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Article de méthode

Paralysie de natation due à évaluer la Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

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⸱

DOI :

10.3791/59243

⸱

3 avril 2019

 ,  , 
1Harriet Wilkes Honors College, Florida Atlantic University, John D MacArthur Campus, 2Integrative Biology and Neuroscience program, College of Science, Florida Atlantic University, 3Brain Institute, Florida Atlantic University, 4Department of Biomedical Science, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Dans cet article

Résumé

Natation induite paralysie (SWIP) est un test comportemental bien établi utilisé pour étudier les mécanismes sous-jacents de la dopamine signalisation chez Caenorhabditis elegans (c. elegans). Toutefois, une méthode détaillée pour effectuer le test fait défaut. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour SWIP.

Résumé

Le test de natation décrit dans le présent protocole est un outil valable pour identifier les protéines réglementant le dopaminergique synapses. Tout comme les mammifères, la dopamine (DA) contrôle plusieurs fonctions chez c. elegans , y compris l’activité d’apprentissage et de moteur. Conditions qui stimulent la libération de DA (p. ex., les traitements stimulants (AMPH)) ou qui empêcherait DA clearance (p. ex., les animaux dépourvus du transporteur DA (dat-1) qui sont incapables de pourraient DA dans les neurones) générer un excès de DA extracellulaire au bout du compte résultant dans la locomotion inhibée. Ce comportement est particulièrement évident lorsque les animaux nagent dans l’eau. En effet, tandis que les animaux sauvage continue à nager pendant une période prolongée, dat-1 mutants nuls et sauvage traitement avec AMPH ou inhibiteurs du transporteur DA coulent au fond du puits et ne bougent pas. Ce comportement est appelé « Paralysie due Swimming » (SWIP). Bien que l’essai SWIP est bien établie, une description détaillée de la méthode fait défaut. Nous décrivons ici un guide étape par étape pour effectuer SWIP. Pour effectuer le test, fin larvaire étape-4 animaux est placés dans une spot sur plaque de verre contenant une solution de saccharose contrôle avec ou sans AMPH. Animaux est notés pour leur comportement de nage soit manuellement par la visualisation sous un stéréoscope, soit automatiquement par l’enregistrement d’une caméra montée sur le stéréoscope. Vidéos sont ensuite analysées à l’aide d’un logiciel de suivi, ce qui donne une représentation visuelle de la fréquence de volée et paralysie sous forme de cartes de la chaleur. Les systèmes manuels et automatisés garantissent un affichage facilement quantifiable de la capacité de nage des animaux et ainsi facilitent le dépistage des animaux portant des mutations au sein du système dopaminergique ou gènes auxiliaire. En outre, SWIP peut servir à élucider le mécanisme d’action des drogues d’abus comme AMPH.

Introduction

Animaux exécutent une variété de comportements innés et complexes qui sont véhiculées par les différents neurotransmetteurs, coordonnés par les processus complexes de signalisation. La dopamine, un neurotransmetteur (DA) intervient dans des comportements hautement conservées à travers les espèces, y compris l’apprentissage, la fonction motrice et le traitement de la récompense.

Les nématodes du sol c. elegans, avec un système nerveux relativement simple et bien cartographiée consistant seulement 302 neurones, montre des comportements fortement complexes, dont beaucoup sont réglementées par DA comme accouplement, apprentissage, recherche de nourriture, la locomotion et la ponte 1. parmi les autres caractéristiques, cycle de vie court, facilité de manipulation et la conservation des molécules de signalisation, mettre en évidence les avantages de l’utilisation de c. elegans comme modèle pour étudier les bases neurales des comportements conservées.

L’hermaphrodite c. elegans contient huit des neurones dopaminergiques ; En outre, le mâle contient six paires supplémentaires pour fins d’accouplement. Comme les mammifères, ces neurones synthétisent DA et expriment le transporteur DA (DAT-1), une protéine de membrane trouve exclusivement dans les neurones dopaminergiques, qui transporte DA relâché dans la fente synaptique dans les neurones dopaminergiques. En outre, la plupart des protéines impliqués dans chaque étape de la synthèse, de conditionnement et de libération de DA est hautement conservée entre worms et les êtres humains et, comme chez les mammifères, DA module alimentation de comportements et de locomotion chez c. elegans2.

