Здесь мы представляем протокол для Роман разрыв соединения межклеточные связи assay предназначен для высокопроизводительного скрининга разрыв соединения модулирующих химических веществ для обнаружения наркотиков и токсикологические оценки.
Разрыв соединения (GJs) являются каналы клеточной мембраны, которые позволяют диффузии молекул меньше 1 кДа между соседними ячейками. Как они физиологических и патологических ролей, существует необходимость высокопроизводительного скрининга (HTS) анализов для выявления GJ модуляторы в наркотиками открытий и токсикологии анализов. Роман йодид желтый флуоресцентный белок разрыв соединения межклеточные связи (I-рекламы ЯФП-GJIC) пробирного удовлетворяет эту потребность. Это на основе ячеек пробирного, включая доноров и акцепторов клетки, которые разработаны для стабильно Экспресс вариант желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП), чьи флуоресценции чутко закаленном йодида, или SLC26A4, иодид транспортер, соответственно. Когда йодида добавляется к смешанной культуре клеток двух типов, они ввести клеток донора через SLC26A4 транспортер и диффузного в прилегающих акцептора клетки через GJs где они утолить рекламы ЯФП флуоресценции. Рекламы ЯФП флуоресценции измеряется от скважины в кинетическую режиме. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФП. Assay надежный и быстрый, чтобы использоваться для Хайтс Протокол assay рекламы ЯФП-GJIC с использованием LN215 клеток, клеток глиомы человека, описал.
Разрыв соединения (GJs) выступать в качестве межклеточного каналы, чтобы разрешить распространение малых молекул < 1 кДа таких питательных веществ, метаболитов и сигнальных молекул между соседними ячейками. Соединительной элементы включают hemichannel или Коннексоны в каждой ячейке, и каждый Коннексоны представляет собой шесть connexins (Cxs)1. GJs и Cxs были использованы в токсикологии анализов канцерогенных веществ таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), которые являются GJ ингибиторы2,3,4. Нарушена GJIC был связан с nongenotoxic канцерогенез5,6. Как потенциальной терапевтической цели ГДЖ участие было сообщено в частности подтипы изъятий7,8, защита от сердца и мозга ишемии/реперфузии травмы9, мигрень с аурой10, лекарственно индуцированные травма печени6,11и ранозаживляющее12. Высокопроизводительного скрининга (HTS) анализы необходимы для выявления GJ-модулирующих химических веществ или антител для обнаружения наркотиков, для анализов токсикологии и выявления роман сотовой регуляторы активности GJ. HTS анализов может также использоваться для расследования связей структура активность GJ модуляторы2,13,,1415.
Некоторые GJIC анализы включают переноса красителя или двойной патч зажим методов. Люцифер желтый чемпион (LY) и Флуорексон acetoxymethyl эфира (Флуорексон ам) были использованы в красителях передача анализов. Клетки не проницаемой для LY, который вводится путем микроинъекции, лом загрузки или электропорации. Раз внутри клетки, LY распространяется на соседние клетки через GJs и GJ деятельность assayed масштабы миграции LY16. Флуорексон-ам анализов обычно включают в себя разрыв флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание17,18. Флуорексон-ам является клеток permeant красителем, который внутриклеточно преобразован в непроницаемой Флуорексон внутренней эстеразы. Assay требует Конфокальный микроскоп для наблюдения за передачей Флуорексон ам в клетку от окружающих его после лазерной Фотообесцвечивание. Если функциональные GJs присутствуют, Флуорексон ам в соседних ячейках входит photobleached клеток и флуоресценции восстанавливается. GJ активность assayed по степени восстановления флуоресценции клеток photobleached. Анализы на красителях передача кропотливая и требует много времени или низкой чувствительности. Зажим двойной патч является электрофизиологических метод, который измеряет соединительной проводимости. Это относительно чувствительных, с прямая зависимость проводимости на количество открытых GJs19; Однако она является технически сложным, трудоемким и дорогим20. Assay рекламы ЯФП-GJIC был разработан для использования в Хайтс
Рисунок 1 иллюстрирует компоненты и действия рекламы-ЯФП GJIC assay, который использует акцептора клетки, выражая вариант рекламы ЯФП йодид чувствительных, H148Q и I152L (QLрекламы ЯФП) и клеток донора, выражая йодида транспортера (SLC26A4)21 . Две мутации, перевозимых рекламы ЯФПQL позволяют тушения флуоресценции йодида22. Йодиды добавляются к совместно культивируемых акцептора и клеток донора; не вводите акцептора клетки, они принимаются до настоящего SLC26A4 транспортеры на клеток донора. Йодиды в клеток донора диффундируют через функционирование GJs в прилегающих акцептора клетки, где они утоляют рекламы ЯФПQL флуоресценции. Если GJs закрыты или заблокированы ингибиторы, йодида нельзя ввести акцептора клетки, чтобы утолить флуоресценции. GJ деятельность отражает скорость тушения рекламы ЯФПQL . Процедура анализа GJIC рекламы-ЯФП сложным ни много времени. Он совместим с HTS и может использоваться для проверки воздействия большого числа соединений на ГДЖ активность в течение относительно короткого периода. Он требует только акцептора и клеток донора и два сбалансированных солевых растворов. Протокол, в описанный ниже основывается на LN215 клетки, чьи основные Cx-Cx4321. LN215-рекламы ЯФПQL рецепторов и LN215-я− доноров клеток были порожденных трансдукция с lentiviruses, выражая рекламы ЯФПQL или SLC26A421,23.
Assay рекламы ЯФП-GJIC может использоваться для HTS, потому что это надежный, быстрый и недорогой. HTS assay считается надежной Если Z’-фактор превышает 0,525. Смотреть Zhang et al. для описания статистического анализа, используемый для оценки пригодности HTS анализов25. Когда LN215 к?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано базовой программы исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством образования (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 и 2018R1A6A1A03023718).
96-well plate | SPL | 30096 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
pMD2.G | Addgene | #12259 | |
Polybrene | sigma | H9268 | |
Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
psPAX2 | Addgene | #12260 | |
Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |