement de nucléase est donc essentiel au cours de la purification.
8. En utilisant un sonicateur avec un microtip (voir Table des matières), lyse des cellules de 2 cycles de sonication sur glace à 50 % de puissance, impulsions 5 s sur et 5 s, avec un 2 min de repos entre les cycles.
   Remarque : Utiliser une protection auditive appropriée au cours de la sonication. De la même façon à l’affaire avec surexpression, une variété de méthodes de lyse cellulaire sont acceptables pour la purification de ScPPX.
9. Enlever les débris insoluble en CENTRIFUGEANT le lysat pendant 20 min à 20 000 x g à 4 ° C. Filtrer le liquide surnageant obtenu (environ 10 mL) à travers un filtre de seringue 0,8 µm pore taille acétate de cellulose.
10. Charger le lysat sur un colonne de chélation nickel-chargé de 5 mL (voir Table des matières) à l’aide d’une pompe péristaltique ou une grande seringue.
11. Rincer la colonne avec 50 mL d’imidazole de 5 mM 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl (pH 8).
12. Rincer la colonne avec 50 mL d’imidazole de 20 mM 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl (pH 8).
13. Éluer ScPPX avec 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl et 0,5 M imidazole (pH 8), collecteurs 15 fractions de 1 mL. Tester ces fractions d’élution pour la teneur en protéines avec la Bradford protéine test³⁴ (voir Table des matières) et exécutez un de gel SDS-PAGE³⁵ pour confirmer les fractions contiennent ScPPX purifié (poids moléculaire = 45 kDa).
14. Mettre en commun les fractions contenant ScPPX pure et ajuster la concentration de la protéine mise en commun d’environ 2 mg mL^-1 avec 50 mM HEPES et 0,5 M de NaCl. Des concentrations plus élevées de protéines peuvent précipiter dans l’étape suivante.
15. Échanger le ScPPX purifiée dans le tampon de stockage (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, glycérol à 10 % [v/v]) par la dialyse. Placer des fractions de ScPPX mise en commun dans une longueur scellée de 12 000-14 000 Da poids moléculaire limite dialyse membrane tube (voir Table des matières) et mettre en suspension dans 1 L de stockage tampon avec agitation continue à 4 ° C pendant au moins 4 h. Répétez cette étape avec frais tampon de stockage pour un total de 3 changements de tampon.
16. Transférer la protéine purifiée, dialysée dans un tube à centrifuger ou tubes et centrifuger pendant 20 min à 20 000 x g à 4 ° C pour éliminer n’importe quel agrégat insolubles. Transvaser avec soin le surnageant dans un tube conique propre de 15 mL.
17. Ajuster la concentration de le ScPPX purifié à mg 1 mL^-1 avec le tampon de stockage, ajouter 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine exempt de protéase (BSA ; concentration finale) et magasin pendant 6 mois à 4 ° C.
    Remarque : ScPPX perd plus de 90 % de son activité lorsqu’il est congelé¹³.

2. récolte des échantillons pour l’Extraction de Polyphosphate

1. Cultiver des bactéries dans les conditions d’intérêt pour le dosage du polype. Pour ce protocole, poussent de Lactobacillus reuteri³⁶ pendant une nuit à 37 ° C sans trembler dans l’enzyme malique induction (MEI) moyen³⁷ sans cystéine (MEI-C).
2. Récolter suffisamment de cellules par centrifugation dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour un total de 50 à 100 µg de protéines cellulaires (voir étape 3 ci-dessous). Pour e. coli, c’est 1 mL d’une culture en phase log à un A₆₀₀ de 0,2 - 0,4. Il s’agit de L. reuteri, 1 mL d’une culture d’une nuit ou plus. Ajuster au besoin pour d’autres espèces d’intérêt.
3. Enlevez complètement le surnageant des granules cellulaires.
4. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 250 µL de tampon de lyse GITC (4 M guanidine isothiocyanate, 50 mM Tris-HCl, pH 7) et lyse par incubation à 95 ° C pendant 10 min. de lysats de magasin à-80 ° C.
   NOTE : Être cohérent avec le temps de lyse, puisque l’incubation prolongée à haute température peut entraîner une dégradation du polype par hydrolyse,³⁸. Lysats peuvent être conservés indéfiniment à-80 ° C.
   Attention : Isothiocyanate de Guanidine est un sel de chaotropes et devrait être manipulé avec des gants et éliminé comme déchets dangereux.

3. mesurer la teneur en protéines de lysats cellulaires

1. Élaborer des normes de BSA contenant 0, 0,1, 0,2 et 0,4 mg mL^-1 de BSA dans le tampon de lyse GITC.
   Remarque : Il est important de faire les normes BSA dans GITC, puisque GITC influe sur le développement de la couleur de l’analyse de Bradford. Normes de BSA peuvent être conservés indéfiniment à-20 ° C.
2. Aliquote 5 µL de lysats cellulaires décongelés, homogènes et des normes de BSA à différents puits dans une plaque à 96 puits clair.
3. Ajouter 195 µL de réactif de Bradford³⁴ dans chaque puits et mesurer l’absorbance à 595 nm (un₅₉₅) dans un lecteur de plaque (voir Table des matières).
4. Calculer la quantité de protéines dans chaque puits par rapport à la courbe d’étalonnage de BSA, à l’aide de la formule y = mx + b, où y est un₅₉₅, x est µg de BSA, m est la pente de la courbe d’étalonnage, et b est l’ordonnée à l’origine de la courbe standard. Multipliez la valeur obtenue par 0,05 pour déterminer le total mg de protéine dans chaque échantillon.

