Summary
De doelstelling van dit protocol is label, verrijken en identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster zoals een cel lysate of weefsel homogenaat. Deze methode maakt gebruik van unieke aspecten van CK2 biologie voor dit doel.
Abstract
De studie van kinase-substraat relaties is essentieel voor een compleet begrip van de functies van deze enzymen en hun downstream doelen in zowel fysiologische en pathologische staten krijgen. CK2 is een evolutionair geconserveerde serine/threonine kinase met een groeiende lijst van honderden substraten die betrokken zijn bij meerdere cellulaire processen. Wegens zijn pleiotropic eigenschappen, is identificatie en karakterisering van een uitgebreide set van CK2 substraten bijzonder uitdagende en blijft een hindernis in de studie van dit belangrijke enzym. Om aan deze uitdaging, hebben we een veelzijdige experimentele strategie waarmee de gerichte verrijking en identificatie van vermeende CK2 substraten bedacht. Dit protocol maakt gebruik van de specificiteit van de unieke dual co substraat van CK2 rekening houdend met de specifieke thiophosphorylation van de substraten in een cel of een weefsel lysate. Vervolgens worden deze eiwitten substraat Gealkyleerde, immunoprecipitated, en geïdentificeerd door vloeibare chromatografie/tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Wij hebben vroeger deze aanpak succesvol identificeren CK2 substraten van Drosophila eierstokken en hier verlengen we de toepassing van dit protocol aan menselijke glioblastoma cellen, ter illustratie van het aanpassingsvermogen van deze methode te onderzoeken de Biologische rol van deze kinase in verscheidene modelorganismen en experimentele systemen.
Introduction
Eiwit kinases zijn belangrijke componenten voor signaaltransductie cascades. Fosforylering van substraat eiwitten door deze enzymen lokt biologische reacties die kritieke gebeurtenissen controleren celdeling, metabolisme en differentiatie, o.a. regelen. CK2 is een acidophilic, overal die zich uiten serine/threonine kinase dat is geconserveerd uit gist bij de mens en dat speelt belangrijke rol in veel cellulaire processen variërend van transcriptionele verordening tot celcyclus aan apoptosis1 ,2,3. Het enzym is een heterotetramer samengesteld uit twee katalytische α (of α') subeenheden en twee regelgevende β-subunits4. Naast het feit dat zeer pleiotropic, vertoont CK2 twee andere ongebruikelijke kenmerken die haar analyse bemoeilijken, namelijk constitutieve activiteit5 en dubbele co substraat specificiteit6. Deze laatste eigenschap schenkt CK2 met de mogelijkheid om gebruik van GTP evenals ATP voor fosforylering van eiwitten van het substraat.
Genetische schrapping van de katalytische of regelgevende subeenheden van CK2 in muizen resulteert in embryonale letaliteit die aangeeft dat het een cruciale rol tijdens het ontwikkelen en organogenese7,8 speelt. CK2 is ook overexpressie in verschillende soorten kanker en vormt aldus een veelbelovend therapeutisch doel9,10,11. Inderdaad, specifieke remmers dat doel CK2 kinaseactiviteit momenteel onderzochte voor dit doel12,13,14. Terwijl remming van CK2 een haalbare optie is, gezien het pleiotropic karakter, een alternatief en misschien meer rationele benadering zou moeten richten op kritische CK2 substraten die ten grondslag liggen aan de voortgang van bepaalde kankers. Daarom zou de uitvoerige identificatie en karakterisering van CK2 substraat eiwitten aanzienlijk voordeel voor het ophelderen van de specifieke functie (s) van deze kinase binnen een bepaald weefsel of tumor type.
