Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

Gel à haute pression est le procédé de préparation d’échantillon de choix pour l’obtention de préservation haute qualité, qui représente l’état natif d’un échantillon beaucoup mieux que les méthodes classiques de préparation à l’aide de fixation chimique¹. Cette méthode de cryo-préparation est utile pour les échantillons tels que souris myélinisées tissus² et une stricte obligation d’utiliser l’organisme modèle Caenorhabditis elegans³. Après Cryo-substitution et incorporation de résine, ces échantillons sont généralement analysés par microscopie électronique à transmission (TEM) ou la tomographie électronique (he). Si les plus gros volumes doivent être copiés à l’aide de FIB-SEM ou l’îlot série imagerie pour les reconstructions 3D haute résolution à grande échelle, selon notre expérience, l’imagerie appropriée par SEM est souvent entravé par le manque de contraste. Dans le FIB-SEM, l’image est généralement enregistrée par la détection des électrons rétrodiffusés par le faisceau d’électrons primaires. Le rendement en électrons rétrodiffusés est proportionnel à la teneur en métaux lourds dans l’échantillon. Par conséquent, protocoles ont été spécialement conçus pour volume d’imagerie pour renforcer le contraste par imprégnation d’autres métaux lourds. Ces méthodes reposent sur des échantillons fixes chimiquement et appliquent une combinaison de tétroxyde d’osmium-thiocarbohydrazide-tétroxyde d’osmium⁴, tel que décrit par Knott et coll.⁵, pour série îlot et axé sur le faisceau d’ions de microscopie électronique à balayage. Modifications, y compris l’utilisation de formamide et le pyrogallol⁶ ou plomb aspartate⁷ ont été appliquées avec succès pour les différentes techniques d’imagerie.

Le protocole fourni ici combine la cryo-préparation d’échantillons par HPF et Cryo-substitution avec ultérieures de traitement pour un contraste amélioré à l’aide de thiocarbohydrazide/osmium dans l’acétone à la température ambiante assistée par micro-ondes. Nous démontrons cela sur le jambier nervus myélinisées de souris et chez Caenorhabditis elegans, qui représentent des échantillons nécessitant une haute pression gel de qualité préservation. En outre, il est montré comment, après l’infiltration et la déshydratation, les échantillons sont intégrées avec comme peu de résine que possible. Cette minime résine enrobage⁸ permet un ciblage plus rapide de la structure d’intérêt et réduit le temps consacré au traitement des échantillons, y compris le moins de temps requis pour l’exposition de la région d’intérêt avec le faisceau d’ions. Après avoir effectué plus d’étapes de préparation d’échantillon à l’intérieur du microscope, d’imagerie et de broyage de l’échantillon sont effectué en permanence afin d’acquérir une pile d’images. Pour visualiser en 3D, logiciels (IMOD) est utilisé pour reconstruire les parties de l’objet dataset.

Notre flux de travail décrit comment le contraste entre le plus approprié des échantillons pour l’imagerie de volume peut être combinée avec la meilleure préservation de HPF et la cryosubstitution. Ceci est utile pour les échantillons qui exigent strictement cryo-préparation. Les applications sont limitées aux petits échantillons qui peuvent être préparés par HPF. Dans des échantillons de nature différente, tels que le matériel végétal ou de micro-organismes, ce protocole nécessite une adaptation.

Toutes les expériences, y compris les échantillons provenant d’animaux décrits ici ont été approuvés par l’Office d’état de Saxe inférieure et de l’institutionnel animalier pour la Protection du client et lavesarchitecte de sécurité alimentaire (construction).