C. elegans se traîne sur des surfaces solides et nage avec un comportement caractéristique de s’emballer dans de l’eau. Fait intéressant, des mutants dépourvus d’expression du 1 DAT (dat-1) rampent normalement sur une surface solide, mais ne parviennent pas à maintenir la natation lorsqu’immergé dans l’eau. Ce comportement a été appelé natation induite une paralysie, ou SWIP. Des expériences précédentes ont démontré que SWIP, est en partie causée par un excès de DA dans la fente synaptique qui finalement surexcite les récepteurs postsynaptiques de D2-like (DOP-3). Bien qu’identifié à l’origine de dat-1 knockout animaux3, SWIP est également observée chez les animaux sauvage, traités avec des médicaments qui bloquent l’activité de DAT (p. ex., l’imipramine4) et/ou inciter la libération de DA (p. ex., stimulants5). En revanche, les manipulations pharmacologiques ou génétiques conjurer la synthèse et la libération de DA et bloquant la fonction des récepteurs DOP-3 empêchent SWIP6. Pris ensemble, ces données déjà publiées ont établi SWIP comme un outil fiable pour étudier les effets comportements de protéines mutées dans dopaminergique synapses3,4,7 et devant être utilisés pour avancer les écrans génétiques pour l’identification de nouvelles voies réglementaires impliquées dans DA signalisation7,8,9,10,11,12. En outre, en fournissant un affichage facilement quantifiable du comportement drogue-induite chez les individus vivants, SWIP permet à l’élucidation des mécanismes d’action des drogues comme l’amphétamine (AMPH) et azapérone à la dopaminergique synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.

Protocoles pour effectuer les dosages SWIP ont été décrits avant16. Ici, nous décrivons en détail la méthodologie et le programme d’installation pour effectuer le test avec le but de fournir un guide visuel pour la communauté de c. elegans remplir efficacement SWIP.

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Protocole

1. préparation des Solutions et des médias

  1. Préparer M9 tampon en dissolvant KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) et NaCl 5,0 g (85,5 mM) dans 1 L d’eau déionisée autoclavé. Ajouter 1,0 mL de 1 M MgSO4 (12 g dans un volume final de 100 mL d’eau désionisée autoclavé) après la stérilisation. Mélanger 100 mL de 10 x qui en résulte M9 avec 900 mL d’autoclave désionisée pour faire une solution de 1 x.
  2. Pour faire le tampon de le œuf, dissoudre 6,896 g de NaCl (118 mM), 3,578 g de KCl (48 mM), 0,294 g de CaCl2-2 H2O (2 mM), g 0,406 MgCl2-6 H2O (2 mM) et 5,958 g (25 mM) de HEPES dans 1 L d’eau déionisée autoclavé. Ajuster le pH de 7,3 à l’aide de NaOH.
  3. Préparer la solution de l’hypochlorite de sodium/NaOH frais en ajoutant 1 mL de 5-6 % d’hypochlorite de sodium (eau de Javel) et 180 µL de 10 N NaOH à 3,8 mL d’eau désionisée.
  4. Peser 60 g de saccharose et se dissolvent dans l’eau désionisée autoclavé pour un volume final de 100 mL pour faire 60 % solution sucrée.
  5. Dissoudre 0,684 g de saccharose dans 10 mL d’eau désionisée stérilisés à l’autoclave pour faire le saccharose de 200 mM. Vérifier et ajuster au même une osmolarité utilisant osmomètre. Faire des aliquotes de 1 mL à 1,5 mL microtubes à centrifuger et congeler à-20 ° C.
  6. Peser 0,184 g de AMPH (poids moléculaire 184.75 g/mol) et dissoudre dans 10 mL d’eau déminéralisée pour faire une solution stock de 100 mM. Mélanger 2 µL de la solution mère dans 400 µL d’eau pour faire la solution de travail de 0,5 mM.
  7. Préparer des éléments nutritifs croissance plaques de médias (NGM)
    1. Mélanger 3 g de NaCl (52,65 mM), 20 g de peptone, 25 g de bacto-agar et 975 mL d’eau désionisée dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L. Inclure une barre magnétique remuer et autoclave (121 ° C, pression de 15 PSI) pendant 1 heure à l’aide de liquide.
    2. Laisser refroidir à et maintenir la température à environ 50 ° C en plaçant le ballon sur un appareil de chauffage tout en remuant. Ajouter 0,5 mL de cholestérol (5 mg/mL dans de l’éthanol), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2 et 25 mL de tampon de phosphate potassium 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4, 35,6 g K2HPO4 désionisée à 1 L).
    3. Pipetter 25 mL de chaque dans les plats de pétri 100 x 15 mm et autoriser les médias à se solidifier. Stocker les plaques à l’envers à 4 ° C dans une boîte pendant 4 semaines.
  8. Préparation du bouillon de Lysogénie (LB)
    1. Dissoudre 5 g de mélange de poudre LB dans 200 mL d’eau désionisée dans un Erlenmeyer. Cycle de l’autoclave pendant 30 minutes utilisant la stérilisation liquide. Laisser le bouillon refroidir. Conserver à température ambiante pendant 1 à 2 semaines.
  9. Préparation des plaques bactériennes NA22
    1. Utiliser un embout de la pipette stérile ou une boucle bactérienne stérile pour ensemencer un LB avec un petit volume de la bactérie e. coli de la NA22 du stock de glycérol et incuber la plaque à l’envers dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit pour faire croître des colonies isolées. Choisir et introduire une seule colonie dans 200 mL de bouillon LB préparée à l’étape 1.8 et laissez pousser pendant une nuit à 37 ° C sur une plate-forme vibrante.
    2. Pour les plaques de graines, distribuer 200 µL de culture bactérienne sur les plaques NGM établi plus tôt dans l’étape 1.7 et étalez avec un bâton de hockey de verre stériles. Laisser les plaques sécher pendant une nuit ou plus sous une hotte et de mettre à l’envers dans une boîte hermétique à 4 ° C.
  10. Pour rendre l’outil cils/Palladium de choisir vers, coller un cils épais ou un filament de platine dans un verre à Pasteur pipeter avec de la colle super. Couper l’extrémité de la cil à un angle à l’aide d’une lame de rasoir. Par ailleurs, un bec Bunsen peut servir à faire fondre l’embout de la pipette de verre autour du filament de platine.