Hier beschrijven we een veelzijdige biochemische methode voor het identificeren van CK2 substraten uit een complexe biologische monster zoals een cel of een weefsel lysate. Dit protocol maakt gebruik van de specificiteit van de dubbele co substraat van CK2 door gebruik van de GTP analoge GTPγS (calciumguanosine 5'-[γ-thio]triphosphate) die andere endogene kinases niet kunnen gebruiken. Hierdoor kunnen effectief de kinase "label" haar substraten binnen dit voorbeeld voor latere isolatie en identificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Zorg ervoor dat de benodigde materialen beschikbaar en goed voorbereid zijn (Zie Tabel van materialen).
1. voorbereiding
- Mechanisch lyse weefsel monster (1-2 mg van weefsel in 100 µL van lysis buffer, tabel 1) of gekweekte cellen (10 cm plaat die is 80-90% heuvels in 350 µL van lysis-buffermengsel), met als doel om te verzamelen van een totaal van 900 µL van monster voor het experiment. Merk op dat dit volume in lichte overmaat is van wat vereist voor het experiment is hieronder beschreven.
- Spin down de monsters door centrifugeren bij 17.500 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Na voltooiing, breng 270 µL van het supernatans dat aan elk van de drie nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buizen. Er zullen ongeveer 90 µL resterende. Verwijder 40 µL moet worden gebruikt als een "invoercontrole" en breng dit in een nieuwe buis. Leg alle monsters op het ijs.
2. kinase assay: thiophosphorylation en alkylatie
- Label de drie buizen met 270 µL elke als volgt: "kinase rxn", "GTPγS", en "PNBM (p-nitrobezyl mesylaat) alleen". De kinase reacties voor te bereiden.
- Aan de "kinase rxn" buis, 2.7 µL (equivalent aan 1.350 U) CK2 toevoegen, voeg dan 2,7 µL van 2,5 mM GTPγS.
- Aan de "GTPγS alleen" buis, voegt toe 2.7 µL van 2.5 mM GTPγS, en vervolgens 2.7 µL van lysis buffer.
- Voeg aan de "PNBM alleen" buis, 5.4 µL van lysis buffer. Flick alle buizen om te mengen en vervolgens onmiddellijk plaats op ijs.
- Alle drie buizen voor 1 min in een waterbad van 30 ° C te incuberen. Na incubatie, aan alle drie buizen met toevoegen van 13,5 µL van 12 mg/mL PNBM. Omkeren te mengen van monsters. Incubeer deze monsters bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Na het starten van de incubatie in stap 2.2, bereiden de demineralisatie kolommen zo spoedig mogelijk als het proces duurt ongeveer 45 min.
3. voorbereiding voor het ontzouten van kolommen
- In eerste instantie bereid kolommen (3 voor dit voorbeeld experiment) door het omkeren van elke kolom meerdere malen naar hars resuspendeer de Sephadex G-25 in de opslag-buffer. Laat de hars te regelen door elke kolom vast te hechten aan een standaard klem en te laten zitten ongestoord gedurende ongeveer 5 minuten.
- Na afwikkeling van de Sephadex G-25 hars, de doppen verwijderen uit zowel de boven- en onderkant van de kolom om de buffer van de opslag te afvoer door de zwaartekracht en een buis geplaatst onder de onderste opening voor het verzamelen van de doorstroming voor negeren.
- Zodra opslag buffer is uitgeput, toevoegen ongeveer 2,7 mL lysisbuffermengsel om equilibreer de kolommen. Verzamel de doorstroming en negeren. Herhaal dit 3 keer. Na de definitieve equilibratietijd zijn de kolommen klaar voor stap 4.1.
4. de verwijdering van PNBM
- Nadat de 1U incubatie (stap 2.2) en de kolom voorbereiding (stap 3) voltooid zijn, gelden de monsters voor de kolommen. Label elke kolom als volgt: "kinase rxn", "Alleen GTPγS" en "Alleen PNBM". Laad alle van elk monster op de betreffende kolom. Verzamelen en gooi de doorstroming.