4. extraction des polyphosphates

1. Ajouter 250 µL d’éthanol à 95 % à chaque échantillon GITC-lysées et vortex pour mélanger.
2. Appliquer ce mélange sur une colonne de silice membrane spin et centrifuger pendant 30 s à 16 100 x g.
3. Jeter le cheminement, puis ajoutez 750 µL de 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 % d’éthanol et centrifuger pendant 30 s à 16 100 x g.
4. Jeter le cheminement et centrifuger pendant 2 min à 16 100 x g.
5. Placer la colonne dans un tube à centrifuger propre 1,5 mL et ajouter 150 µL de 50 mM Tris-HCl (pH 8).
6. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis éluer le polype par centrifugation pendant 2 min à 8 000 x g.
   Remarque : Si vous le souhaitez, les éluats peuvent être stockés à-20 ° C pendant au moins 1 semaine.

5. digérer Polyphosphate

1. Élaborer des normes contenant 0, 5, 50 ou phosphate de potassium 200 µM au 50 mM Tris-HCl (pH 8).
   Remarque : Les normes de phosphate de Potassium peuvent être stockés indéfiniment à la température ambiante.
2. Aliquotes de 100 µL de chaque norme de phosphate et d’extraites des échantillons de polype dans puits séparés d’une plaque 96 puits clair.
3. Préparer un mélange maître contenant (par exemple) : 30 µL de 5 x ScPPX réaction tampon (25 mM MgCl₂, acétate d’ammonium 250 mM, 100 mM Tris-HCl, pH 7,5)¹³et 19 µL d’H₂O 1 µL de ScPPX purifié (mg 1 mL^-1).
4. Ajouter 50 µL du mélange maître dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Incuber pendant 15 min à 37 ° C.
   Remarque : Si vous le souhaitez, les polype digérées échantillons peuvent être conservés à-20 ° C indéfiniment.

6. détection de Phosphate libre²⁴

1. Préparer la solution de détection des base en dissolvant 0,185 g antimoine de tartrate de potassium dans 200 mL d’eau, ajouter 150 mL de 4 N H₂SO₄, puis en ajoutant 1,49 g d’heptamolybdate d’ammonium. Remuer pour dissoudre, puis l’outil pour un volume final de 456 mL. Filtrer la solution pour enlever les particules et les stocker abri de la lumière à 4 ° C pendant environ 1 mois.
2. Préparer une solution d’acide ascorbique 1 M. Boutique abri de la lumière à 4 ° C pendant environ 1 mois.
3. Préparation d’un stock de travail frais de solution de détection chaque jour en mélangeant 9,12 mL de solution de détection base 0,88 ml d’acide ascorbique 1 M. Laisser la solution de détection à venir à température ambiante avant utilisation.
4. Ajouter 50 µL de solution de détection pour chaque échantillon et de la norme dans la plaque à 96 puits et incuber à température ambiante pendant environ 2 min permettre le développement de la couleur.
5. Mesurer l’absorbance à 882 nm avec un lecteur de plaque et calculer la concentration de phosphate de l’échantillon par rapport à la courbe standard de phosphate de potassium.
   Attention : La solution de détection contient des sels toxiques et acides forts. Porter des gants et traiter l’excédent de solution comme un déchet toxique.

7. on calcule le contenu cellulaire Polyphosphate

1. Convertir les concentrations de phosphate, déterminées à l’étape 6.5 nanomoles de polype dérivés de phosphate dans chaque cellule entière lysat selon la formule suivante :
   polype nmol = 1,5 x (phosphate µM / 10)
   Remarque : La méthode basée sur des courbes standard à l’étape 6 détermine la concentration de phosphate (en µM) dans chaque échantillon de polype 100 µL aliquotés à l’étape 5.2. Pour convertir cette concentration à un certain nombre de nmol, 100 µL est divisé par 10⁶ pour obtenir un volume en L, multiplié par la concentration (µmol L^-1), puis multiplié par 1 000 (le nombre de nmol dans un µmol). Cela réduit à divisant la concentration par 10. Le volume total extrait préparé à l’étape 4 est 150 µL, il est donc nécessaire de multiplier la valeur obtenue par 1,5 pour calculer la nmol de phosphate présent dans l’extrait entier.
2. Normaliser le contenu cellulaire polype de protéines cellulaires totales en divisant le polype nmol par mg de protéine totale dans chaque échantillon déterminé à l’étape 3.4. Polype niveaux sont exprimés en fonction de la concentration d’individuel phosphate libre dérivé de polype.
   Remarque : Dans certains cas, la quantité de dérivés de polype phosphate présent dans un échantillon peut tomber à l’extérieur de la gamme de linéarité de la courbe standard de phosphate (étape 6.5). Si les niveaux de polype sont très élevés, l’éluat contenant du polype excédentaire de l’étape 4.6 peut être dilué 01:10 ou au 1/100, au besoin et ensuite mesuré à nouveau comme décrit aux étapes 5 à 7.

