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Genetics

बढ़ाया खमीर एक संकर स्क्रीन मानव डीएनए दृश्यों के लिए प्रतिलेखन कारक की पहचान करने के लिए

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक बढ़ाया खमीर एक संकर स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए प्रतिलेखन कारकों (TFs) कि ब्याज की एक मानव डीएनए क्षेत्र को बांध कर सकते है की पहचान । यह विधि एक उच्च-प्रवाह जांच पाइपलाइन का उपयोग करता है जो एक ही प्रयोग में > 1000 TFs के बंधन पूछताछ कर सकते हैं ।

Abstract

प्रतिलेखन कारकों (TFs) है कि प्रत्येक मानव जीन को विनियमित के सेट की पहचान एक चुनौतीपूर्ण काम है कि कई प्रयोगात्मक और गणना के दृष्टिकोण को एकीकृत करने की आवश्यकता है । ऐसा ही एक तरीका है खमीर एक संकर (Y1H) परख, जिसमें TFs और डीएनए क्षेत्रों के बीच बातचीत खमीर रिपोर्ट जीन का उपयोग नाभिक के वातावरण में परीक्षण कर रहे हैं । Y1H परख दो घटकों को शामिल: एक ' डीएनए ' चारा (जैसे,प्रवर्तकों, बढ़ाने, silencers, आदि) और एक ' TF-शिकार, ' जो रिपोर्टर जीन सक्रियण के लिए जांच की जा सकती है । Y1H स्क्रीन के प्रदर्शन के लिए सबसे प्रकाशित प्रोटोकॉल TF-शिकार पुस्तकालयों या arrays डीएनए-चारा खमीर उपभेदों में बदलने पर आधारित हैं । यहां, हम एक पाइपलाइन का वर्णन, बढ़ाया Y1H बुलाया (eY1H) परख, जहां tf-डीएनए बातचीत एक उच्च घनत्व सरणी (HDA) रोबोट मंच है कि एक १,५३६ में स्क्रीनिंग की अनुमति देता है का उपयोग कर tf-शिकार उपभेदों का एक सरणी संग्रह के साथ डीएनए-चारा उपभेदों संभोग द्वारा पूछताछ कर रहे है कॉलोनी प्रारूप । यह प्रवाह में एक नाटकीय वृद्धि के लिए अनुमति देता है (६० डीएनए-चारा अनुक्रम > 1000 TFs के खिलाफ दो सप्ताह के शोधकर्ता प्रति लेता है) और reproducibility । हम १,०८६ मानव TFs की एक सरणी के खिलाफ मानव प्रवर्तक अनुक्रम परीक्षण द्वारा अपेक्षित परिणाम के विभिंन प्रकार के उदाहरण देकर स्पष्ट करना है, साथ ही मुद्दों है कि स्क्रीन के दौरान पैदा कर सकते है और कैसे उंहें समस्या निवारण के उदाहरणों के रूप में ।

Introduction

जैव चिकित्सा क्षेत्र में एक केंद्रीय समस्या तंत्र है जिसके द्वारा प्रत्येक मानव जीन विनियमित है निर्धारित है । प्रतिलेखन जीन अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने में पहला कदम है, और यह प्रतिलेखन कारकों (TFs) है कि प्रत्येक जीन के लिए अद्वितीय है के सेट द्वारा विनियमित है । यह देखते हुए कि मनुष्य > 1500 tfs1,2के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना, tfs का पूरा सेट है कि प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति नियंत्रण की पहचान एक खुली चुनौती बनी हुई है ।

दो प्रकार की विधियों को tf-dna इंटरैक्शन मैप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: tf-केंद्रित और डीएनए-केंद्रित तरीके3 (आंकड़ा 1a) । tf-केंद्रित विधियों में, जीनोमिक डीएनए क्षेत्रों के लिए बाइंडिंग के लिए या इसकी डीएनए बाइंडिंग विशिष्टता निर्धारित करने के लिए ब्याज की एक tf जांच की जाती है । इन विधियों में उच्च-प्रवाह sequencing, प्रोटीन बाइंडिंग microarrays, और SELEX4,5,6के बाद क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) शामिल हैं । डीएनए में-केंद्रित तरीकों, ब्याज की एक डीएनए अनुक्रम TFs के सेट है कि डीएनए अनुक्रम को बांध निर्धारित करने के लिए जांच की है । इस तरह के तरीकों का सबसे व्यापक रूप से लागू खमीर एक-संकर (Y1H) परख है, जिसमें TFs और डीएनए क्षेत्रों के बीच बातचीत खमीर के वातावरण में परीक्षण कर रहे है के लिए रिपोर्ट जीन7,8,9का उपयोग कर नाभिक ।

Y1H परख दो घटकों को शामिल: एक ' डीएनए ' चारा (जैसे, प्रवर्तकों, बढ़ाने, silencers, आदि) और एक ' TF-शिकार, ' जो रिपोर्टर जीन सक्रियण9,10 (आंकड़ा 1b) के लिए जांच की जा सकती है । डीएनए-चारा दो रिपोर्टर जीन (LacZ और HIS3) और दोनों डीएनए-चारा के ऊपर की क्लोन है: रिपोर्टर constructs खमीर जीनोम में एकीकृत करने के लिए chromatinized ' डीएनए-चारा उपभेदों उत्पंन कर रहे हैं । tf-शिकार, एक प्लाज्मिड है कि एक tf सक्रियकरण डोमेन (AD) खमीर Gal4 tf के लिए जुड़े हुए व्यक्त करता है में इनकोडिंग, डीएनए चारा तनाव में TF-डीएनए बातचीत के लिए मछली के लिए शुरू की है । यदि tf-शिकार को डीएनए-चारा अनुक्रम में बांधा जाता है, तो tf-शिकार में मौजूद विज्ञापन दोनों रिपोर्टर जीन की सक्रियता को जन्म देगा. नतीजतन, एक सकारात्मक बातचीत के साथ कोशिकाओं histidine कमी प्लेटों पर विकास के लिए चुना जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से एक प्रतियोगी अवरोध करनेवाला पर काबू पाने, 3-अमीनो-1, 2, 4-triazole (3-पर), और एक्स की उपस्थिति में नीली कालोनियों के रूप में visualized-gal । क्योंकि शक्तिशाली खमीर Gal4 विज्ञापन का प्रयोग किया जाता है, Y1H परख transcriptional उत्प्रेरक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दमन शामिल बातचीत का पता लगा सकते हैं । इसके अलावा, यह देखते हुए कि TF-शिकार एक मजबूत खमीर प्रमोटर (ADH1) से व्यक्त कर रहे हैं, बातचीत भी TFs कि कम अंतर्जात अभिव्यक्ति का स्तर है, जो11,12चिप से पता लगाने के लिए चुनौती दे रहे है के लिए पता लगाया जा सकता है ।

