ATAC-seq test ADN Mitochondrial faible contamination de primaires humaines CD4 + Lymphocytes T

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour effectuer un test pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) sur activé CD4 + lymphocytes humains. Le protocole a été modifié pour réduire au minimum la contamination mitochondrial DNA lectures de 50 % à 3 % grâce à l’introduction d’une nouvelle mémoire tampon de lyse.

Résumé

ATAC-seq est devenu une méthode largement utilisée dans l’étude de l’épigénétique en raison de son approche simple et rapide à la cartographie de la chromatine accessible de tout le génome. Dans cet article, nous présentons un protocole ATAC-seq amélioré qui réduit la contamination lectures d’ADN mitochondriales. Alors que les précédents protocoles ATAC-seq ont lutté avec une moyenne de 50 % la contamination de l’ADN mitochondrial se lit, le tampon de lyse optimisé présenté dans le présent protocole réduit la contamination d’ADN mitochondriale à une moyenne de 3 %. Ce protocole de ATAC-seq amélioré permet de presque 50 % de réduction dans le coût du séquençage. Nous démontrons comment ces bibliothèques ATAC-seq de haute qualité peuvent être préparés de lymphocytes CD4 + activés, fournissant des instructions étape par étape de CD4 + isolation de lymphocytes du sang total par le biais de l’analyse des données. Ce protocole ATAC-seq amélioré a été validé dans un large éventail de types de cellules et sera d’une utilité immédiate aux chercheurs qui étudient l’accessibilité de la chromatine.

Introduction

Le dosage pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) est rapidement devenu la principale méthode pour interroger l’architecture de la chromatine. ATAC-seq peut identifier les régions de chromatine accessible à travers le processus de tagmentation, la fragmentation et le marquage de l’ADN par la même enzyme, pour produire des bibliothèques avec laquelle séquençage peut déterminer l’accessibilité de la chromatine dans un génome entier. Ce processus de tagmentation est médié par la transposase Tn5 hyperactif, qui ne coupe que les régions ouvertes de la chromatine en raison de l’encombrement stérique nucleosomic. Qui le touche, la transposase Tn5 insè....

Protocole

Ce protocole amélioré fournit des instructions détaillées pour l’exécution de ATAC-seq des lymphocytes CD4 +, de la matière première de sang grâce à l’analyse de données (Figure 1).

1. isolement des cellules de T CD4 + du sang total

Remarque : Le produit de départ pour ce protocole est de 15 mL de sang total frais prélevé à l’aide de procédures standards, permettant à la source des matières premières à être sélectionné issu des besoins de recherche. L’échelle du protocole selon les besoins. Réchauffez en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + sérum de veau foet....

Résultats

A partir de 15 mL de sang total frais, ce protocole génère une moyenne de 1 million de cellules T CD4 +. Ceux-ci peuvent être congelés pour un traitement ultérieur ou utilisés immédiatement. La viabilité des cellules T CD4 +, fraîches ou décongelées, était systématiquement > 95 %. Cette méthode d’isolement de cellules T CD4 + permet une flexibilité dans le temps de matériel et de la collection source. Ce protocole ATAC-seq amélioré produit une bibliothèque finale supérieure à 1 ng/µL p.......

Discussion

ATAC-seq mis à jour le protocole présenté dans cet article fournit des résultats reproductibles avec une contamination ADN mitochondriale minimale. Le protocole a été avec succès utilisé pour caractériser l’architecture de la chromatine des humains primaires PBMC¹⁰, des monocytes, cellules dendritiques de souris (non publiées) et cellules de mélanome cultivées les lignes¹¹. Nous prévoyons que cette amélioration lyse condition a la possibilité de travailler pour les autres t.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x PBS, Gibco stérile		10010023	Peut utiliser d’autres produits comparables.
5810/5810  ; Centrifugeuse réfrigérée à godets oscillants R avec godets tubulaires de 50 ml, 15 ml et 1,5 ml	Eppendorf	22625501	Peut utiliser d’autres produits comparables.
96 Plaque à fond rond bien	Thermo Scientific	163320	Peut utiliser d’autres produits comparables.
Système de station de bande Agilent 4200	Agilent	G2991AA	suggéré pour l’évaluation de la qualité.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Peut utiliser d’autres produits comparables.
DMSO	Sigma	D8418	Peut utiliser d’autres produits comparables.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Peut utiliser d’autres comparables Produits.
Kit ADN haute sensibilité	Agilent	50674626	suggéré pour l’évaluation de la qualité.
Chlorure de magnésium, hexahydraté, biologie moléculaire	Sigma	M2393	Peut utiliser d’autres produits comparables.
MinElute PCR Purification Kit (Tampon PB, Tampon PE, Tampon d’élution)	Qiagen	28004	Composant critique
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Peut utiliser d’autres produits comparables.
NaCl, Biologie moléculaire Grade	Sigma	S3014	Peut utiliser d’autres produits comparables.
NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2x tampon TD, enzyme Tn5)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Stérile dH20	Gibco	10977015	Peut utiliser d’autres produits comparables.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Peut utiliser d’autres produits comparables.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Peut utiliser d’autres produits comparables.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Composant critique
Qubit dsDNA HS Kit de dosage	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggéré pour l’évaluation de la qualité.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggéré pour l’évaluation de la qualité.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium Stem	Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Peut utiliser d’autres produits comparables.
Réservoir stérile	Thermo Scientific	8096-11	Peut utiliser d’autres produits comparables.
Thermocycleur T100 avec couvercle chauffant	BioRad	1861096	Peut utiliser d’autres produits comparables.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Peut utiliser d’autres produits comparables.