2. Elevage de c. elegans

Remarque : La culture sauvage N2C. elegans souche Escherichia coli NA22 plaques. Les méthodes de culture détaillées sont décrites ci-dessous.

  1. Préparation de la culture du ver
    1. Pour faire une culture starter de worms, couper un petit morceau d’agar d’une plaque contenant des animaux bien nourris et transférez-la sur une plaque de bactéries NA22 e. coli préparée à l’étape 1.9 à l’aide d’une spatule stérile. Incuber les plaques à 20 ° C pendant 3 à 4 jours. Sous un microscope stéréo, visuellement confirment la présence d’adultes gravides.
  2. Préparation de population synchronisée de worms
    1. Recueillir les adultes gravides depuis au moins 2 plaques en distribuant de l’eau désionisée autoclavé tout autour de la plaque à l’aide d’un vaporisateur. Agiter doucement de la plaque pour déloger les vers et de collecter les vers dans un tube conique en polystyrène de 15 mL à l’aide d’une pipette en plastique jetable.
    2. Tournez en bas le tube dans une centrifugeuse à 140 x g pendant 2 min pour les vers de granule, puis aspirer hors surnageant à l’aide d’une pompe à vide ou avec construit dans le vide de laboratoire.
    3. Remettre et laver les vers en remplissant le tube avec autoclavés eau désionisée et mélanger et centrifuger à 140 x g pendant 2 min. aspirer le surnageant et répéter ce dernier étape deux fois de plus ou jusqu'à ce que les vers sont claires des bactéries (l’eau apparaît clairement lorsqu’il est mélangé avec les vers).
    4. Ajouter 5 mL de solution d’hypochlorite de sodium/NaOH fraîchement préparés (point 1.3) dans le culot de ver et mélanger rapidement à l’aide d’un vortex. Incuber le tube sur un balancier pendant environ 4 à 8 min. Le temps d’incubation avec une solution d’hypochlorite de sodium/NaOH oscille entre 4 à 8 minutes selon la qualité de la solution stock hypochlorite de sodium (eau de Javel).
    5. Mettre une goutte d’eau (2 à 50 µL) de solution contenant worms sur une lame de microscope de verre et de vérifier toutes les 2 min sous le microscope pour la lyse de ver. Lorsque environ 70 % vers sont lysées et œufs sont libérés, remplir le tube avec le tampon de œuf préparé à l’étape 1.2 et immédiatement centrifuger pendant 1 min à 140 g pour les embryons de granule et vis sans fin de carcasses.
    6. Aspirer le surnageant et laver le culot 3 fois plus en remplissant le tube chaque fois avec le tampon de l’oeuf. Tournez en bas à 140 x g pendant 1 min et retirer le surnageant à chaque fois. La pastille devienne blanche à la fin du lavage.
    7. Après le lavage final, séparer les carcasses mortes dans une solution de saccharose 30 % sur les embryons. Ajouter 5 mL d’eau désionisée autoclavé au culot, resuspendre et ajouter 5 mL de 60 % de sucrose préparée à l’étape 1.4. Bien mélanger et centrifuger à 160 g pendant 6 min.
    8. Utiliser une pipette Pasteur en verre pour transférer les embryons flottant au ménisque supérieur dans un tube conique frais 15 mL. Ne prenez pas plus de 3 à 4 mL. Pour enlever toute saccharose restant, lavez les embryons 3 fois avec de l’eau stérilisé par centrifugation à 140 x g pendant 3 min, retirer le surnageant et resuspendant le culot (et le tube de remplissage) chaque fois.
    9. Répétez les lavages avec 1 tampon x M9. Après le lavage final, resuspendre le culot dans 10 mL de M9. Laisser les tubes sur un agitateur pendant la nuit (pas plus de 14 h) pour les œufs éclosent en larves L1. Vers restera en L1 stade larvaire due au manque de nourriture.
    10. Larves de lavage L1 3 fois avec de l’eau autoclavé pour enlever toute les phéromones libérés par les larves par centrifugation à 140 x g pendant 2 min. remettre en suspension les larves dans 1 mL d’eau. Faire un 01:10 dilution vers dans l’eau, pipette une goutte de 10 µL sur une lame de verre, chaussez un lamelle couvre-objet et compter le nombre de vers dans un stéréoscope. Répétez ceci deux fois et la moyenne des résultats.
    11. Pipette, le volume vers qui correspond à environ 1 000 vers sur un plat de NA22 (qui a été préalablement porté à température ambiante) en plaçant des petites gouttes sur la plaque. Laisser la plaque entrouverte jusqu'à ce que la goutte se dessèche. Ensuite la plaque de recouvrement et incuber à l’envers dans l’incubateur de 20 ° C pendant environ 44 à 48 heures ou jusqu'à ce que les vers atteint L4 tardivement, comme l’a confirmé visuellement sous un stéréomicroscope. Maintenant, les vers sont prêts à être testés pour SWIP.

3. SWIP

Remarque : Nous décrivons la méthode manuelle d’appréciation SWIP sauvage Worms traités avec AMPH. Nous discutons également brièvement le suivi vers et une analyse plus approfondie de la cinétique de ver à l’aide d’un tracker ver automatisé et un logiciel de suivi qui ont été décrites précédemment par Hardaway et al.,10.

  1. Méthode manuelle pour tester SWIP
    1. Aliquote 40 µL de solution de saccharose 200 mOsm/L avec ou sans 0,5 mM AMPH dans une plaque de verre de spot. Sous le stéréoscope, pick 8-10 fin-L4 étape vers avec un cil ou platine pick et submerger le prélèvement dans le plat contenant la solution jusqu'à ce que vers quittent la pioche et nagent dans la solution. Notez le nombre de vers pris dans le puits, démarrer le compte à rebours, observer et de consigner le nombre de vers présentant SWIP à chaque marque minute.
    2. Copier les données brutes dans un tableur, calculer le pourcentage de worms paralysés en divisant le nombre de vers paralysé à chaque minute par nombre total de worms testés tout au long de l’essai et multipliez par 100. Copier les valeurs de pourcentage dans un graphique et intrigue et un logiciel de statistique les données avec les valeurs de pourcentage sur l’axe des Y et le temps sur axe en utilisant le graphe XY X format.
    3. Effectuer bidirectionnelle ANOVA suivie d’analyse post-hoc (par exemple, Bonferroni après le test) pour tester la signification statistique entre contrôle, les groupes AMPH et les temps de traitement.
  2. Analyse automatisée du SWIP
    1. Effectuer une analyse automatisée sur un seul ver à la fois. Le protocole de mettre caméra, le logiciel de traqueur de ver et le script à exécuter le logiciel de suivi analyse sont décrites en détail dans Hardaway et al.,16.
    2. Brièvement, placez un hermaphrodite de stade L4 fin unique dans une plaque de verre de spot utilisant un prélèvement de cil, comme décrit dans la méthode manuelle à la section 3.1.2. Enregistrer des vidéos de natation d’un ver dans le temps et utiliser le logiciel de traqueur de ver pour calculer la fréquence des courbes du corps.
    3. Suivez le script fourni avec le logiciel de suivi d’obtenir ver raclée fréquence et produire des cartes de chaleur d’après les données de volée de ver.