Y1H परख प्रदर्शन के लिए सबसे प्रकाशित प्रोटोकॉल tf शुरू करने के आधार पर कर रहे हैं-खमीर डीएनए में शिकार---के लिए चयन द्वारा पीछा किया, कॉलोनी उठा, और अनुक्रमण से बातचीत tf, या द्वारा की पहचान के बाद परित-शिकार पुस्तकालयों को बदलने से चारा उपभेदों व्यक्तिगत क्लोन8,9बदलने । ये समय लेने वाले प्रोटोकॉल हैं, डीएनए दृश्यों की संख्या सीमित है कि शोधकर्ता के प्रति परीक्षण किया जा सकता है । Y1H परख के एक हाल ही में सुधार, कहा जाता है बढ़ाया Y1H (eY1H), नाटकीय रूप से एक उच्च घनत्व सरणी (HDA) रोबोट मेट खमीर डीएनए के एक संग्रह के साथ चारा उपभेदों का उपयोग करके स्क्रीनिंग का प्रवाह बढ़ गया है प्रत्येक व्यक्त एक अलग TF-शिकार10,13 (फिगर 1C) । इन स्क्रीन एक १,५३६ कॉलोनी के लिए केवल तीन प्लेटों का उपयोग quadruplicate में सबसे मानव TFs परीक्षण की अनुमति प्रारूप काम करते हैं । इसके अलावा, यह देखते हुए कि TF-डीएनए बातचीत एक pairwise तरीके से परीक्षण कर रहे हैं, इस दृष्टिकोण डीएनए के बीच बातचीत की तुलना के लिए अनुमति देता है-चारा (जैसे दो कोडिंग एकल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट के रूप में) और अलग TFs या TF वेरिएंट11,12 के बीच ,14.

eY1H परख का उपयोग करना, हम delineated है सबसे बड़ा मानव और Caenorhabditis एलिगेंस डीएनए-केंद्रित TF-डीएनए बातचीत नेटवर्क करने की तारीख । विशेष रूप से, हम २४६ मानव विकास बढ़ाने और २८३ TFs12के बीच २,२३० बातचीत की पहचान की है । इसके अलावा, हम eY1H परख कार्यरत है को उजागर करने के लिए बदल TF १०९ एकल न्यूक्लियोटाइड कोडिंग जैसे विकासात्मक कुरूपता, कैंसर, और स्नायविक विकारों के रूप में आनुवंशिक रोगों के साथ जुड़े वेरिएंट को बाध्यकारी । हाल ही में, हम eY1H इस्तेमाल के लिए एक नेटवर्क चित्रित २,५७६ सी एलिगेंस जीन प्रवर्तकों और ३६६ TFs11के बीच २१,७१४ बातचीत शामिल है । इस नेटवर्क के लिए सी एलिगेंस TFs के दर्जनों की कार्यात्मक भूमिका को उजागर करने के लिए सहायक था ।

प्रोटोकॉल डीएनए-चारा दाग उत्पंन करने के लिए और पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि के स्तर का मूल्यांकन15,16,17कहीं सूचना दी गई है । यहां, हम एक eY1H पाइपलाइन का वर्णन है कि १,०८६ मानव TFs की एक सरणी के खिलाफ किसी भी मानव जीनोमिक डीएनए क्षेत्र स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक बार एक खमीर डीएनए-चारा तनाव उत्पंन होता है और एक TF-शिकार सरणी इसी प्लेटों पर देखा जाता है, पूरे प्रोटोकॉल दो सप्ताह (तालिका 1) में किया जा सकता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल इतना है कि एक एकल शोधकर्ता ६० डीएनए-चारा अनुक्रम एक साथ स्क्रीन कर सकते है समानांतर किया जा सकता है । प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए, हम दो cytokine जीन CCL15 और IL17F के प्रवर्तकों दिखलाई । इसके अलावा, हम विफल स्क्रीन से परिणाम दिखाने के लिए समस्याओं के प्रकार है कि जब eY1H परख प्रदर्शन और उंहें कैसे निवारण करने के लिए उत्पंन हो सकती है वर्णन ।