- Wassen monsters door 420 µL van lysis buffer toe te voegen aan elke kolom. Lysis-buffermengsel verzamelen de doorstroming voor teruggooi te filteren door de kolom toestaan. Na deze wassen stap, buizen in positie voor het verzamelen van monsters te plaatsen.
- Elueer monsters door 500 µL van lysis buffer toe te voegen aan elke kolom. Verzamel de doorstroming dat nu thiophosphorylated en Gealkyleerde CK2 substraten bevat.
5. Immunoprecipitation: Deel I
- Voorbereiding van monsters voor immunoprecipitation door eerste verwijderen 80 µL voor een "elutie input controle" monster uit elk van de respectieve elutions ("kinase rxn", "Alleen GTPγS" en "PNBM alleen") verzameld in stap 4.3. Na verwijdering van 80 µL van elk monster, zal er ongeveer 420 µL resterende per monster.
- Elk monster worden gesplitst in 2 buizen met elke 200 µL. Label elke respectieve buis: "kinase rxn anti-thiophosphate ester", "kinase rxn IgG", "GTPγS anti-thiophosphate ester", "GTPγS IgG", "PNBM anti-thiophosphate ester" en "PNBM IgG".
- Voeg 2.8 µg van anti-thiophosphate ester antilichaam aan elk van de anti-thiophosphate ester-geëtiketteerden buizen en 2.8 µg isotype controle antilichaam aan elk van de IgG-geëtiketteerden buizen. Plaats de buizen op een rotator bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Voorbereiding van eiwit A/G parel tijdens de laatste 15 min van de incubatie 2 h in stap 5.2 beginnen.
6. eiwit A/G agarose kraal voorbereiding
- Kort vortex de opslag buis om kralen zijn volledig opnieuw geschorst. Het einde van een P200 afgesneden pipette uiteinde met behulp van een schone scheermesje teneinde gauge grootte. Pipetteer 100 µL van de kraal drijfmest per immunoprecipitation in een nieuwe 1,7 mL microcentrifuge buis. Voor dit voorbeeld, een totaal van 6 buizen nodig zijn.
- Centrifugeer de buizen bij 17.500 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof verwijderen en weggooien. Resuspendeer de kralen in 200 µL van lysis-buffermengsel en kort vortex. Herhaal de spin en wassen stappen 3 keer.
- Na de definitieve wash, plaatst u de kralen op ijs totdat de incubatie in stap 5.2 voltooid is.
7. Immunoprecipitation: Deel II
- Na de incubatie 2 h vanaf stap 5.2 spin down de monsters bij 17.500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Na centrifugeren Voeg toe 200 µL van elk monster aan de buizen met de gewassen kralen. Plaats de buizen op een rotator bij 4 ° C gedurende 1 uur.
- Na de incubatie van 1 h, centrifugeer de buizen bij 17.500 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C. Volgende 40 µL van supernatant van elk monster verwijderen en opslaan als een "uitputting control" (totaal 6 buizen). Verwijder de rest van de bovendrijvende substantie en negeren. Wees voorzichtig niet te storen van de kralen.
- Het wassen van de monsters door toevoeging van 200 µL van lysis buffer en vortexing kort. Vervolgens Centrifugeer bij 17.500 x g voor 1 min bij 4 ° C. De bovendrijvende vloeistof verwijderen en weggooien. Herhaal het wassen en spin stappen 3 keer. Wees voorzichtig niet te verstoren de kralen tijdens deze stappen.
- Na het voltooien van de stappen wassen, voeg toe 50 µL van 2 x monster buffer aan elk monster met kralen. Voor alle andere monsters, voeg 8 µL van 6 x monster buffer: "invoercontrole", "elutie input besturingselementen" en "uitputting controls".
- Zodra de buffer wordt toegevoegd aan de buizen, Pipetteer omhoog en omlaag te mengen, en verwarmen van alle monsters bij 95 ° C gedurende 5 minuten voordat u verdergaat met SDS-pagina.
8. analyse/validatie van resultaten
- Valideren van succesvolle CK2-afhankelijke thiophosphorylation en alkylatie.
- Uitvoeren om te bepalen van de werkzaamheid van CK2-gemedieerde thiophosphorylation in stap 2.2, SDS-pagina en het westelijke bevlekken door 15-20 µL van de "elutie input controles" verzameld in stap 5.1 op een 12,5% polyacrylamide-gel uit te voeren.
- Sonde membranen met de volgende antistoffen: anti-thiophosphate ester, anti-CK2α, en anti-GAPDH (of andere passende laden controle). Als deze stap succesvol was, is een verbeterde anti-thiophosphate ester signaal moet herkenbaar in de baan van de "kinase rxn" in vergelijking met de andere twee rijstroken (Figuur 2).
- Visualiseer verrijkt putatief substraten voor CK2 en eiwit identiteit te bepalen.
- Uitvoeren om te beoordelen als de immunoprecipitation stappen succesvol waren, 25-30 µL van de monsters van de kralen in stap 7.4 op een aparte polyacrylamidegel van 12,5% geëlueerd. Ervoor zorgen dat alle apparatuur schone is en draag handschoenen te allen tijde tijdens deze stap naar het minimaliseren van verontreiniging.
- Vlek de gel met Coomassie blue te visualiseren verrijkt eiwitten uit verschillende stadia van het experimentele protocol (Figuur 3). Met behulp van nieuwe scheermesjes, presenteren zorgvuldig accijnzen unieke bands in de "kinase rxn anti-thiophosphate ester IP" lane, vaststellend van hun geschatte molecuulgewicht.
- Deze bands voor eiwit identificatie uiterlijk vloeibare chromatografie/tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) (Figuur 4). Als antistoffen gericht tegen de geïdentificeerde eiwitten beschikbaar zijn, bevestigen de resultaten van de Spectrometrie van de massa door SDS-PAGE en immunoblotting van input, uitgeput, en IP-breuken verzameld in de loop van het protocol (Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematisch diagram van de experimentele procedure wordt gegeven in Figuur 1. De onderliggende basis van de techniek is het ongebruikelijk vermogen van CK2 GTP eigenschappenstijl gebondenkleurstof groep overdracht. Toevoeging van exogene CK2 holoenzyme samen met de GTP analoge, GTPγS, naar een cel lysate resulteert in thiophosphorylation van endogene CK2 substraten. Latere behandeling van de lysate met de alkylerend reagens p- nitrobenzyl mesylaat (PNBM) genereert een deel daarvan van thiophosphate, ester op deze specifieke substraat eiwitten die vervolgens kunnen worden immunoprecipitated met behulp van een anti-thiophosphate ester antilichaam en uiteindelijk geïdentificeerd door massaspectrometrie. Figuur 2 toont een positief resultaat na de toevoeging van CK2 en GTPγS en vervolgens PNBM naar T98G (glioblastoma) cel lysate. Deze resultaten tonen aan dat CK2-afhankelijke-thiophosphorylation en daaropvolgende alkylatie succesvol waren. Zoals verwacht, is een verbeterde anti-thiophosphate ester signaal door het westelijke bevlekken alleen in de baan met de volledige kinase-reactie en niet in de GTPγS enige- en PNBM alleen behandeld monsters waargenomen. Afgebeeld in Figuur 3 is een Coomassie blue gebeitste gel van het immunoprecipitated en geëlueerd eiwitten met isotype controle IgG of anti-thiophosphate ester antilichamen in de aanwezigheid of afwezigheid van overtollige CK2 en/of GTPγS. Deze gegevens tonen ook een positief resultaat, zoals meerdere unieke banden zijn duidelijk alleen in de anti-thiophosphate ester IP-baan waarin de lysate was geïncubeerd met exogene CK2 en GTPγS. De band aangegeven met een sterretje was weggesneden uit de gel en voor identificatie van het eiwit afkomstig van massaspectrometrie. Figuur 4 illustreert representatieve gegevens verkregen door massaspectrometrische analyse, met inbegrip van eiwit identificatie, percentage dekking en aantal unieke peptiden geïdentificeerd per eiwit binnen de band. Weergegeven zijn de top tien hits uit de ingezonden band (Figuur 3) en informatie over het al dan niet het eiwit is eerder geconstateerd als substraat van CK215,16,17. De identiteit van een van de bekende immunoprecipitated CK2 substraten, nucleolin15, werd bevestigd door SDS-pagina en immunoblotting van de aangegeven gehalten met behulp van een anti-nucleolin antistof.