1. haute pression congélation et Cryo-substitution

1. Disséquer le jambier nervus d’une souris (par exemple, C57Bl6N, 12 semaines, femelle)⁹.
2. Immerger le jambier nervus dans une gouttelette de polyvinylpyrrolidone 20 % (1 g de PVP dans 5 mL) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et couper les morceaux de 2 mm de longueur. Ensuite, placez-le dans un support d’échantillon métallique (Type A, 0. 2 mm de profondeur) à l’aide de pinces fines. Ajouter un autre transporteur plat (Type B) recouvert d’une fine couche d’hexadécane comme un couvercle et insérez cette Assemblée dans la cartouche de spécimen.
3. Transférer plusieurs c. elegans suspendu dans une gouttelette de 20 % sérum d’albumine bovine (BSA) en M9 (voir Table des matières) avec une pipette en plastique jetable dans le support métallique (Type A). Puis, ajouter un second porte-avions dans le couvercle sur le dessus (Type B) et assembler la cartouche.
4. Pour deux échantillons, aller de l’avant avec ce qui suit : haute pression geler les assemblées de transporteur échantillon un par un en les chargeant dans la cartouche trois pièces dans la station de chargement du congélateur à haute pression. Appuyez sur le bouton de processus selon mode d’emploi du fabricant.
   Remarque : Les deux types d’échantillons peuvent être traitées ensemble dans la substitution de gel ultérieures.
5. Placer les échantillons dans cryovials contenant 2 mL de l’acide tannique 0,1 % congelé dans de l’acétone. Effectuer le transfert dans un bain d’azote liquide sans azote liquide de se jeter dans les flacons. Transférer la cryovials dans un ensemble de¹⁰ unité de substitution de gel automatique à-90 ° C, puis démarrez le programme.
   Remarque : Les échantillons sont conservés à-90 ° C pour 100 h. acide tannique avant osmification est utilisé comme mordant pour augmenter l’absorption du tétroxyde d’osmium¹¹.
6. Laver manuellement les échantillons 3 x 30 min avec 2 mL d’acétone à-90 ° C dans l’appareil de substitution de gel.
7. Laisser les échantillons dans 2 mL de 2 % le tétroxyde d’osmium, 0,1 % acétate d’uranyle dans l’acétone pour la coloration permanente à l’automatique geler unité de substitution pendant 7 h à-90 ° C.
   Attention : le tétroxyde d’Osmium est toxique et doit être manipulé sous une hotte aspirante, et équipement de protection devrait être porté.
   Remarque : L’appareil de substitution gel déclenche automatiquement la température à-20 ° C à 5 ° C/h. Les échantillons sont conservés à-20 ° C pendant 16 h dans l’unité de substitution de gel. La température sera déclenchée automatiquement à 4 ° C à 10 ° C/h.
8. Échanger la solution tétroxyde d’osmium avec de l’acétone pur lorsque la température atteint 4 ° C. Retirez le cryovials de l’appareil de substitution de gel.

2. traitement assistée par micro-ondes

Remarque : Effectuez toutes les étapes suivantes à température ambiante¹² utilisant une unité de contrôle de température pour maintenir la température stable (voir Table des matières).

1. Laissez les bouchons des tubes réaction ouverte pendant le traitement au four à micro-ondes.
2. Prenez les transporteurs métalliques échantillon hors de la cryovials et supprimer les échantillons par le transporteur de métal à l’aide d’une pince fine ou une aiguille, tout en conservant les échantillons immergés dans de l’acétone dans un plat de verre de montre (150 mm).
3. Transférer les échantillons dans des tubes de réaction de 2 mL à l’aide d’une pince fine ou une pipette et laver avec 1 mL d’acétone quatre fois pour 40 s à 250 w.
   Attention : Thiocarbohydrazide est toxique et doit être manipulé sous une hotte aspirante, équipement de protection devrait être porté.
4. Tacher les échantillons avec 1 mL de thiocarbohydrazide de 1 % dans de l’acétone pendant 14 min à 150 W pour augmenter le contraste. Pour effectuer la coloration, déposer de la solution de thiocarbohydrazide dans le tube à essais, placer le tube dans le micro-ondes et configurer le programme pour un niveau de puissance de 150 W (avec la fonction aspiration en marche) pendant 2 min sur/2 min off, itération pendant 14 min total. Démarrer le four à micro-ondes.
   Remarque : Thiocarbohydrazide réagit avec le tétroxyde d’osmium qui a été appliqué lors de la substitution de gel. Il forme un pont, ce qui permet de plus le tétroxyde d’osmium à se déposer sur l’original le tétroxyde d’osmium sites¹³.
5. Laver les échantillons 4 x avec 1 mL d’acétone pour 40 s à 250 w. Pipette l’acétone dans un tube à essais, placer le tube dans le four à micro-ondes, puis sélectionnez 250 W pour 40 s. début du micro-ondes.
6. Tache dans 1 mL de 2 % le tétroxyde d’osmium dans l’acétone pendant 14 min à 150 w. Pipette de la solution de tétroxyde d’osmium dans un tube à essais, placer le tube dans le micro-ondes et configurer le programme pour un niveau de puissance de 150 W (avec la fonction aspiration en marche) pendant 2 min sur/2 min off , une itération pendant 14 min total. Démarrer le four à micro-ondes.
7. Laver les échantillons 4 x avec 1 mL d’acétone pour 40 s à 250 W (comme dans l’étape 2.5).
8. Infiltrer avec 1 mL des concentrations croissantes de résine dans l’acétone (voir Table des matières) de 25 %, 50 %, 75 %, 90 %, 100 % et 100 % pour 3 min chacun, à 250 w. Pipette la résine dans un tube à essais, placer le tube dans le four à micro-ondes et définir le programme à un niveau de puissance l de 250 W (avec la fonction aspiration en marche) pendant 3 min. commencer le four à micro-ondes.