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Protocol

1. तैयारी

  1. Sc − U − H प्लेट्स (१५० mm पेट्री व्यंजन)
    नोट: इन प्लेटों का इस्तेमाल डीएनए-चारा खमीर उपभेदों को उगाने के लिए किया जाएगा ।
    1. ड्रॉप आउट मिश्रण भंग, खमीर नाइट्रोजन आधार (YNB), adenine hemisulfate, और पानी की ९२० मिलीलीटर में अमोनियम सल्फेट, और पीएच ५.९ के साथ 5 मीटर NaOH (मीडिया के लगभग 1 मिलीलीटर प्रति लीटर; देखें तालिका 2 के लिए संरचना) । एक 2 एल कुप्पी में डालो और एक बार हलचल जोड़ें ।
    2. एक दूसरे 2 एल कुप्पी में, पानी की ९५० मिलीलीटर के लिए आगर जोड़ें (एक बार हलचल के रूप में यह आटोक्लेव में अधिक उबाल के कारण होगा नहीं जोड़) ।
    3. एक तरल चक्र पर 15 साई में ४० मिनट के लिए आटोक्लेव ।
    4. तुरंत हलचल पट्टी सहित पहली कुप्पी की सामग्री डालो, कुप्पी युक्त आगर में । ग्लूकोज जोड़ें, एक हलचल थाली पर अच्छी तरह से मिश्रण, और एक पानी स्नान में ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए शांत ।
    5. leucine और tryptophan को मीडिया में जोड़ें । एक हलचल प्लेट पर अच्छी तरह से मिलाएं और १५० mm बाँझ पेट्री व्यंजन (~ ८० मिलीग्राम प्रति डिश) में डालना । कमरे के तापमान पर 3-5 दिनों के लिए सूखी, प्लास्टिक की थैलियों में लपेटें, और 6 महीने तक के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर ।
  2. YAPD आयताकार प्लेट्स
    नोट: इन प्लेटों डीएनए के लिए लॉन-चारा तनाव बढ़ रही है और TF सरणी संग्रह के साथ संभोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    1. पाउडर भंग ( तालिका 3 संरचना के लिए देखें), के अलावा आगर, में पानी की ९५० मिलीलीटर में एक 2 L कुप्पी और एक हलचल बार जोड़ें.
    2. एक दूसरे 2 एल कुप्पी में, पानी की ९५० मिलीलीटर के लिए आगर जोड़ें (एक बार हलचल के रूप में यह आटोक्लेव में अधिक उबाल के कारण होगा नहीं जोड़) ।
    3. एक तरल चक्र पर 15 साई में ४० मिनट के लिए आटोक्लेव ।
    4. तुरंत हलचल पट्टी सहित पहली कुप्पी की सामग्री डालो, कुप्पी युक्त आगर में ।
    5. ग्लूकोज जोड़ें, एक हलचल प्लेट पर अच्छी तरह से मिश्रण और ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए शांत । आयताकार प्लेटों में मीडिया डालो ( सामग्री की तालिकादेखें; ~ ७० एमएल प्लेट प्रति) एक सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर (5 मिलीलीटर/ कमरे के तापमान पर 1 दिन के लिए सूखी, प्लास्टिक की थैलियों में लपेट, और 6 महीने तक के लिए ठंडे कमरे में स्टोर ।
      नोट: हालांकि सुझाया गया मीडिया वॉल्यूम ७० मिलीलीटर प्रति प्लेट, 50-प्लेट प्रति 80 मिलीलीटर का उपयोग किया जा सकता है । तीन महत्वपूर्ण मुद्दों पर विचार करने के लिए जब प्लेटें डालना 1 रहे हैं) कि वे इतना स्तरित कर रहे हैं कि आगर मीडिया प्लेट भर में एक ही मोटाई है (एक स्तरित मेज या प्लेट डालने के लिए सतह का उपयोग करें और अधिक से अधिक सात प्लेटों के ढेर में डालना नहीं है) , 2) आगर मीडिया में बुलबुले के अभाव को सुनिश्चित करने के लिए (बुलबुले एक बाँझ सुई का उपयोग कर popped किया जाना चाहिए), और 3) केवल एक ही दिन के लिए प्लेटें सुखाने और प्लास्टिक बैग में प्लेटें लपेटन खमीर पिन में विफलताओं से बचने के लिए ।
  3. sc − trp और sc − U − trp आयताकार प्लेट्स
    नोट: ये प्लेटें TF सरणी संग्रह (sc − trp) को उगाने के लिए और संभोग के बाद द्विगुणित खमीर (sc − U − trp) का चयन करने के लिए उपयोग की जाएंगी ।
    1. ड्रॉप आउट मिश्रण, YNB, adenine hemisulfate, और पानी की ९२० मिलीलीटर में अमोनियम सल्फेट भंग, और NaOH 5M के साथ ५.९ के लिए पीएच (लगभग 1 मिलीलीटर मीडिया की प्रति लीटर) ( तालिका 4 देखें संरचना के लिए) । एक 2 एल कुप्पी में डालो और एक बार हलचल जोड़ें ।
    2. एक दूसरे 2 एल कुप्पी में, पानी की ९५० मिलीलीटर के लिए आगर जोड़ें (एक बार हलचल के रूप में यह आटोक्लेव में अधिक उबाल के कारण होगा नहीं जोड़) ।
    3. एक तरल चक्र पर 15 साई में ४० मिनट के लिए आटोक्लेव ।
    4. तुरंत हलचल पट्टी सहित पहली कुप्पी की सामग्री डालो, कुप्पी युक्त आगर में । ग्लूकोज जोड़ें, एक हलचल थाली पर अच्छी तरह से मिश्रण, और ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए शांत ।
    5. leucine, histidine, और uracil (Sc − U − Trp प्लेट्स के लिए uracil को चूकना) जोड़ें ।
    6. एक हलचल प्लेट पर अच्छी तरह से मिश्रण और आयताकार प्लेटों में डालना (~ ७० एमएल प्रति प्लेट) एक सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर (5 एमएल/ कमरे के तापमान पर 1 दिन के लिए सूखी, प्लास्टिक की थैलियों में प्लेटें लपेट, और ठंडे कमरे में 3 महीने के लिए स्टोर ।
  4. Sc − U − H − Trp + 3AT + X-gal आयताकार प्लेट्स
    नोट:     इन प्लेट्स को eY1H की परख के लिए readout प्लेट्स के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
    1. ड्रॉप आउट मिश्रण, YNB, adenine hemisulfate, और पानी की ८५० मिलीलीटर में अमोनियम सल्फेट भंग (देखें तालिका 5 संरचना के लिए) । पीएच नहीं है । एक 2 एल कुप्पी में डालो और एक बार हलचल जोड़ें ।
    2. एक दूसरे 2 एल कुप्पी में, पानी की ८५० मिलीलीटर के लिए आगर जोड़ें (एक बार हलचल के रूप में यह आटोक्लेव में अधिक उबाल के कारण होगा नहीं जोड़) ।
    3. एक तरल चक्र पर 15 साई में ४० मिनट के लिए आटोक्लेव ।
    4. ९०० मिलीलीटर पानी के संयोजन से 10x बु साल्ट (1L) तैयार करें, ७० g च्या ना2HPO4∙ 7H2o, व ३४.५ g च्या णः2पो4∙ ज2ओ. मिश्रण एक बार हलचल पाउडर भंग और 5 मीटर NaOH का उपयोग कर ७.० के लिए पीएच को समायोजित करने के लिए का उपयोग कर । 1 L और आटोक्लेव को लाने के लिए पानी डालें ।
    5. dimethyl formamide के ४२.५ मिलीलीटर युक्त एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब के लिए एक्स-लड़की पाउडर के ३.५ जी जोड़कर एक्स-gal समाधान तैयार करें । dimethyl formamide करने के लिए और अधिक आसानी से भंग करने के लिए एक्स-लड़की पाउडर जोड़ें (यह 30 मिनट लेता है). अंधेरे में शेयर समाधान रखें (या तो अपारदर्शी ५० मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करें या पंनी में कवर) । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    6. तुरंत हलचल पट्टी सहित पहली कुप्पी की सामग्री डालो, कुप्पी युक्त आगर में । ग्लूकोज और 10x बु साल्ट जोड़ें (संरचना के लिए 5 तालिका देखें), एक हलचल प्लेट पर अच्छी तरह से मिश्रण, और ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए शांत ।
    7. जोड़ें leucine, 3AT, और X-gal (देखें तालिका 5 संरचना के लिए) ।
    8. एक हलचल प्लेट पर अच्छी तरह से मिश्रण और आयताकार प्लेटों में डालना (~ ७० एमएल प्रति प्लेट) एक सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर (5 मिलीलीटर/ कमरे के तापमान पर 1 दिन के लिए सूखी, प्लास्टिक की थैलियों में लपेट, और ठंड एल्यूमीनियम पंनी में शामिल कमरे में स्टोर (3AT और एक्स-लड़की हल्के संवेदनशील हैं) अप करने के लिए 1 महीने के लिए ।

2. एक TF सरणी खोलना

  1. TF-शिकार सरणी गल
    1. बर्फ पर TF-शिकार सरणी के साथ खमीर ग्लिसरॉल स्टॉक प्लेट्स गल ।
      नोट: TF-शिकार arrays पहले प्रकाशित10,12,13,18के रूप में उत्पंन किया जा सकता है ।
    2. अगले कदम से पहले 1-3 मिनट के भीतर एक 12-चैनल पिपेट का उपयोग कर खमीर resuspend ।
  2. Sc − Trp आयताकार प्लेट में खमीर खोलना
    1. HDA रोबोट में ( सामग्री की तालिकादेखें), स्रोत के रूप में बहु-well ९६ प्लेट का चयन करें, ९६ लक्ष्य के रूप में प्लेटें, और ९६ लंबी पिन पैड ।
      नोट: पिन पैड पुन: प्रयोज्य नहीं हैं और छोड़ दिया जाना चाहिए ।
    2. ९६-well प्लेट प्रति दो प्रतियाँ बनाने के लिए कई प्रोग्राम प्रतिकृति का चयन करें । उपयोग रीसायकल या फिर से आना विकल्प जमे हुए शेयरों के संदूषण से बचने के लिए नहीं है ।
    3. विकल्प का चयन करने के लिए खमीर मिश्रण करने के लिए स्रोत में ऊपर और नीचे घूमता है ।
    4. बैग देखा सरणी और मशीन आगर-ओर 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 के लिए-3 दिन ।
  3. अनुसूचित जाति − टीआरपी आयताकार प्लेट्स में ३८४ कॉलोनी सरणियों का सृजन
    1. रोबोट में, का चयन करें ९६ स्रोत के रूप में प्लेट आगार, लक्ष्य के रूप में ३८४ आगर प्लेट, और ९६ लघु पिन पैड ।
    2. 1:4 सरणी प्रोग्राम का चयन करें । इस तरह, ४ ९६ कॉलोनी प्लेटों (प्रत्येक एक अलग TF युक्त) १ ३८४ कॉलोनी प्लेट में समेकित किया जाएगा । विभिन्न प्लेटों के बीच संदूषण से बचने के लिए रीसायकल या फिर से आना विकल्पों का उपयोग न करें ।
    3. बैग प्लेटें और मशीन देखा ३८४-कॉलोनी सरणी आगर-2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर साइड ।
  4. अनुसूचित जाति − टीआरपी आयताकार प्लेट्स में १,५३६ कॉलोनी सरणियों का सृजन
    नोट: यह प्रत्येक TF-शिकार के लिए चार कालोनियों युक्त arrays में परिणाम होगा ।
    1. रोबोट में, स्रोत के रूप में ३८४ आगर प्लेट्स का चयन करें, १,५३६ आगर लक्ष्य के रूप में प्लेटें, और ३८४ लघु पिन पैड ।
    2. 1:4 परख एकल स्रोत कार्यक्रम का चयन करें । लक्ष्य के लिए quadruplicates प्राप्त करने के लिए चार कालोनियों में प्रत्येक कॉलोनी की नकल है । रीसायकल और फिर से आना विकल्पों का उपयोग करें क्योंकि इसमें प्रत्येक कॉलोनी में चार बार प्रतिलिपि बनाना शामिल है ।
    3. बैग प्लेटें और मशीन देखा १५३६-कॉलोनी सरणी आगर-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर साइड ।
  5. अनुसूचित जाति − टीआरपी आयताकार प्लेट्स में १,५३६ कॉलोनी सरणी बढ़ाना
    1. रोबोट में, १,५३६ का चयन करें, स्रोत के रूप में प्लेटें, १,५३६ आगर लक्ष्य के रूप में प्लेटें, और १,५३६ लघु पिन पैड ।
    2. 3-4 प्रतिलिपियां दोहराने के लिए कई प्रोग्राम प्रतिकृति का चयन करें । रीसायकल और फिर से आना विकल्प का उपयोग करें, लेकिन पार संक्रमण से बचने के लिए सरणी की एक अलग थाली में स्विचन जब पैड बाहर फेंक.
    3. बैग प्लेटें और देखा १५३६-कॉलोनी सरणी आगर-ओर 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए संभोग कदम के लिए उपयोग करने के लिए (नीचे देखें) । उसके बाद, प्लेट्स को कमरे के तापमान पर रखें और स्क्रीनिंग के नए दौर के लिए 7 दिनों के बाद फिर से कॉपी करें ।

3. eY1H स्क्रीन

  1. तैयारी डीएनए-संभोग के लिए चारा तनाव लॉन
    1. एक Sc − U − H प्लेट पर खमीर डीएनए-चारा उपभेदों स्पॉट और 30 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए बढ़ती है ।
    2. एक बाँझ दंर्तखोदनी का उपयोग कर 15 सेमी Sc − U − H प्लेट में खमीर लकीर, ताकि प्रत्येक प्लेट 12-16 अलग उपभेदों फिट बैठता है । 30 डिग्री सेल्सियस पर एक दिन की मशीन ।
    3. एक बाँझ दंर्तखोदनी का उपयोग कर एक 15 सेमी Sc − U − H प्लेट में खमीर लकीर, ताकि प्रत्येक प्लेट 4 अलग उपभेदों फिट बैठता है । 30 डिग्री सेल्सियस पर एक दिन के लिए मशीन ।
    4. एक बाँझ दंर्तखोदनी का उपयोग कर खमीर परिमार्जन, किसी भी आगर परिमार्जन करने के लिए सुनिश्चित नहीं है और बाँझ पानी की ५०० µ l के साथ एक १.५ ट्यूब में जोड़.
    5. एक YAPD आयताकार प्लेट पर 10-15 बाँझ कांच मोती जोड़ें । थाली पर खमीर निलंबन जोड़ें और 1 मिनट के लिए सभी दिशाओं में अच्छी तरह से हिला खमीर सुनिश्चित करने के लिए सभी थाली के माध्यम से फैला हुआ है ।
    6. प्लेट को तुरंत उलटा कर दें और उस पर टैप करें जिससे मोतियों का ढक्कन चले । निकालें और मोतियों रीसायकल ।
    7. 30 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 दिनों के लिए नीचे प्लेटें और की मशीन आगर-साइड बैग । फिर सहवास के लिए कदम आगे बढ़ें.
  2. खमीर डीएनए के सहवास-चारा और TF सरणी उपभेदों
    1. TF सरणी को रोबोट के साथ एक YAPD आयताकार प्लेट में स्थानांतरित करें । स्रोत और लक्ष्य के रूप में १,५३६ आगार प्लेट का चयन करें, और १,५३६ लघु पिन पैड । कई प्रोग्राम प्रतिकृति का चयन करें । प्रत्येक TF सरणी प्लेट 3-4 YAPD प्लेटों (सरणी में प्लेटों की संख्या पर निर्भर करता है) को स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस TF सरणी प्लेटों संभोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए 2-3 दिन पुराने लेकिन अधिक नहीं के रूप में सहवास अक्षम हो सकता है ।
    2. पहले से ही रोबोट के साथ TF सरणी युक्त YAPD प्लेटों के लिए एक डीएनए चारा तनाव के लॉन हस्तांतरण । स्रोत और लक्ष्य के रूप में १,५३६ आगार प्लेट का चयन करें, और १,५३६ लघु पिन पैड । कई प्रोग्राम प्रतिकृति का चयन करें । एक ही स्थान से खमीर लेने से बचने के लिए ~ ०.६ mm के एक त्रिज्या के साथ स्रोत में एक यादृच्छिक ऑफसेट का प्रयोग करें, और लक्ष्य पर मिश्रण खमीर उपभेदों के बीच संपर्क की सुविधा के लिए । डीएनए युक्त लॉन का प्रयोग करें-चारा उपभेदों स्रोत के रूप में (धारा ३.१), और YAPD TF सरणी युक्त प्लेटें लक्ष्य के रूप में कदम 3.2.1 में देखा ।
    3. बैग प्लेटें और एक दिन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर अप की मशीन आगर-साइड ।
  3. द्विगुणित खमीर का चयन
    1. YAPD प्लेट्स से मेटेड यीस्ट को रोबोट के साथ Sc − U − Trp प्लेट्स में ट्रांसफर करें । स्रोत और लक्ष्य के रूप में १,५३६ आगार प्लेट का चयन करें, और १,५३६ लघु पिन पैड । दोहराने प्रोग्राम का चयन करें । स्रोत पर और लक्ष्य पर मिश्रण ।
    2. बैग प्लेटें और की मशीन आगर-2 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर-3 दिन (अब गर्मी उच्च पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि की ओर जाता है) ।
  4. readout प्लेट्स में ट्रांसफर
    1. sc − u − trp प्लेट्स से द्विगुणित खमीर का स्थानांतरण readout आयताकार प्लेट्स sc − u − H − trp + 5 मिमी 3AT + ०.४ mM X-gal का उपयोग करते हुए रोबोट से करें । चुनें १,५३६ स्रोत और लक्ष्य के रूप में प्लेटों आगार, और १,५३६ लघु पिन पैड । दोहराने प्रोग्राम का चयन करें ।
    2. बैग प्लेटें और की मशीन आगर-अप करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए ।
  5. readout प्लेट्स की इमेजिंग
    1. उच्च पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि के साथ डीएनए-चारा उपभेदों के लिए, 2, 3, और 4 दिनों पर तस्वीरें ले लो । अंयथा, 4 और 7 दिनों में तस्वीरें ले लो । सकारात्मक बातचीत वृद्धि और खमीर कालोनियों के नीले रंग द्वारा की पहचान कर रहे है और मैंयुअल रूप से निर्धारित किया जा सकता है, या यह छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है ।

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Representative Results

तीन मुख्य कारक जब eY1H परख से परिणाम का विश्लेषण पर विचार किया जाना चाहिए: डीएनए की पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि-चारा तनाव, रिपोर्टर गतिविधि की ताकत TF-डीएनए बातचीत करने के लिए इसी, और सकारात्मक कालोनियों की संख्या । इस पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि (यानी, डीएनए की गतिविधि)-चारा तनाव समग्र विकास और readout प्लेट में खमीर कालोनियों के रंग को संदर्भित करता है, यहां तक कि एक TF शिकार के अभाव में । आदर्श रूप में, गैर-सक्रिय उपभेदों एक पृष्ठभूमि सफेद या हल्के भूरे रंग दिखाने के लिए, कालोनियों के साथ सकारात्मक बातचीत के लिए बड़ा और नीला जा रहा है । उप सक्रिय डीएनए-चारा उपभेदों histidine और एक्स की उपस्थिति में एक नीले रंग की कमी मीडिया में खमीर विकास दिखाने के प्लेट में सभी कालोनियों के लिए लड़की है, जो की संभावना डीएनए-चारा8के लिए खमीर transcriptional उत्प्रेरक के बंधन से संबंधित है । रिपोर्टर गतिविधि की ताकत TF-डीएनए इंटरैक्शन का पता लगाया (यानी, कॉलोनी और नीले रंग की तीव्रता का आकार) कई मापदंडों पर निर्भर करता है जैसे कि अपनत्व, खमीर में TF एक्सप्रेशन लेवल, बाइंडिंग साइट्स की संख्या और दूरी रिपोर्टर जीन के ऊपर स्थित खमीर ंयूनतम प्रवर्तकों, और डीएनए की पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि-चारा तनाव । उदाहरण के लिए, एक कमजोर बातचीत आसानी से एक कम पृष्ठभूमि चारा में पता लगाया जा सकता है लेकिन एक स्वतः सक्रिय या असमान पृष्ठभूमि चारा में पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है । यह भी ध्यान दें कि खमीर में रिपोर्टर गतिविधि का स्तर जरूरी नहीं मानव कोशिकाओं में विनियामक गतिविधि के साथ सहसंबंधी बनाना महत्वपूर्ण है, क्रोमेटिन संरचना के रूप में, nucleosome स्थिति, और दूरी प्रभाव खमीर और मानव के बीच अलग हैं । इसके अलावा, मानव में बातचीत के लिए अंय tfs और cofactors के बंधन से प्रभावित होने की संभावना है या कार्यात्मक रूप से अनावश्यक tfs8द्वारा नकाबपोश किया जा सकता है । अंत में, बातचीत eY1H परख में सकारात्मक माना जाता है जब चार से कम दो कालोनियों पृष्ठभूमि स्तर के ऊपर रिपोर्टर अभिव्यक्ति दिखाओ । लेकिन, हमने देखा है कि ~ ९०% सभी चार एक TF जा रहा है सकारात्मक10,12,19के लिए इसी कालोनियों से परिणाम की पहचान की ।

परिणाम है कि eY1H परख का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है हम प्रवर्तक क्षेत्रों (प्रतिलेखन शुरू साइटों के 2 केबी ऊपर) CCL15 और IL17F जीन की एक सरणी के खिलाफ, १,०८६ मानव TFs (चित्रा 2) के खिलाफ के प्रकार का वर्णन । CCL15 प्रमोटर एक गैर-सक्रिय डीएनए-चारा का एक उदाहरण है जहां बातचीत, यहां तक कि कमजोर लोगों, आसानी से पता लगाया जा सकता है (चित्रा 2a) । IL17F प्रमोटर एक अति सक्रिय डीएनए का एक उदाहरण असमान पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि है, जहां कुछ बातचीत का पता लगाया जा सकता है के साथ चारा है, जबकि कई TFs के लिए यह अनिश्चित है कि रिपोर्टर गतिविधि पृष्ठभूमि से अधिक है (चित्रा बी) ।

समस्याओं का सामना किया जा सकता है जब eY1H परख प्रदर्शन

हालांकि स्क्रीनिंग eY1H प्रोटोकॉल सीधे आगे और मजबूत है, कई समस्याओं स्क्रीन के दौरान सामना किया जा सकता है:

1) कालोनियों बहुत छोटे है और (3 ए आंकड़ा) हस्तांतरण विफल: हालांकि यह उंमीद है कि कुछ खमीर व्यक्त exogenous TFs धीमी गति से दिया है कि खमीर जीन अभिव्यक्ति dysregulated हो सकता है प्रदर्शन कर सकते हैं, आमतौर पर ~ TF के ९५% शिकार कालोनियों सामांय प्रदर्शन विकास. यदि कालोनियों के 10% से अधिक विकसित करने में विफल, सबसे अक्सर कारण मीडिया के साथ या खमीर हस्तांतरण के साथ समस्या है । उपइष्टतम विकास अक्सर एक मीडिया गतिविधि खोने के घटकों के लिए संबंधित है (जैसे, uracil, histidine, या leucine), ताजा स्टॉक समाधान के साथ ताजा मीडिया तैयार करने के द्वारा हल किया जा सकता है जो । वैकल्पिक रूप से, यह भी एक लगाए ऑफसेट कि कॉलोनी हस्तांतरण को प्रभावित करने के लिए संबंधित हो सकता है । इस स्थिति में, सत्यापित करें कि १,५३६ पैड स्रोत प्लेट्स में खमीर कालोनियों के केंद्र पिन ।

2) प्लेट के एक हिस्से में कोई खमीर वृद्धि (आंकड़ा 3 बी): यह मुद्दा आम तौर पर संभोग कदम में एक विफलता के साथ संबंधित है अगर १,५३६ पिन पैड के लिए डीएनए में खमीर के साथ संपर्क बनाने में विफल रहता है-चारा तनाव लॉन, TF सरणी, या संभोग थाली में । लगभग हर मामले में, यह प्लेट डालने या प्लेट के अत्यधिक सुखाने के कारण के दौरान असमान आगार मीडिया स्तर के कारण है ।

3) कोई बातचीत का पता चला (चित्रा 3 सी और डी): यह मुद्दा अक्सर रिपोर्टर जीन में अवांछित निष्क्रिय उत्परिवर्तन से संबंधित है, विशेष रूप से LacZ में (आंकड़ा 3सी), या उच्च गतिविधि है कि मुखौटा बातचीत (आंकड़ा 3d). इस समस्या के निवारण के लिए, यह एक ही डीएनए-चारा के लिए इसी स्वतंत्र रूप से प्राप्त तनाव स्क्रीन करने के लिए सिफारिश की है.

4) प्लेट यादृच्छिक नीले धब्बे प्रस्तुत करता है (चित्रा 3E): यह मुद्दा अक्सर जीवाणु संदूषण से संबंधित है । इस मुद्दे को हल करने के लिए, खमीर व्यक्तिगत कालोनियों प्राप्त करने के लिए लकीर, और दोहराने स्क्रीन ।

ऊपर सबसे लगातार समस्याओं का सामना करना पड़ा जब eY1H परख प्रदर्शन कर रहे हैं । अंय समस्याओं उठता है, नए मीडिया की तैयारी चाहिए, कि HDA रोबोट के लिए उपयुक्त सेटिंग्स का इस्तेमाल किया गया है, और डीएनए के प्रति एकाधिक उपभेदों परीक्षण-चारा की संभावना सबसे अधिक मुद्दों का समाधान होगा ।

Figure 1
चित्रा 1 : eY1H परख स्क्रीन की रूपरेखा । (A) प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए TF-केंद्रित और डीएनए-केंद्रित विधियों के बीच तुलना. (ख) eY1H की परख के योजनाबद्ध । ब्याज की एक डीएनए अनुक्रम (प्रवर्तक, बढ़ाने, साइलेंसर, आदि) HIS3 और LacZ रिपोर्टर जीन के ऊपर क्लोन खमीर जीनोम में एकीकृत है । जिसके परिणामस्वरूप डीएनए-चारा तनाव खमीर उपभेदों Gal4 सक्रियकरण डोमेन (AD) से जुड़े हुए बंदरगाह का एक संग्रह के लिए साथी है । सकारात्मक बातचीत है खमीर histidine और प्रतिस्पर्धी अवरोधक 3 पर काबू पाने के बिना बढ़ने की क्षमता द्वारा निर्धारित कर रहे हैं, और एक्स-लड़की की उपस्थिति में नीले रंग की बारी है । (ग) eY1H स्क्रीन के लिए पाइपलाइन । एक खमीर डीएनए के एक लॉन-चारा एक YAPD थाली में बड़े हो गए एक YAPD थाली में एक १,५३६ कॉलोनी सरणी के लिए साथी है एक Sc − Trp प्लेट पर हो विज्ञापन के लिए फ्यूज व्यक्त । एक दिन के बाद, खमीर के लिए एक अनुसूचित जाति − यू − टीआरपी में स्थानांतरित किया जाता है द्विगुणित खमीर के लिए चयन करें । एक 2-3 दिन की गर्मी के बाद, खमीर एक Sc − U − H − Trp + 3AT + एक्स-लड़की प्लेट (readout प्लेट) को प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए हस्तांतरित किया जाता है । प्रत्येक संपर्क quadruplicate में परीक्षण किया जाता है ।  कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : eY1H readout प्लेट्स के उदाहरण । (क) CCL15, एक गैर-उप सक्रिय चारा के प्रमोटर शामिल बातचीत । इस चारा के लिए पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि कम है (histidine और गैर के लिए नीले रंग की अनुपस्थिति के अभाव में कम वृद्धि-बातचीत TFs) । (ख) IL17F, एक सक्रिय चारा के प्रमोटर शामिल बातचीत । इस चारा के लिए पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि उच्च है (प्लेट में histidine और पृष्ठभूमि नीले रंग के अभाव में वृद्धि) और असमान, यह प्रोटीन डीएनए बातचीत की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण बना । मजबूत, मध्यम, और कमजोर बातचीत क्रमशः लाल, नारंगी, और पीले रंग में चुकता कर रहे हैं । HGNC नाम की सहभागिता TFs दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : eY1H स्क्रीन में समस्याएं । (क) TF-शिकार सरणी जहां कई कॉलोनियों को विकसित करने में विफल । (ख) Readout प्लेट जहाँ निचले बाएँ कोने में कॉलोनियों का स्थानांतरण विफल हो गया है. (ग) गैर-सक्रिय डीएनए-चारा तनाव है कि सकारात्मक बातचीत प्रदर्शित नहीं करता है । (घ) अति सक्रिय डीएनए-चारा तनाव है कि सकारात्मक बातचीत प्रदर्शित नहीं करता है । (ङ) Readout प्लेट प्रदूषित होने के कारण कई नीली कॉलोनियों को प्रदर्शित करना. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक TF सरणी खोलना
Day 1 अनुसूचित जाति में स्पॉट खमीर-टीआरपी प्लेट में ९६ कॉलोनी प्रारूप (२.१ और २.२)
Day 4 उत्पंन ३८४ कॉलोनी TF सरणी (२.३)
दिन 6 उत्पंन १,५३६ कॉलोनी TF सरणी (२.४)
दिन 9 बढ़ाना १,५३६ कॉलोनी TF सरणी (२.५)
तैयारी डीएनए-संभोग के लिए चारा तनाव लॉन
दिन 6 जगह खमीर डीएनए-चारा उपभेदों3.1.1()
दिन 9 लकीर खमीर, प्लेट (3.1.2) प्रति 12-16 उपभेदों
दिन 10 लकीर खमीर, प्लेट प्रति 4 उपभेदों (3.1.3)
दिन 11 डीएनए तैयार करें-चारा लॉन (3.1.4 and 3.1.5)
खमीर डीएनए के सहवास-चारा और TF सरणी उपभेदों
दिन 12 YAPD प्लेट्स में सहवास (३.२)
द्विगुणित खमीर का चयन
दिन 13 अनुसूचित जाति में द्विगुणित खमीर के चयन – यू – टीआरपी प्लेट्स (३.३)
readout प्लेट्स में ट्रांसफर
दिन 15 स्थानान्तरण द्विगुणित खमीर को readout प्लेट्स (३.४)
readout प्लेट्स की इमेजिंग
दिन 17-22 पृष्ठभूमि के आधार पर readout प्लेटों की छवि अधिग्रहण (३.५)