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Résultats

Nous présentons un exemple de test SWIP induite par le traitement AMPH. La figure 1 montre une représentation schématique de l’installation d’essai tel que décrit ci-dessus. Le dosage manuel, environ 8-10 ans synchronisée fin vers stade de L4 est recueillies avec un cil ou platine et placé dans une plaque de verre spot rempli de 40 µL de 200 de saccharose mOsm/L (solution de contrôle) ou de saccharose avec 0,5 mM AMPH et testé pour SWIP.

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour effectuer un test comportemental, SWIP, chez c. elegans. Ce protocole est simple et directe avec aucun obstacles techniques majeurs effectuez ce test très amical. Néanmoins, il y a certains aspects essentiels qui doivent être examinées afin de s’acquitter efficacement le dosage.

Il faut s’assurer que les vers utilisés pour l’essai sont bien nourris, puisque la restriction alimentaire affecte SWIP17. Manipulat...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiens à remercier le Dr. Osama Refai du laboratoire du Dr Randy Blakely d’orientation avec l’analyse automatique de SWIP. Ce travail a été financé par NIH R01 DA042156 à LC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Feuille d’aluminiumReynolds wrap1091835
AmphétamineSigma51-63-8  ;   ;
Autoclave
Incubateur bactérienNew Brunswick scientificM1352-0000
Qualité bactériologique, AgarLab Scientific, Inc  ; A466
Bacto (TM) PeptoneBDREF 211677
Chlorure de calcium (dihydraté)Sigma-AldrichC3881
Caméra  ;Centrifugeuse ThorlabsU-CMAD3
  ;Eppendorf 5810R 15ampE215059
CholestérolSigma-Aldrich57-88-5
Eau désioniséeMilliporeZ00QSV0WWMilli-Q
Depression plaque d’angle en verreCorningCorning, Inc. 722085
Erlenmeyer flaskThermoFisher4103-0250PK
Cils
Diapositive en verreFisherbrand12-550-15
Logiciel de graphisme et de statistiquesPrismGraphpad 5
HEPESSigma-AldrichRB=H3375 & H7006
HypochloriteHawkinsSodium Hypochlorite 4-6 %, USP" 1 gal
LB Bouillon, MillerFisherBP1426
Chlorure de magnésium (hexahydraté)Sigma-AldrichRB=M0250500 g
Sulfate de magnésium (heptahydraté)Sigma-AldrichM1880
Barre d’agitation magnétiqueFisherbrand16-800-510  ;
Tubes à microcentrifugerThermoFisher69715
NA 22 bactériesCGC
NystatinSigma1400-61-9
OsmomètreAdvanced Instruments, IncModèle 3320
Pasteur PipettesFisherbrand13-678-20A
PetriplatesFalcon351007
pH-mètreOrion VersaStar ProIS-68X591202-B 0514
Tubes coniques en polystrineFalcon352095
Chlorurede potassium Sigma-Aldrich  ;P9541
Dihydrogénophosphate de potassiumSigma-Aldrich7778-77-0
Phosphate de potassium - DIBASICSigma-AldrichP-8281
Phosphate de potassium - MONOBASICSigma-AldrichP0662
Pipettes sérologiquesVWR10ml=89130-898
AgitateurReliable Scientific55S 12x16
Chlorure de sodiumFisherRB=BP358-1
Dihydrogénophosphate de sodiumFisherRB=S381
TableurMS officeMicrosoft Excel
StéréomicroscopeZeissModèle tlb3. 1 stemi2000
Stérile Pointes de pipetteDivers02-707-400
SaccharoseSigma-AldrichRB=S5016
SuperglueLoctite1647358 .14 oz.
SwimR sofware10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2Worm Tracker 2.0www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
Logiciel d’enregistrement vidéoVirtualdubhttp://www.virtualdub.org/

Références

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