Summary
Denne protokollen mål å demonstrere hvordan kombinere i vitro microelectrode matriser med microfluidic enheter for å studere handling potensial overføring i neuronal kulturer. Dataanalyse, nemlig gjenkjenning og karakterisering for handlingen potensialene, er utført med en ny avansert, men brukervennlig og fritt tilgjengelig, beregningsorientert verktøy.
Abstract
Microelectrode matriser (tiltak) er mye brukt til å studere neuronal funksjon i vitro. Disse enhetene kan samtidig ikke-invasiv opptak/stimulering av elektrofysiologiske aktivitet i lange perioder. Men kan for sensing signaler fra alle kilder rundt hver microelectrode bli ugunstig når du prøver å forstå kommunikasjon og signal overføring i nevrale kretser. I nevrale nettverk, flere neurons kan aktiveres samtidig og kan generere overlappende handling potensialene, gjør det vanskelig å diskriminere og spore signalet overføring. Vurderer denne begrensningen, har vi etablert en i vitro oppsett fokusere opp på taksere elektrofysiologiske kommunikasjon, som kan isolere og forsterke axonal signaler med høy romlig og tidsmessige oppløsning. Ved grensesnitt microfluidic enheter og tiltak, er vi kunne fordeler neuronal kulturer med en godt kontrollerte justeringen av axons og microelectrodes. Dette oppsettet gjør opptak av spike overføring med høy signal-til-støy forholdet i løpet av ukene. Kombinert med spesialiserte data analysealgoritmer, det gir detaljert kvantifisering av flere kommunikasjon egenskaper som overføring hastighet, ledning svikt, skyte rate, anterograd toppene og koding mekanismer.
Denne protokollen demonstrerer hvordan du oppretter en compartmentalized neuronal kultur oppsett over substrat integrert tiltak, slik kultur nerveceller i dette oppsettet og hvordan å kunne registrere, analysere og tolke resultatene fra slike eksperimenter. Her viser vi hvordan den etablerte setup forenkler forståelsen av neuronal kommunikasjon og axonal signalet overføring. Disse plattformene bane vei for nye i vitro modeller med utvikling og kontrollerbar nevrale nettverk topografi. De kan brukes i konteksten av homogen neuronal kulturer, eller med co kultur konfigurasjoner der, for eksempel kommunikasjon mellom sensoriske neurons og andre celletyper er kontrollert og vurdert. Dette oppsettet gir svært interessant betingelser for å studere, for eksempel neurodevelopment, nevrale kretser, informasjon koding, neurodegeneration og neuroregeneration tilnærminger.
Introduction
Forstå electrical kommunikasjon i nevrale kretser er en grunnleggende skritt å avsløre normal funksjon, og utarbeide strategier for å håndtere dysfunksjon. Neurons integrere, beregne og videresende handling potensialer (APs) som overføres langs sin tynne axons. Tradisjonelle elektrofysiologiske teknikker (f.eks oppdateringen klemme) er kraftige teknikker å studere neuronal aktivitet, men er ofte begrenset til større cellular strukturer, som soma eller dendrites. Imaging teknikker tilbyr et alternativ for å studere axonal signaler med høy romlig oppløsning, men de er teknisk vanskelig å utføre og tillater ikke langsiktige mål1. I denne sammenheng, kan kombinasjonen av microelectrode matriser (tiltak) og microfluidics gi et kraftig bidrag i å bringe de grunnleggende egenskapene for neuron´s aktivitet og signal overføring innen nevrale nettverk i vitro2 , 3.
MEA teknologi avhengig ekstracellulære opptak av neuronal kulturer. De viktigste fordelene med denne elektrofysiologiske metoden er dens evne til å støtte langsiktig og samtidige stimulering og opptak på flere områder og i en ikke-invasiv måte3. Tiltak er laget av biokompatible, høy ledende og korrosjonsbestandige microelectrodes innebygd i et glass wafer substrat. De er kompatible med konvensjonelle celle kultur bio-belegg, som fremmer celleadhesjon betydelig øker tetting motstanden mellom substrat og celler3,4. Dessuten, de er allsidig design og kan variere i microelectrodes størrelse, geometri og tetthet. Samlet fungere tiltak som vanlig celle kultur fartøy med fordelen at samtidig live-imaging og elektrofysiologiske opptak/stimulering.