तालिका 1: TFF सरणी ।

अभिकर्मक मात्रा (2 एल के लिए)
ड्रॉप-आउट मिक्स सिंथेटिक ऋण histidine, leucine, tryptophan और uracil, adenine, रिच (2 ग्राम) डब्ल्यू/ २.६ छ
बिना एमिनो एसिड और बिना अमोनियम सल्फेट (YNB) खमीर नाइट्रोजन आधार ३.४ छ
Adenine hemisulfate डाईहाइड्रेट १६० मिलीग्राम
अमोनियम सल्फेट 10 ग्राम
आगर ३५ छ
ग्लूकोज (४०%, डब्ल्यू/वी) पानी में, बाँझ १०० एमएल
Leucine (१०० मिमी), बाँझ छान 16 मिलीलीटर
Tryptophan (४० मिमी), बाँझ छान 16 मिलीलीटर

तालिका 2: एजेंट सूची I ।

अभिकर्मक मात्रा (2 एल के लिए)
Peptone ४० छ
खमीर निकालें 20 ग्राम
Adenine hemisulfate डाईहाइड्रेट ०.३२ छ
ग्लूकोज (४०%, डब्ल्यू/वी) पानी में, बाँझ १०० एमएल
आगर ३५ छ

तालिका 3: रिएजेंट सूची II ।

अभिकर्मक मात्रा (2 एल के लिए)
ड्रॉप-आउट मिक्स सिंथेटिक माइनस histidine, leucine, tryptophan और uracil, adenine रिच (2 ग्राम) w/o खमीर नाइट्रोजन आधार २.६ छ
बिना एमिनो एसिड और बिना अमोनियम सल्फेट (YNB) खमीर नाइट्रोजन आधार ३.४ छ
Adenine hemisulfate डाईहाइड्रेट १६० मिलीग्राम
अमोनियम सल्फेट 10 ग्राम
आगर ३५ छ
ग्लूकोज (४०%, डब्ल्यू/वी) पानी में, बाँझ १०० एमएल
Leucine (१०० मिमी), बाँझ छान 16 मिलीलीटर
Histidine (१०० मिमी), बाँझ छान 16 मिलीलीटर
Uracil (20 मिमी), बाँझ फ़िल्टर (अनुसूचित जाति के लिए चूकना – यू – टीआरपी प्लेट्स) 16 मिलीलीटर

तालिका 4: रिएजेंट सूची III ।

अभिकर्मक मात्रा (2 एल के लिए)
ड्रॉप-आउट मिक्स सिंथेटिक माइनस histidine, leucine, tryptophan और uracil, adenine रिच (2 ग्राम) w/o खमीर नाइट्रोजन आधार २.६ छ
बिना एमिनो एसिड और बिना अमोनियम सल्फेट (YNB) खमीर नाइट्रोजन आधार ३.४ छ
Adenine hemisulfate डाईहाइड्रेट १६० मिलीग्राम
अमोनियम सल्फेट 10 ग्राम
आगर ३५ छ
ग्लूकोज (४०%, डब्ल्यू/वी) पानी में, बाँझ १०० एमएल
10x बु लवण २०० एमएल
Leucine (१०० मिमी), बाँझ छान 16 मिलीलीटर
3AT (२ एम), बाँझी छान 5 मिलीलीटर
DMF में एक्स-लड़की (८० मिलीग्राम/एमएल) 4 मिलीलीटर

तालिका 5: एजेंट सूची IV ।

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Discussion

रोबोट eY1H संभोग स्क्रीनिंग दृष्टिकोण यहां वर्णित बहुत प्रवाह को TFs के सेट की पहचान बढ़ जाती है कि ब्याज की एक डीएनए क्षेत्र को बांध, पिछले पुस्तकालय स्क्रीनिंग या सरणी स्क्रीनिंग परिवर्तन के आधार पर दृष्टिकोण की तुलना में । इसके अलावा, tf-डीएनए eY1H परख द्वारा पता चला बातचीत के ९०% के रूप में अत्यधिक reproducible है पता चला सभी चार के लिए सकारात्मक रहे है की जांच के प्रति TF, और एक ही खमीर डीएनए की एक स्वतंत्र स्क्रीन में बातचीत retest के ९०%-चारा तनाव10 , 12 , 19. अधिक महत्वपूर्ण बात, TF-डीएनए बातचीत eY1H द्वारा एक 40%-70% की दर से पता चला जब मानव रिपोर्टर परख12में परीक्षण किया,20, प्राथमिक मानव कोशिकाओं में (अप्रकाशित परिणाम), और सी एलिगेंस नॉकआउट जानवरों में 11. यह एक समान मांयता दर है कि चिप के लिए मनाया-seq डेटा21।