3. minime résine enrobage⁸

1. Sortir le nervus tibialis et c. elegans hors du tube de réaction avec un cure-dent et placez les sur un morceau de plastique du film (voir Table des matières).
2. Utilisez le cure-dent pour pousser doucement l’échantillon sur le film plastique jusqu'à ce qu’aucune résine restante n’est détectée. Utiliser une lampe halogène pour chauffage (voir la Table des matières) afin que la résine devient moins visqueuse et est capable d’enlever plus facilement. Place la lampe halogène proximité suffisante pour chauffer la résine (en veillant à ne pas brûler les mains).
3. Polymériser les échantillons pendant au moins 48 h à 60 ° C au-dessus de la pellicule de plastique dans le four.

4. préparation pour FIB-SEM

1. Découpez les échantillons polymérisés avec le film plastique à l’aide d’une lame de rasoir à une taille pose le talon de la SEM et joignez-les aux stubs de SEM à l’aide d’une résine argentée conductrice (voir Table des matières). Polymériser à nouveau à 60 ° C pendant au moins 4 h ou toute une nuit.
2. Manteau de pulvérisation les échantillons sur le SEM talon d’or pendant 1 min à 35 mA à l’aide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique (platine/palladium peut également être utilisé, une couche épaisse de 10 nm est suffisante) et placez-les à l’intérieur le FIB-SEM.

5. d’acquisition de données à l’intérieur de la FIB-SEM

1. Les échantillons d’images avec le détecteur d’électrons secondaires à l’aide du logiciel de base conduisant au microscope (voir Table des matières). L’échantillon doit être orientée afin que la région d’intérêt (par exemple, la partie centrale de la nervus tibialis ou c. elegans) est dans le champ de vision.
   Remarque : Pour effectuer la collecte de données, inclinez la scène à un poste afin que l’échantillon soit tournée vers le faisceau d’ions à un angle de 90° à une distance de travail appropriée (5 mm) dans le point de coïncidence dite du faisceau d’ions et d’électrons. À l’aide de notre instrument, ceci est réalisé à une inclinaison de la scène de 54° et distance de travail de 5 mm.
2. Pour définir la position correcte de l’échantillon, centrez une caractéristique commune à une inclinaison de 0° en imagerie avec le détecteur d’électrons secondaires. Lentement, inclinaison à 54° (5°, 20° et 54°), recentrage le même objet en déplaçant l’axe M.
3. Trouver le point de coïncidence en la centrant une fonctionnalité tout en imagerie avec le détecteur d’électrons secondaires à 54°, puis en déplaçant la fonction sur la position centrale dans le mode de la FIB. Exécutez cette fonction en affichant la ligne de mire dans le logiciel SEM d’avoir une idée du centre. Puis déplacez d’abord la fonction de l’échantillon au centre de la zone de l’image en utilisant la fonction de point de centre du logiciel SEM. Puis centre la fonctionnalité le long de l’axe des ordonnées en déplaçant la scène en z. Tout décalage final entre la FIB et SEM est corrigé avec la Maj de faisceau de SEM.
4. Ouvrez le logiciel avancé (voir Table des matières) pour l’enregistrement des ensembles de données 3D et suivez l’assistant logiciel étape par étape.
5. Dans la région d’intérêt, de dépôts de carbone ou de platine (400 nm) sur le dessus le ROI utilisant un nA 3 actuel pour permettre même de fraisage et de réduire les artefacts induite par la charge.
   Remarque : En dessinant la région d’intérêt à être blanchi sur la surface de spécimen photographiée avec le FIB (largeur, hauteur, profondeur), le logiciel calcule et superpose les tailles des fonctionnalités préparation échantillon différent, comme les tranchées pour être blanchi ou zone pour dépôt de platine/carbone. Aussi, méfiez-vous de l’imagerie de la surface de l’échantillon avec des courants de FIB trop élevé, car cela pourrait endommager la surface de l’échantillon. Un courant de 50 pA suffit pour l’imagerie.
6. Utiliser le faisceau ionique focalisé pour fraiser une tranchée afin d’exposer la région d’intérêt (ROI) à l’aide d’un courant de nA 15/30.
7. Utilisez le faisceau ionique focalisé pour polir la coupe avec une nA 7 actuel.
8. Après avoir terminé la préparation de l’échantillon, mis en place les paramètres suivants d’imagerie : FIB fraisage des paramètres dans l’onglet de configuration de la FIB (FIB fraisage courant) ; SEM d’imagerie des paramètres dans l’onglet configuration et l’image de réglage des paramètres dans l’onglet SEM AutoTune (effectuer la mise au point automatique et autostigmation toutes les 60 min, taille de pixel 50 nm, temps de pause 3, ligne 3 de moyenne). Optimiser cela pour chaque échantillon.
9. Pour éviter toute dérive thermique provoquant l’îlot à la dérive pendant la course, quitter la pièce pendant au moins 2 h avant de commencer l’acquisition.
10. Acquérir le dataset dans un laminoir continu et obtention de mode ayant un FE 700 FIB actuel. Utilisation 1,5 kV (mode analytique, 900 V) détecteur d’ESB avec une tension de grille de 400 V pour acquérir des images chacun avec 5 taille de pixel de nm en utilisant le logiciel avancé (voir Table des matières) et l’épaisseur de tranche 50 nm. Une acquisition d’images prend environ 1,5 min avec un temps de pause de 6 µs.
11. Démarrer l’acquisition de données. Une image FIB à la mouture actuelle est acquise pour s’assurer que l’échantillon ne bougeait pas et la droite zone d’intérêt est sélectionnée. Ajuster si nécessaire.

6. visualisation de données

1. Ouvrir des images dans les îles Fidji en faisant glisser le dossier contenant toutes les images dans les îles Fidji et sélectionnez Pile virtuelle.
2. Recadrer la zone concernée à l’aide de l’outil rectangle (Image > culture).
3. Inverser les données pour montrer le contraste de microscopie électronique de transmission traditionnelle à membranes apparaissant dans l’obscurité (Edition > inverser).
4. Utilisez TrackEM2¹⁴ (Fidji¹⁵) pour l’alignement. Charger les données dans TrackEM2 (File > New > TrackEM2) en cliquant sur couche. Une fois toutes les images sont chargées, les aligner à l’aide de la fonction mosaïque multicouche (faites un clic droit sur Image > aligner > aligner multicouche mosaïque). Après mise en conformité, les images sont exportés en fichiers tiff individuels (faites un clic droit sur image > exportation > Make image plate). Sélectionnez toutes les images qui doivent être exportés et choisissez enregistrer dans fichier.
5. Pour le post-traitement, utiliser un flou gaussien (processus > filtres > flou gaussien; sigma 2) et amélioration du contraste local (processus > améliorer les contrastes locaux; CLAHE : blocksize 127, bacs histogramme 256, pente maximale 1,5), qui sont appliqués aux Fidji pour lisser l’image et obtenir un meilleur rapport signal sur bruit.
6. IMOD¹⁶ est utilisé pour effectuer une segmentation manuelle et visualiser la structure d’intérêt en 3D. Ouvrez l’objet dataset IMOD et sélectionnez outils de dessin (spécial > outils de dessin) pour effectuer la segmentation manuelle. Différents outils manuels peuvent servir à suivre la structure d’intérêt dans tout le volume (par exemple, Join, Sculpt). Utilisez gestionnaire d’Image de microscopie (MIB¹⁷) pour la segmentation semi-automatique.

Le workflow démarre auprès d’un échantillon (ici, une souris fraîchement disséqués nervus tibialis) étant placé dans des transporteurs métalliques haute pression gel (Figure 1 a). Les transporteurs sont récupérés de l’azote liquide (Figure 1 b) et placés dans une unité de remplacement de gel sur le dessus de la gelée chimique premier cocktail (Figure 1C). Après un long gel protocole de substitution dont 2 % d’acétate d’uranyle tétroxyde d’osmium et de 0,1 %, les échantillons sont retirés les transporteurs à température ambiante (Figure 1D). Afin d’améliorer le contraste, les échantillons sont transférés dans des tubes en plastique pour être traitées dans le four à micro-ondes (Figure 1e). La chambre à vide et le régulateur de température sont utilisés pour optimiser le procédé (Figure 1f).