Bruk av MEA teknologi har bidratt til studiet av viktige funksjoner av neural nettverk5. Men er det iboende egenskaper som begrenser ytelsen til tiltak for å studere kommunikasjon og APs forplantning i en neuronal krets. Tiltak aktiverer opptak fra enkeltceller og selv subcellular strukturer som axons, men sammenlignet med somal signaler, axonal signaler har en svært lav signal-til-støy-forhold (SNR)6. Videre hemmer karakteristiske sensing ekstracellulære feltet potensialer fra alle kilder rundt hver microelectrode sporing av signalet overføring i en neuronal krets.
Nyere studier har vist, men at bedre opptak forhold kan oppnås ved å ha microelectrodes justert i smale microchannels som axons kan vokse. Denne konfigurasjonen gir betydelig økning i SNR slik at spre axonal signaler kan være lett oppdaget7,8,9,10,11,12, 13. Strategien for å alliere seg microfluidic enheter med MEA teknologi skaper en elektrisk isolert microenvironment egnet til å forsterke axonal signaler11. Videre, tilstedeværelse av flere sensing microelectrodes langs en Mikrokuttspor er grunnleggende for deteksjon og karakterisering av axonal signalet overføring.
Slike i vitro plattformer med svært kontrollerbare nevrale nettverk topografi kan tilpasses mange forskning spørsmål14. Disse plattformene er passende å bli anvendt i sammenheng med neuronal kulturer, men kan bli utvidet til å ingeniør co kultur konfigurasjoner, der kommunikasjonen mellom nerveceller og andre celletyper kan bli kontrollert og vurdert. Dette oppsettet gir dermed veldig interessant forhold å utforske en rekke neural-relaterte studier som neurodevelopment, nevrale kretser, informasjon koding, neurodegeneration og neuroregeneration. I tillegg kan kombinasjonen med nye modeller av menneskelig indusert pluripotent stamceller15,16 åpne nye veier i utviklingen av potensielle terapi for menneskelige sykdommer som påvirker nervesystemet.
Våre lab bruker denne plattformen forbinder microelectrodes med microfluidics (µEF) for å forstå neuronal prosesser på cellular og nettverket nivå og deres konsekvensen i physio- og patologisk nervesystemet. Gitt verdien av slik plattform innen nevrovitenskap, formålet med denne protokollen er å skape en compartmentalized neuronal kultur over substrat integrert tiltak, hvordan kultur nerveceller i denne plattformen og hvordan inn, analysere og tolke resultatene fra slike eksperimenter. Denne protokollen vil sikkert berike eksperimentelle verktøykassen for neuronal kulturer i studiet av nevrale kommunikasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til den europeiske Union (EU) direktivet 2010/63/EU (transponert portugisiske lovgivning av Decreto-Lei 113/2013). Eksperimentell protokollen (0421/000/000/2017) ble godkjent av den etiske komiteen av både den portugisiske offisielle myndighet på dyrevelferd og eksperimentering (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) og englers institusjon.
1. forberedelse av kultur medier og andre løsninger
Merk: Forberede fersk belegg løsningene ved bruken. Ubrukte belegg løsninger og kultur medier lagres på 20 ° C eller 4 ° C som beskrevet nedenfor.
- Forberede 10 mL av en 0,05% (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) fungerende løsning.
- Klargjør 20 mL 0,25% (w/v) PEI lagerløsning ved oppløsning renset PEI (se Tabell for materiale) i sterilt vann.
- Fortynne 2 mL 0,25% (w/v) PEI lagerløsning i 8 mL steril destillert vann. Bland godt og bruke. Ubrukte løsning kan lagres på 4 ° C.
- Forberede 1 mL av en 5 µg/mL laminin løsning.