Figuur 1: Schematisch diagram van de experimentele strategie. De GTP analoog, GTPγS, samen met overtollige recombinant CK2 holoenzyme wordt toegevoegd aan een cel of een weefsel lysate en zorgt voor thiophosphorylation van substraten door CK2 maar niet door andere endogene kinases. Zijn volgende Gealkyleerde Thiophosphorylated substraten met PNBM, het genereren van een deel daarvan van thiophosphate, ester op deze eiwitten, die vervolgens worden opgevangen via immunoprecipitation (IP) voor de latere identificatie door vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie ( LC-MS/MS). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: validatie van CK2-afhankelijke thiophosphorylation in hele cel lysate. Hele cel lysates bereid uit T98G cellen werden geïncubeerd met GTPγS in de aanwezigheid (kinase reactie) of afwezigheid (GTPγS alleen) van exogene recombinante CK2 holoenzyme. PNBM werd vervolgens toegevoegd aan de aangegeven reacties en monsters werden opgelost door SDS-PAGE gevolgd door immunoblotting met de aangegeven antilichamen. In kDa worden proteïne molecuulgewicht markeringen aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Immunoprecipitation van vermeende CK2 substraat eiwitten. Verrijking en visualisatie van vermeende CK2 substraten (derde lane) is duidelijk als meerdere unieke banden na immunoprecipitation met anti-thiophosphate ester antilichamen. Immunoprecipitates werden opgelost door SDS-PAGE en de gel was bevlekt met Coomassie blue. De band die zijn gemarkeerd met een sterretje was weggesneden uit de gel en voor identificatie van het eiwit afkomstig van massaspectrometrie. In kDa worden proteïne molecuulgewicht markeringen aangegeven. IP = immunoprecipitation. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Identificatie en bevestiging van eiwitten als substraten voor CK2 in vitro. Gegevens die zijn verkregen door massaspectrometrie toont aan dat zowel eerder bekende15,16,17 , alsmede putatief roman CK2 substraten werden geïdentificeerd met behulp van deze experimentele aanpak. Weergegeven zijn de top tien eiwitten geïdentificeerd uit de verwijderde band (boven). De identiteit van nucleolin, een bekende CK2 substraat, werd bevestigd door immunoblotting van de aangegeven gehalten met behulp van een anti-nucleolin antistof (onder). In kDa worden proteïne molecuulgewicht markeringen aangegeven. IP = immunoprecipitation. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens voorraad concentratie | Reagens eindconcentratie | In het volgende voorbeeld volumes toegevoegd op basis van voorraad concentraties |
| 1 M Tris pH 7.4 | 20,0 mM | 200 ΜL |
| 4 M NaCl | 20,0 mM | 50 ΜL |
| 20% Triton X-100 | 0,50% | 250 ΜL |
| 1 M MgCl2 | 10.0 mM | 100 ΜL |
| 1 M DTT | 0.5 mM | 5 ΜL |
| 200 mM nb3VO4 | 1,0 mM | 50 ΜL |
| 500 mM NaF | 10.0 mM | 200 ΜL |
| 500 mM β-glycerol fosfaat | 10.0 mM | 200 ΜL |
| H2O | 8.945 mL | |
| + 1 volledige Mini tabblad/10 mL | 1 tablet |
Tabel 1. Recept van de buffer van de lysis van de (10 mL, 1 X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een relatief eenvoudige biochemische methode voor het identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster. De kritische stappen van dit protocol zijn gebaseerd op de ongewone enzymatische eigenschappen van CK2 en bevatten CK2-afhankelijke thiophosphorylation van specifieke substraat eiwitten met behulp van GTPγS en hun latere immunoprecipitation en identificatie. Met deze resultaten hebben wij het nut en de veelzijdigheid van deze aanpak aangetoond zoals wij nu deze strategie in zowel menselijke glioblastoma cellen en Drosophila eierstokken18hebben toegepast.