हालांकि eY1H द्वारा की पहचान की बातचीत अत्यधिक reproducible जब एक ही खमीर डीएनए retesting-चारा तनाव, एक ही डीएनए के लिए अलग खमीर उपभेदों परीक्षण-चारा कभी अलग पैदा होता है, हालांकि अतिव्यापी, TF-डीएनए बातचीत के सेट । यह आमतौर पर उपभेदों के बीच पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि में मतभेद के कारण है । इसके अलावा, एक डीएनए अनुक्रम के टुकड़ों का परीक्षण पूर्ण अनुक्रम परीक्षण की तुलना में अधिक TF-डीएनए इंटरैक्शन का पता लगाने में परिणाम, विशेष रूप से जब अतिव्यापी टुकड़े का परीक्षण कर रहे हैं. इस परख है कि रिपोर्टर ंयूनतम प्रमोटरों के करीब है बातचीत की पहचान में और अधिक कुशल जा रहा है के साथ संबंधित हो सकता है, और क्योंकि अतिव्यापी टुकड़े परीक्षण संभावना है कि एक बाध्यकारी साइट खमीर nucleosomes द्वारा occluded हो सकता है कम कर देता है । इस प्रकार, छोटे पैमाने पर परियोजनाओं के लिए, यह अनुशंसित है कि एक विनियामक क्षेत्र के 0.5-1 केबी अंशों का परीक्षण किया जाता है और यह कि दो स्वतंत्र उपभेदों प्रत्येक डीएनए-चारा अनुक्रम8के लिए दिखलाई पड़ते हैं ।

चित्रा 3में प्रस्तुत कुछ मुद्दों से बचने के लिए eY1H स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । सबसे पहले, हालांकि ज्यादातर मीडिया सामग्री (3AT और एक्स के लिए छोड़कर लड़की) कई महीनों के लिए स्थिर हैं, उचित कॉलोनी विकास की संभावना की कमी इंगित करता है कि सामग्री के कम से एक गतिविधि खो दिया है और बदल दिया जाना चाहिए हो सकता है । दूसरा, यह आयताकार प्लेटें तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि आगर को लेवलेड कर दिया जाए ताकि वे रोबोट प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करते समय लगाए जाने में असफलता से बचने के लिए एक से अधिक दिन तक न सूख जाएं । अंत में, यह प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में रोबोट मंच प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है (फिर से आना, रीसायकल, मिश्रण, आदि) खमीर के लिए प्रभावी ढंग से स्थानांतरित करने के लिए, संभोग के लिए कुशल हो, और खमीर क्लोनों के बीच पार संक्रमण से बचने के लिए ।

उदाहरण हम eY1H स्क्रीन के उपयोग को वर्णन करने के लिए चयनित मानव जीन प्रवर्तकों के अनुरूप । हालांकि, अन्य विनियामक क्षेत्रों को भी बढ़ाने और silencers सहित परीक्षण किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हम eY1H परख का इस्तेमाल किया है कि मानव विकास बढ़ाने के लिए TF बाध्यकारी मूल्यांकन और C. एलिगेंस पहली introns12,22। इसके अलावा, यह देखते हुए कि बातचीत एक pairwise तरीके से परीक्षण कर रहे हैं, eY1H परख गैर कोडिंग वेरिएंट के बीच बातचीत की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और TF कोडिंग अनुक्रम वेरिएंट के बीच । उदाहरण के लिए, eY1H परख का उपयोग हम १०९ अलग आनुवंशिक रोगों के साथ जुड़े, और भी अंतर के लिए ५८ tf के लिए परस्पर बातचीत प्रोफाइल परिवर्तित tf बाइंडिंग की पहचान12,14। हालांकि यह प्रोटोकॉल tf बाइंडिंग को मानव विनियामक क्षेत्रों के मूल्यांकन पर केंद्रित है, अन्य प्रजातियों से डीएनए क्षेत्रों का भी परीक्षण किया जा सकता है बशर्ते कि एक TF-शिकार उपलब्ध है या उत्पन्न किया जा सकता है । दरअसल, TF-शिकार arrays के लिए उत्पंन किया गया है C. एलिगेंस10, Drosophila melanogaster23, मस musculus24, Arabidopsis थालियाना25,26, और Zea mays 27. इस प्रकार, तेजी से उपलब्ध संसाधनों के साथ, eY1H परख अतिरिक्त प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है ।

हालांकि eY1H परख गया है कि मानव और अंय प्रजातियों में विभिंन विनियामक क्षेत्रों को बांध TFs की प्रदर्शनियों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, वे निरंतर8,11,12,19 से मुक्त नहीं है ,२०,२५. सीमाओं में से एक है कि बातचीत खमीर नाभिक के वातावरण में परीक्षण कर रहे है और, हालांकि डीएनए-चारा chromatinized हैं, खमीर में क्रोमेटिन संरचना से प्रजातियों में क्रोमेटिन संरचना को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते है जहां डीएनए-चारा की उत्पत्ति और वीवो में स्वीकार्य कक्ष प्रकार के अंतर को प्रतिबिंबित नहीं करेगा । इस प्रकार, eY1H परख द्वारा की पहचान की बातचीत रिपोर्टर या अंय कार्यात्मक परख में मांय किया जाना चाहिए । ध्यान दें की, हम और दूसरों को मिल गया है TF-डीएनए एक 40% में eY1H मांय द्वारा पाया गया है-कार्यात्मक परख में 70% की दर11,12,20,23। eY1H परख की एक और सीमा है कि यह tfs कि बाद अनुवाद की आवश्यकता होती है कि खमीर में अनुपस्थित संशोधन डीएनए को बांध, tfs कि ठीक से खमीर में जोड़ रहे है जब विज्ञापन से जुड़े हुए है, और tfs कि सरणी से लापता है शामिल बातचीत का पता नहीं लगा सकता 8. इसके अलावा, वर्तमान स्वरूप में, eY1H परख heterodimeric TFs शामिल बातचीत का पता नहीं है, tf सरणी में प्रत्येक खमीर कॉलोनी के रूप में एक एकल TF-शिकार एक्सप्रेस । इस प्रकार, परख में और सुधार TFs कि परीक्षण किया जा सकता है की चौड़ाई में वृद्धि होगी और eY1H परख की क्षमताओं का विस्तार करने के लिए उपंयास TF-डीएनए बातचीत की पहचान

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R35-GM128625 to J.I.F.B.] द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

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References

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आनुवंशिकी अंक १४४ खमीर एक-संकर Y1H प्रतिलेखन फैक्टर मानव जीन विनियमन डीएनए eY1H
बढ़ाया खमीर एक संकर स्क्रीन मानव डीएनए दृश्यों के लिए प्रतिलेखन कारक की पहचान करने के लिए
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Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

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