- Fortynne 5 µL av 1 mg/mL laminin lager løsning i 995 µL av basale medium (se Tabell for materiale). Bland godt og bruke. Ubrukte løsning kan lagres frosset ved 20 ° C 1-2 uker.
- Forberede 1 L HEPES-bufret Hanks balansert Salt løsning (H-HBSS).
- Klargjør 1 M HEPES løsning ved oppløsning 11,9 g av HEPES pulver i 50 mL ultrapure vann. Justere pH til 7.2.
- Klargjør H-HBSS løsning (uten kalsium og magnesium) ved oppløsning 5.33 mM kalium klorid, 0.44 mM kalium fosfat monobasic, 138 mM natriumklorid, 0.3 mM natrium fosfat dibasic og 5,6 mM glukose i 800 mL ultrapure vann.
- Legge til 15 mL 1 M HEPES løsning (siste konsentrasjon av 15 mM).
- Justere pH til 0,2-0,3 enheter under ønsket pH 7.4 bruker 1 N HCl eller 1 N NaOH. Legg ultrapure vann utgjør det endelige løsningen volumet.
Merk pH tendens til å stige under filtrering. - Sterilisere ved filtrering bruker en 0.22 µm porøsitet poly(ether sulfone) (PES) membran.
- Forberede 10 mL av H-HBSS som inneholder 10% inaktivert fosterets Bovine Serum (hiFBS).
- Fortynne 1 mL av hiFBS i 9 mL av H-HBSS. Bland godt og bruke. Ubrukte løsning kan lagres på 4 ° C i 3-4 uker.
- Forberede 5 mL av 1.5 mg/mL trypsin løsning.
- Umiddelbart før bruk, løses 7.5 mg av trypsin i 5 mL av H-HBSS. Sterilisere ved filtrering bruker en 0.22 µm porøsitet PES membran.
- Forberede 50 mL av supplert medium.
- I en 50 mL konisk tube, bland 48.5 mL av basale medium (se Tabell for materiale), 2% (v/v) B-27 supplement, 0,5 mM L-glutamin og 1% penn/Strep (10.000 U/mL penicillin og 10.000 µg/mL streptomycin). Supplert medium kan lagres på 4 ° C i 3-4 uker.
2. Microfluidic og MEA enheter forberedelse
Merk: Utføre trinnene 2.1-2.11 dagen før cellen seeding.
- Rengjør microfluidic enheter for å fjerne fabrikasjon og annet rusk med vinyl tape. Trykk forsiktig tape mot enheten nå alle områder av enheten.
- Luften plasma-clean MEA for 3 min (0,3 mbar) rengjør overflaten og gjøre det mer hydrofile.
- Kort dukke microfluidic enheter i 70% etanol og tillate dem å air-dry inne laminær strømning hette.
- Plasser Royalton i et sterilt 90 mm Petriskål og sperre av 15 min ultrafiolett (UV) lys eksponering.
- Kåpe MEA sentrale areal av rugende med 500 µL av 0,05% (v/v) PEI løsning for minst 1 h på 37 ° C.
Merk: Som beskrevet av andre17, PEI belegg av tiltak gir mindre celle klynger enn å bruke poly(lysine) belegg. - Sug opp PEI belegg løsningen fra MEA overflaten og vaskes tiltak 4 x med 1 mL steril destillert vann. Være forsiktig å ikke berøre MEA overflaten under vaske trinnene da dette kan skade elektrodene.
- Guidet av en stereomicroscope innenfor laminær strømning hette, Midtstiller MEA chip og legge 1 mL steril vann til det sentrale området av MEA.
- Plass microfluidic enheten på MEA overflaten.
- Nøye Juster microgrooves microfluidic enhet microelectrode rutenett av MEA.
- Når riktig nøye Sug opp overflødig vann uten å berøre MEA eller microfluidic enheten.
- Inkuber µEFs overnatting på 37 ° C til å tørre og gir fullstendig vedlegg. For å lette vedlegget, trykk forsiktig microfluidic enheten mot MEA.
Merk: Utføre trinnet 2.12 ved celle seeding. - Når µEFs har tørket helt, laste microfluidic brønner med 150 µL av 5 µg/mL laminin belegg løsning og ruge ved 37 ° C i minst 2 timer før cellen seeding.
Merk: Ved lasting µEF med laminin løsning, kontroller at løsningen fyller microgrooves. Bruk et vakuum for å fjerne en luftboble som kan finnes i microgrooves.
3. prefrontal Cortex disseksjon
- Forberede området disseksjon embryoet fjerning.
- Desinfiser arbeidsgruppen overflaten og de kirurgiske instrumentene med 70% etanol.
Merk: Selv om dette disseksjon ikke er en steril prosedyre, desinfisering bidrar til å redusere sjansene for forurensning. - Bruk en ren disponibel bleie å begrense disseksjon området og legge ut de kirurgiske instrumentene for fosteret fjerning.
- Forberede 4 90 mm Petri retter fylt med kaldt H-HBSS og plassere dem på et brett med is nær disseksjon.
- Desinfiser arbeidsgruppen overflaten og de kirurgiske instrumentene med 70% etanol.
- Euthanize en E-18 tid-gravid Wistar rotten ved karbondioksid (CO2) innånding.
- Ved ferdigstillelse av prosedyren, fjerne dyret fra CO2 kammeret og Bekreft død av en sekundær metoden dødshjelp, som exsanguination.
- Plasser den dyr ventral siden opp på disponibel bleie, spray nedre del av magen med 70% etanol, og med hjelp av tang og saks, gjøre U-form skjære gjennom huden å avsløre livmoren.
- Nøye fjerne embryoene fra livmoren ved å klippe bort alle bindevev og plassere dem i en av Petri retter med kalde H-HBSS.
- Fjerne hver embryoet fra sin embryonale sac, og med hjelp av tang og saks, halshugge fosteret.
- Overføre embryo´s hodet til en andre Petriskål fylt med kaldt H-HBSS.
- Gjenta trinn 3.6-3.7 for hver fosteret.
- Dissekere prefrontal cortex.
- Overføre en embryo´s hodet til en tredje Petriskål.
- Bruk et par pinsett for å avsløre hjernen.
- Fjern hjernen fra sin hulrom og dekke med kaldt H-HBSS.
- Hvis tilstede, fjern og forkaste olfactory pærene. Dissekere prefrontal cortex og fjerne meninges.
- Overføre prefrontal cortex fragmenter til en fjerde Petriskål fylt med kaldt H-HBSS.
- Gjenta trinnene 3.9.1 - 3.9.5 for hver fosteret.
4. kortikale nevroner dissosiasjon og kultur på µEF
Merk: Fremgangsmåtene nedenfor ble utført i laminær strømning hette etter en 15 min syklus UV sterilisering. Arbeider areal samt alle materialer plassert inne i panseret bør tidligere desinfiseres med 70% etanol.
- Som beskrevet i trinn 1.5, oppløse den tidligere vektet trypsin i 5 mL av H-HBSS og filtrere løsningen.
- Samle cortex bitene tidligere dissekert i totalt 5 mL av H-HBSS. Overføre dem til et sterilt 15 mL konisk rør.
- Legge til 2,3 mL av nylagde 1.5 mg/mL trypsin løsning til røret som inneholder cortex fragmenter.
- Bland suspensjon og ruge på 37 ° C i 15 min (kort agitere hver 5 min).
- Stopp vev fordøyelsen og vaske ut trypsin.
- Kast nedbryting som inneholder trypsin. Legge til 5 mL av H-HBSS inneholder 10% hiFBS å deaktivere de resterende trypsin; forsiktig røre.
- La cortex fragmenter slå seg ned og deretter kaste nedbryting.
- Legge til 5 mL av H-HBSS å fjerne hiFBS rester. La cortex fragmenter slå seg ned og forkaste nedbryting.
- Vask igjen cortex fragmenter med 5 mL av H-HBSS.
- La cortex fragmenter slå seg ned og forkaste nedbryting. Legge til 5 mL av supplert neuronal medium.