Een aantal eerder gepubliceerde studies met behulp van kwantitatieve Fosfoproteomics benaderingen hebben inderdaad bewezen succesvol in het identificeren van de roman CK2 substraten19,20,21,22, 23. echter enkele van deze strategieën maken gebruik van geïmmobiliseerdet substraat matrices, en het is mogelijk dat de gedaante van een geïmmobiliseerdet eiwit een potentiële fosforylatie site ontoegankelijk voor de kinase kan renderen. De hier beschreven techniek toelaat fosforylatie binnen een meer fysiologische of native-omgeving (dat wil zeggen, een cel lysate), waardoor vermindering van de waarschijnlijkheid van de ontoegankelijkheid van de website. Een ander voordeel van deze strategie is dat zodra het eiwit identificatie wordt bepaald door de massaspectrometrie, validatie van vermeende CK2 substraten gemakkelijk kan worden uitgevoerd op monsters die zijn verzameld tijdens de procedure als antistoffen tegen het substraat gericht expressie gebrachte eiwitten van belang zijn beschikbaar. Bijvoorbeeld moet met behulp van standaard westelijke bevlekken, men observeren een verlaging van het niveau van de relevante proteïne in de monsters verarmd (post-IP) en haar aanwezigheid in de anti-thiophosphate ester immunoprecipitates zoals we hebben aangetoond voor de bekende CK2 substraat nucleolin (Figuur 4).
Een belangrijke beperking van deze methode is dat de laatste stap van de procedure vóór de analyse door massaspectrometrie is gebaseerd op het vermogen om te onderscheiden van discrete verschillen in "banding" patroon op een gel. Het is dus zeker mogelijk dat specifieke CK2 substraten gemist kunnen worden als ze van lage overvloed en dus onder de limiet voor visuele detectie. Als men is bezorgd over deze mogelijkheid, kan een meer gevoelige methode zoals Zilveren kleuring worden gebruikt om te visualiseren van deze eiwitten in plaats van met behulp van Coomassie blue. Een extra overweging dat moet worden erkend is dat een aantal CK2 substraten niet kan worden geïdentificeerd met behulp van deze strategie, aangezien de fysiologisch relevante sites al gefosforyleerd in vivo zullen. Dit is bijna zeker het geval de constitutieve activiteit van CK2 gegeven. Ten slotte moet ook worden opgemerkt dat deze methode alleen eiwitten aangeduid als vermeende substraten voor CK2 in vitro. Daaropvolgende testen om te bevestigen dat dit fysiologisch relevante substraten voor CK2 in vivo zijn zijn vereist en identificatie van CK2-afhankelijke fosforylatie sites en beoordeling moeten inhouden als fosforylatie van deze bepaalde residuen gewijzigd in reactie op manipulatie van CK2 kinaseactiviteit.
Kortom vergemakkelijkt deze strategie in combinatie met stroomafwaartse experimentele benaderingen (fosforylatie site toewijzing door afkappen/schrapping analyse, plaats-geleide mutagenese, functionele in vitro en in vivo tests, enz) de studie van deze ongewone kinase en ons begrip van de verschillende rollen die CK2 in meerdere biologische systemen speelt zal toenemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een subsidie van de Commonwealth universele onderzoek verbetering van het ministerie van volksgezondheid van Pennsylvania naar T.I.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A.
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al.
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