Les étapes clés du protocole sont schématisés sous une forme simplifiée de la Figure 1.

Pour illustrer l’utilisation de ce protocole avec des bactéries gram-négatives, sauvage, e. coli MG165539 a été passé à la phase logarithmique en milieu riche LB à 37 ° C sous agitation (200 tr/min), puis rincé et incubées pendant 2 h supplémentaires dans morpholinopropanesulfonate-tampon (MOPS) minimale moyenne40 contenant 4 g L-1 de glucose et 0,1 mM K2HPO4, une condition connue pour induire la production de polype14,29. Comme le montre la Figure 2 a, nous avons ne décelé aucun polype dans sauvage de e. coli cultivé chez LB et 192 ± 14 (moyenne ± écart-type [SD]) nmol polype mg-1 de protéine totale en VADROUILLES, conformes aux précédents rapports14,29 . Comme prévu, un ∆ppk mutant6, qui n’a pas de polype kinase41, ne produit aucun polype dans chaque milieu, un ∆ppx mutant6, qui n’a pas d’exopolyphosphatase42, produit environ la même quantité de polype dans le type sauvage et un ∆phoB mutant29, qui est défectueux dans le transport de phosphate, produisent beaucoup moins polype que le sauvage14,29,43.

Pour démontrer l’utilisation de ce protocole avec des bactéries gram-positives, sauvage, L. reuteri ATCC PTA 647536 et un mutant nul isogéniques ppk1 manque de kinase de polype, construit à l’aide d’oligo-réalisé recombineering44, ont été cultivés pendant la nuit en MEI-C à 37 ° C sans agitation. Comme illustré à la Figure 2 b, la sauvage accumulé 51 ± 6 nmol polype mg-1 protéine totale dans ces conditions, alors que le mutant ppk1 contenait moins de la moitié de ce montant. L. reuteri contient une deuxième kinase de polype, codée par le ppk2 gène45, qui vraisemblablement représente le polype se présente chez le mutant null ppk1 .

Pour illustrer l’utilisation de ce protocole avec des mycobactéries, Mycobacterium smegmatis souche SMR546 a été cultivé à phase logarithmique en Hartmans-de Bont (HdB) moyenne47, puis rincés et quintuplé dilué en HdB ou HdB avec 2 % d’éthanol. Ces cultures ont été ensuite incubés durant une nuit à 37 ° C sous agitation (180 tr/min). Comme illustré dans la Figure 2, en l’absence d’éthanol, M. smegmatis accumulé 141 ± 52 nmol polype mg-1 de protéine totale, traitement à l’éthanol a donné lieu à un triplé de 437 ± 102 nmol polype mg-1 de protéine totale. Ce résultat était attendu, puisque l’éthanol a déjà signalé à élever les niveaux de polype dans M. smegmatis48.

Figure 1 : schéma de procédure d’extraction et de mesure de polyphosphate. Les étapes essentielles du protocole de quantification polype sont illustrées. Boulettes de cellules bactériennes sont lysées à 95 ° C en GITC (isothiocyanate de guanidine). Petites parties aliquotes des lysats sont testés pour la teneur en protéines à l’aide de l’analyse de Bradford. Polype est extraite à l’aide de colonnes de membrane de silice et ensuite digéré avec ScPPX. Le phosphate libre qui en résulte est quantifié en utilisant le dosage de l’acide ascorbique. Dérivé de polype totale de phosphate est normalisée de protéines totales pour chaque échantillon. Un595 = absorbance à 595 nm ; Un882 = absorbance à 882 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : représentant des résultats avec diverses bactéries. (A), e. coli MG1655 sauvage et isogénique ∆ppket mutantsphoB ∆ ∆ppxont été cultivées à 37 ° C sous agitation (200 tr/min) pour un600 = 0,2 - 0,4 dans le riche milieu LB (cercles noirs) et ensuite déplacé vers un milieu minimal (MOPS contenant 4 g L-1 de glucose et 0,1 mM K2HPO4) pendant 2 h (cercles blancs ; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC PTA 6475 (cercles) et un mutant nul isogéniques ppk1 (triangles) ont été cultivés pendant une nuit à 37 ° C dans un milieu MEI-C sans agitation (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 a été cultivé à 37 ° C sous agitation (180 tr/min) pour un600 = 1 en milieu HdB (carrés fermés) ou sans (carrés vides) 2 % d’éthanol (n = 3, ± SD). Polype niveaux sont exprimés en fonction de la concentration d’individuel phosphate libre dérivé de polype. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.