- Mekanisk distansere cortex fragmenter med en 5 mL serologiske pipette av sakte pipettering opp og ned 10 - 15 ganger. Om nødvendig gjenta bruker en små caliber pipette til celle suspensjon blir homogen.
- Forkaste gjenværende undissociated vev ved filtrering celle suspensjon gjennom en 40 µm celle sil.
- Telle celler som levedyktig og bestemme cellen tetthet.
- I en microtube, legger du til 20 µL av 0,4% (w/v) Trypan blå til en 20 µL celle suspensjon. Bland godt til homogenate løsningen og overføre 10 µL til en Neubauer telling kammer.
- Telle celler som levedyktig og bestemme cellen tettheten av levedyktige cellers.
- Justere celle tetthet til 3.6 x 107 celler/mL (eventuelt sentrifuge celle suspensjon).
- Umiddelbart før celle såing, fjerne laminin belegg fra alle brønnene av µEF. Pipetter 50 µL av supplert medium i hver brønn av µEF axonal kupé.
- Frø 5 µL av cellen suspensjon i µEF somal rommet. Inkuber ved 37 ° C i 1 time, slik at cellene vedlegg til underlaget.
- Forsiktig fylle hver brønn av µEF med varmet supplert medium. Overføring av µEF til en luftfukter inkubator på 37 ° C leveres med 5% CO2.
Merknad: For å unngå rask kultur medium fordampning, plassere en åpen microtube fylt med vann i Petriskål bærer µEF. - Opprettholde kulturer for periode ved å erstatte 50% av kultur medium hver andre til tredje dag kultur.
Merk: Etter eksperimentene, microfluidics kan være løsrevet fra tiltak ved immersing µEF i vann over natten. Hvis nødvendig, forsiktig Skrell microfluidics ved hjelp av pinsett. Tiltak kan rengjøres ved overnatting inkubasjon med 1% (v/v) kommersielle enzymatisk vaskemiddel (se Tabell for materiale).
5. spontan Neuronal opptaksaktiviteten
Merk: Embryonale kortikale Nevron kulturer på tiltak vanligvis utstilling spontan aktivitet snarest 7 dager i vitro (DIV), men ta 2-3 uker (14-21 DIV) moden og utstillingen stabil aktivitet. Det er opp til eksperimentator bestemme når starte elektrofysiologiske målinger basert på målene for undersøkelsen. I denne protokollen, opptak av neuronal aktivitet fra µEF er vist ved hjelp av en kommersiell innspillingssystem (se Tabell for materiale for maskinvaredetaljer), med en oppvarming modul innlemmet. For å utføre innspillinger, vi brukte en fritt tilgjengelig programvare (se Tabell for materiale for programvare).
- Slå på MEA systemet og temperatur kontrolleren og la den oppvarmede bunnplate av forforsterker nå 37 ° C.
Merk: For langvarige opptak (> 30 min samtidig) en bør også ha et system som gir en CO2 atmosfære. - Legg til µEF på forforsterker (headstage).
Merk: Kontroller at MEA chip er riktig justert med referansenummeret i øvre venstre kant. MEA chip vi bruker er rotasjons symmetrisk, men denne justeringen samsvarer med riktig retning av pin layout elektrodene og maskinvare-IDer. - Lukk og klinke forforsterker lokket.
- For å registrere, åpne innspillingen programvare og definere opptaket parametrene og banen til de innspilte datastrømmene (se SoftSide for detaljer om hvordan å sette opp et opptak oppsett).
Merk: En anskaffelse med en samplingsfrekvens på 20 kHz er vanligvis nok for de fleste programmer. En høyere samplingsfrekvens anbefales hvis mer presisjon kreves i spike tidsberegninger. Hvis man har til hensikt å registrere pigger, satt en høypassfilter ved 300 Hz, som vil dempe lavere frekvens komponenter av signalet. Hvis rå og filtrerte data registreres samtidig, vil dette vesentlig øke data filstørrelse. Det er alltid mulig å gjøre offline filtrering av rådata. For å redusere data kan fil-størrelse en også begrense microelectrodes som posten (f.eks bare microelectrodes i microgrooves). - Klikk Start DAQ for å starte datainnsamling. Sjekk Hvis viser displayet kjører spor av aktivitet og start innspillingen.