Pour être en mesure d’effectuer l’enrobage minimal résine, cure-dents et feuilles de matière plastique sont nécessaires (Figure 2 a). Après infiltrant les échantillons avec de la résine en utilisant le four à micro-ondes, ils sont placés sur des morceaux de pellicule de plastique et se déplaçait jusqu'à ce qu’aucune résine n’est laissée sur la surface de l’échantillon. Une lampe halogène est utilisée pour aider à drainer la résine restante et laisser l’échantillon minimalement incorporé (Figure 2 b) sur la pellicule de plastique. Il est à noter que plus de résine extraite de la partie supérieure de l’échantillon est bon. Il faut toujours une petite quantité à gauche sous l’échantillon de le garder attaché au substrat. L’échantillon étant polymérisé sur le film plastique est coupé et monté sur le toit de talon de SEM avec résine conductrice argent (Figure 2C). Le talon est polymérisé pendant au moins 4 h à 60 ° C (Figure 2d). Les composants doivent être bien mélangés ou le mélange peut se polymériser pas correctement. Pour éviter la charge à l’intérieur de la microscopie électronique à balayage, le talon est cathodique recouvert d’or ou de platine/palladium (Figure 2e).

Les échantillons sont placés dans le FIB-SEM et photographiés avec un détecteur d’électrons secondaires pour cibler la zone d’intérêt (Figure 3 ae). Un faisceau d’ions est utilisé pour enlever la matière directement en face de la région d’intérêt à exposer une coupe transversale (Figure 3 b-d, 3f-h). Des protocoles standard souffrent souvent d’un manque de contraste de la membrane (Figure 3 bf), considérant que le protocole amélioré offre un contraste de membrane solide (Figure 3 c-d, 3 g-h).

Les données de l’EM (après post-traitement) sont visualisées à l’aide de IMOD, un traitement d’images et modélisation. Pour parvenir à une meilleure compréhension de l’information 3D, virtual reslicing des données est utilisée (Figure 4 a). Différentes structures de l’objet dataset sont segmentés manuellement (Figure 4 b-d).

Figure 1 : à haute pression de gel Cryo-substitution et traitement assistée par micro-ondes. a déguster transporteur contenant la souris nervus tibialis, échelle bar 3 mm. (b) porteéchantillon contenant la souris nervus tibialis après à haute pression, échelle bar 3 mm. c automatique gel substitution (AFS) unité de congélation des échantillons. Médaillon : récipient en métal sur mesure pour les flacons d’échantillonnage jusqu'à 23 et deux grands flacons contenant des produits chimiques dans le cadre de la SRAPA. (d) les échantillons étant enlevés par les transporteurs dans un plat en verre dans de l’acétone, l’échelle bar 3 mm (e) les échantillons dans des tubes de réaction à mettre au micro-ondes pour le traitement. unité (f) contrôle de température et de la chambre sous vide du micro-ondes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : minime résine enrobage et préparation pour le FIB-SEM. (a) en plastique film et cure-dents qui sont utilisés pour la minime résine enrobage, échelle bar 4 cm. (b) Nervus tibialis vidé de résine sur le dessus de la feuille de plastique, échelle bar 250 µm. (c) Nervus tibialis polymérisé sur film plastique, puis couper et monté sur le toit de la longrine SEM avec résine conductrice (argent), échelle bar 250 µm. (d) échantillons polymérisés sur le dessus le talon de la SEM, échelle bar 3 mm. (e) échantillons revêtus d’or sur le talon de la SEM, échelle bar 3 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : préparation de l’échantillon à l’intérieur de la FIB-SEM. (a et e) Image d’électrons secondaires à l’intérieur de la FIB-SEM de l’échantillon de surface (a) échelle Nervus tibialis, bar 100 µm. (e) c. elegans, échelle bar 2 µm. (b-d) et (f-h) coupe transversale à travers l’échantillon à l’aide du détecteur de l’ESB pour l’imagerie. (b et c) Nervus tibialis, échelle bar 2 µm. (f et g) c. elegans, échelle bar 1 µm et 200 nm. (b et f) Le résultat est indiqué de haute pression congélation et Cryo-substitution sans amélioration, alors que toutes les autres images montrent des résultats de Cryo améliorés substitution. (d et h) Image détaillée de l’échantillon à l’aide du détecteur de l’ESB. (d) Nervus tibialis, échelle bar 200 nm. (h) c. elegans, échelle bar 200 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : acquisition et visualisation d’images. b données de EM IMOD avec pratiquement resliced x / y/z-planes et z - échelle bar 2 µm. (b) segmenté axones sur EM données (bleues), Remak faisceaux (rouge), les gaines de myéline (jaune et orange) et mitochondries (turquoises), échelle bar 2 µm. (c et d) modèle 3D, échelle bar 2 µm et 500 nm . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.