Merk: Støynivået er vanligvis litt høyere i microelectrodes tilsvarer microgrooves. Hvis støyen er for høy (topp-til-peak amplitude > 50 µV) eller ustø i flere microelectrodes, det kan være på grunn av smuss hindrer en god pin-pad-kontakt. Dette problemet er vanligvis løst ved å forsiktig rense MEA kontakt pads og forforsterker pinnene med en bomullspinne fuktet med 70% etanol. - Åpne innspilte i analyseprogramvare (se Tabell for materiale) å raskt utforske dataene.
6. dataanalyse
Merk: Følgende viser hvordan du bruker µSpikeHunter programvaren, et beregningsorientert verktøy utviklet ved Aguiar's lab (fritt tilgjengelig på e-post forespørsel til pauloaguiar@ineb.up.pt), for å analysere data med µEF. Et grafisk brukergrensesnitt (figur 2) brukes til å laste inn dataene, identifisere spre spike bølger, bestemme retning (anterograd eller retrograd) og beregne overføringen hastigheter. µSpikeHunter er kompatibel med HDF5 filer generert opptak Hentet ved hjelp av MEA2100-familien systemer, som kan brukes i forbindelse med 60 - 120- og 256 elektrode tiltak. Opptakene får flerkanals eksperimentator kan enkelt konverteres til HDF5 filer ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare (se Tabell for materiale).
- Klikk Bla gjennom for å velge innspillingsfilen. Klikk knappen filinformasjon for å liste samplingsfrekvensen, Innspillingstiden samt en liste over registrerte datastreamer (f.eks rådata, filtrerte data).
Merk: For ekte overføring hastighet vurderingen, det anbefales å velge rå datastrømmen for analyse. - Velg microelectrodes (én rad eller kolonne med Mikrokuttspor) for analyse og angi spike oppdagelsen terskelverdien (positiv eller negativ fase) på 6 x standardavviket (SD) for signal-støy. Klikk Lese Data for å bruke hendelsen detektoren og få den identifiserte forplantning sekvenser.
Merk: Hvis kriteriene er oppfylt, vil en liste over oppdagede forplantning sekvenser befolke analyse panelet. Brukeren kan vise og samhandle med flere verktøy for overføring forløp, inkludert spenning spor, Inter microelectrode kryss-sammenhenger, enkelt-sekvens overføringen hastigheter, en kymograph og et verktøy for lydavspilling. Selv om forplantning hastighet estimering kan oppnås for noen par av microelectrodes eller som gjennomsnittet av anslagene for alle par, er dette anslaget mer pålitelig hvis lengst paret er valgt. - Gjenta forrige trinn for microelectrode sett av interesse. Klikk Lagre alle hendelser for å spare tid og amplituden til toppene (på hver av microelectrodes) for alle identifiserte forplantning sekvenser til en CSV-fil.
- Importere CSV-filer til data analyse miljøer for videre analyse av mønstrene for kultur (f.eks skyte rate, mellom spike intervaller).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, er E-18 rotten kortikale nevroner seeded på µEF kjøpedyktig utvikle og forbli sunt i disse kultur forhold for over en måned. Så snart 3 til 5 dager i kultur, vokse kortikale nevroner deres axons gjennom microgrooves mot den axonal kupé av µEF (figur 1). Etter 15 dager i kultur, kortikale nevroner kultivert på µEF er forventet jevn aktivitetsnivåer og overføring av handlingen potensialer langs microgrooves forventes. Eldre kulturer (> 14 DIV) tendens til å bli dominert av sprengning aktivitet som konvensjonell MEA opptak18,19.
Opptak og data analyse
Rå dataanalyse med µSpikeHunter (figur 2) tillatt gjenkjenning og utvinning for topp bølgene langs sett med 4 microelectrodes (i microgrooves). Figur 3 viser én av disse hendelsene. µSpikeHunter tillatt for estimering overføring fart, basert på tvers-sammenhenger mellom spenningen bølgeformer av valgte microelectrodes (gi en tidsforsinkelse) og tilknyttede kjent mellom elektrode avstanden.
Hentet data ble ytterligere analysert ved hjelp av egendefinerte utformet kode i MATLAB. En representant raster tomt de spre pigge bølgene langs 11 (av 16) microgrooves er vist i figur 4a. Øyeblikkelig brenning hastighet for en høy og en lav aktivitet Mikrokuttspor er vist i figur 4b.
µEF recordings utstilling varierende grad av aktivitet per microelectrode. Ofte er flere microelectrodes i somal rommet "stille". Men de fleste microelectrodes innen microgrooves tendens til å være aktive (figur 5a). Det er også beskrevet som microgrooves funksjonen som signal forsterkere8. Amplituden til et registrert signal avhenger ikke bare av størrelsen på kilden strøm, men også resistivitet av omkringliggende media. Motstanden langs en Mikrokuttspor er spesielt høy, som sterkt øker amplituden målt signaler sammenlignet med de av microelectrodes i somal rommet (figur 5b).
Figur 1 . Embryonale rotte kortikale nevroner kultivert på µEF. (a) bilde av µEF. Skala bar: 1 cm. (b) representativt bilde av kortikale nevroner kultivert i µEF for 5 dager, viser flere axons krysset microgrooves og nå axonal batterirommet (piler). Skala bar: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Skjermen fange av µSpikeHunter viktigste grafiske brukergrensesnitt. Brukeren kan laste dataene med µEF, identifisere spre spike bølger, bestemme retning (anterograd eller retrograd) og beregne overføringen hastigheter. En kymograph verktøyet lar brukeren manuelt anslå forplantning hastigheten basert på en linje på kymograph. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Anterograd overføre spike bølge kjente av 4 microelectrodes (E8-E11) i en Mikrokuttspor. Hvert spor representerer én microelectrode rå innspilling for 3 ms. etter analyse med µSpikeHunter, cross-sammenhengen mellom de lengst microelectrodes (E8 og E11) tillatt beregning av en overføring hastighet av 0.52 m/s. Klikk Vennligst her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Informasjon barrage gjennom microgrooves. (a) representant raster tomten 2 minutter av spontan aktivitet registrert langs 11 microgrooves. Hvert punkt representerer en spre spike bølge (enhet) kjente av 4 microelectrodes og identifisert gjennom analyse med µSpikeHunter. Høy og en lav aktivitet Mikrokuttspor utheves i gult og rødt, henholdsvis. (b) utviklingen av øyeblikkelig brenning hastighet (som i rente-koding) for de to merkede microgrooves langs 10 minutter. Bare spre enheter ble ansett for beregning av brenning hastighet. Merk aktivitet synkroniseringen, til tross for de forskjellige avfyring rate nivåer. Øyeblikkelig brenning hastighet ble beregnet convolving pigg hendelsene med kjerne Gaussian med et standardavvik 100 ms. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Kvaliteten på ekstracellulære opptak i µEF. (a) vinduet (1 sekund) av µEF innspillingen (rat kortikale nevroner i 15 dager i vitro) med en samplingsfrekvens på 20 kHz og en høypass-filteret på 300 Hz. elektrode rad 1-7 tilsvarer den somal kupeen og rader 8-11 til microgrooves. (b) boksen og whisker plott av hele spekteret av spike amplituder utvunnet (pigger oppdaget bruker en terskel metode, med negative fase, satt på 6 x standardavvik) fra de angitte radene (total innspillingstid 10 minutter). Toppene amplituder er betydelig større microelectrodes i microgrooves (rader 8-11, 16 microgrooves), sammenlignet med microelectrodes av somal kupé (rad 1-7, 16 aktive microelectrodes). Enveis ANOVA, Dunn er flere sammenligning tester, ***p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presenteres her viser hvordan å montere en µEF, en microfluidic-enhet og en MEA med standard kommersielt tilgjengelig design, og analysere de innspilte dataene.
Når du utformer et eksperiment, må forskere ta hensyn til at modellen i vitro er begrenset av MEA faste rutenettet, som begrenser Mikrokuttspor ordninger. Bruk av en bestemt microfluidic eller MEA design vil avhenge av eksperimentelle behovene, men vanligvis samme fremgangsmåten skal gjelde for ulike µEF konfigurasjoner.
En viktig beslutning skal gjøres før µEF montering er om brukeren har til hensikt å bruke den sammensatte µEF i fremtiden eksperimenter. Behandling med oksygen plasma på både flater kan gjøres for å covalently bånd microfluidic enheter til tiltak20. Men gjør denne tetting ofte MEA chips ubrukelig for videre studier, som kobler microfluidic enheten irreversibelt skader passivation laget. For å omgå dette problemet, pleier forskningsgrupper å bruke den monterte µEF, til tross for mulig ulempene (f.eks rusk fra forrige eksperimenter). Følger fremgangsmåten i denne protokollen, fra eksperiment å eksperimentere, kan trygt feste og løsne microfluidic enheter uten å skade MEA.
Bruk av µEF kan isolasjon av axons innenfor microgrooves. Tiden som kreves for et rimelig antall axons å krysse microgrooves avhengig sterkt av cellen seeding prosedyre, nemlig seeded celle tetthet. Bruke tetthet angitt i denne protokollen, nerveceller bruke å krysse den hele Mikrokuttspor i 3 til 5 DIV.
Avhengig av kultur miljøet (dvs. inkubator og luftfuktigheten), kan det måtte erstatte media hver 2 til 3 dager kultur. Når fornye media, fjerne media fra µEF brønner samtidig medier i de viktigste kanalene. Deretter forsiktig legge media µEF fordelt slik at det sakte strømme gjennom den viktigste kanalene før utfyllingen brønnene med siste media volum. Etter disse anbefalingene er vi kjøpedyktig vedlikeholde disse kulturene i sunne arbeidsforhold i minst en måned.
En viktig fordel med denne plattformen er muligheten til å isolere, måle og spore axonal signaler. Selv om µEF innspillingen er enkelt, den store mengden data som kan genereres er tungvint å håndtere og krever god kjennskap til dataanalyse. Analyseprogramvare brukt her, µSpikeHunter21, er en avansert men intuitivt beregningsorientert verktøy, som gir detaljert kvantifiseringen flere relaterte tiltak (f.eks overføre hendelser, overføring hastighet etc.) i noen få skritt. Selv om dataanalyse ikke er fokus for denne protokollen, kan informasjonen her allerede utvinning av meningsfull data fra et opptak for µEF. Det er imidlertid viktig å merke seg at pålitelige isolasjon av et enkelt axon per Mikrokuttspor forblir upraktisk. Dermed kan svært komplekse spike bølgeformer (på grunn av flere axons passerer gjennom Mikrokuttspor) oppstå og påvirke spike tidsberegninger og overføring hastighet beregninger. Denne begrensningen kan bli svekket ved hjelp av svært smale microgrooves (under 5 µm)13 og/eller gjennom spike sortering teknikker21, som å skille ulike signalkilder.
Selv om i vitro kulturer ikke recapitulate full i vivo kompleksiteten, kan kombinasjonen med µEF godt kontrollerte opp-forskningen tilnærmelser. Vi håper denne protokollen vil hjelpe både nybegynnere og dyktig MEA brukere opprette nye og pålitelig modeller for å studere elektrofysiologiske kommunikasjon i nevrale kretser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento regionale midler gjennom KONKURRERE 2020 - Operacional program for konkurranseevne og internasjonalisering (POCI), Portugal 2020, og av portugisisk midler gjennom FCT - Fundação para en Ciência e en Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior i rammen av prosjektet PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus ble støttet av FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar ble støttet av Programa Ciência - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - kampanjen av vitenskapelige sysselsetting, ESF og MCTES og program Investigador FCT, POPH og Fundo sosiale Europeu. Microfluidic enhetene ble laget på INESC - Microsystems og nanoteknologi, Portugal, under oppsyn av João Pedro Conde og Virginia Chu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
