Summary
Simning inducerad förlamning (SWIP) är en väletablerad beteendevetenskaplig analys används för att studera bakomliggande mekanismer av dopamin signalering i Caenorhabditis elegans (C. elegans). Dock saknas en detaljerad metod för att utföra analysen. Här beskriver vi ett stegvisa protokoll för SWIP.
Abstract
Den simning-analysen som beskrivs i detta protokoll är ett giltigt verktyg för att identifiera proteiner som reglerar dopaminerga synapser. Liknar däggdjur, dopamin (DA) styr flera funktioner i C. elegans inklusive lärande och motorisk aktivitet. Villkor som stimulerar DA release (t.ex. amfetamin (AMPH) behandlingar) eller att hindra DA clearance (t.ex. djur saknar DA transportören (dat-1) som är oförmögna att reaccumulating DA in i nervceller) generera ett överskott av extracellulära DA i slutändan leder till hämmad locomotion. Detta är särskilt tydligt när djur simma i vatten. I själva verket medan vildtyp djur fortsätter att simma under en längre period, dat-1 null mutanter och vildtyp behandlas med AMPH eller hämmare av DA transportören sjunka till botten av brunnen och inte flytta. Detta beteende kallas ”simning inducerad förlamning” (SWIP). Även om SWIP analysen är väl etablerad, saknas en detaljerad beskrivning av metoden. Här beskriver vi en steg för steg guide för att utföra SWIP. För att utföra analysen, placerats sena larval arrangerar-4 djuren i en spot glasplatta som innehåller kontroll sackaroslösning med eller utan AMPH. Djur är gjorde för deras simning beteende antingen manuellt eller genom visualisering under ett Stereoskop automatiskt genom inspelning med en kamera monterad på Stereoskop. Videor analyseras sedan med en spårningsprogramvara, som ger en visuell representation av thrashing frekvens och förlamning i form av värmekartor. Både manuella och automatiserade system garanterar en enkelt mätbara avläsning av djurens simkunnighet och därmed underlätta screening för djur som försetts med mutationer inom det dopaminerga systemet eller extra gener. SWIP kan dessutom användas för att belysa verkningsmekanismen av missbruksdroger såsom AMPH.
Introduction
Djur utför en mängd medfödda och komplexa beteenden som förmedlas av olika signalsubstanser samordnas av intrikata signalering processer. Signalsubstansen dopamin (DA) förmedlar mycket beteenden mellan arter, learning, motorik och belöning bearbetning.
Jord Nematoden C. elegans, med en relativt enkel och väl mappad nervsystemet som består av endast 302 nervceller, visar markant komplexa beteenden, inklusive många som regleras av DA såsom parning, lärande, födosökande, locomotion och äggläggning 1. bland andra funktioner, kort livslängd, enkel hantering och bevarande av signalmolekyler, lyfta fram fördelarna med att använda C. elegans som en modell för att studera personlighetens grund i bevarade beteenden.
Hermafroditt C. elegans innehåller åtta dopaminerga neuroner; Utöver dessa innehåller manlign sex extra par för parning ändamål. Precis som däggdjur, dessa nervceller syntetisera DA och express DA transportören (DAT-1), ett membranprotein som hittade uteslutande i dopaminerga neuron, som transporterar DA släppt i den synaptiska spalten tillbaka till dopaminerga nervceller. Dessutom de flesta av proteinerna som är involverade i varje steg i syntesen, förpackningar och frisättning av DA bevaras mycket mellan maskar och människor och som hos däggdjur, DA modulerar utfodring beteenden och förflyttning i C. elegans2.
C. elegans kryper på fasta ytor och simmar med en karakteristisk thrashing beteende i vatten. Intressant, mutanter saknas uttryck för DAT-1 (dat-1) krypa normalt på fast yta men misslyckas med att upprätthålla simning när nedsänkt i vatten. Detta beteende kallades simning inducerad förlamning eller SWIP. Tidigare experiment visat att SWIP, delvis orsakas av ett överskott av DA i den synaptiska spalten som slutligen overstimulates D2-liknande postsynaptiska receptorer (DOP-3). Även om ursprungligen identifierat i dat-1 knockout djur3, SWIP är också observerats i vilda djur som behandlats med läkemedel som blockerar aktiviteten av DAT (t.ex. imipramin4) och/eller inducera DA release (t.ex. amfetamin5). Däremot, hindra farmakologisk eller genetiska manipulationer avvärja syntes och frisättning av DA och blockering DOP-3 receptor funktion SWIP6. Sammantaget har dessa redan publicerade data etablerat SWIP som ett pålitligt verktyg att studera de beteendemässiga effekter som orsakas av muterade proteiner inom dopaminerga synapser3,4,7 och anställas för framåt genetiska skärmar för identifiering av nya rättsliga vägar inblandade i DA signalering7,8,9,10,11,12. Dessutom, genom att tillhandahålla ett enkelt mätbara avläsning av läkemedelsinducerad beteende i levande djur, SWIP möjliggör förtydligandet av verkningsmekanismer av droger som amfetamin (AMPH) och azaperon på dopaminerga synapser5, 6 , 13 , 14 , 15.
Protokoll för att utföra SWIP analyserna har beskrivits före16. Här, beskriver vi i detalj metodik och setup för att utföra analysen med målet att ge en visuell guide för C. elegans gemenskapen att effektivt utföra SWIP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av lösningar och Media
- Förbereda M9 buffert genom att lösa upp KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM), och NaCl 5.0 g (85,5 mM) i 1 L Ånghärdad avjoniserat vatten. Tillsätt 1,0 mL 1 M MgSO4 (12 g i en slutlig volym av 100 mL Ånghärdad avjoniserat vatten) efter autoklavering. Blanda 100 mL av den resulterande 10 x M9 med 900 mL Ånghärdad avjoniserat vatten för att göra en 1 x lösning.
- För att göra ägg buffert, lös 6.896 g NaCl (118 mM), 3.578 g KCl (48 mM), 0,294 g CaCl2-2 H2O (2 mM), 0,406 g MgCl2-6 H2O (2 mM) och 5.958 g (25 mM) av HEPES i 1 L Ånghärdad avjoniserat vatten. Justera pH till 7,3 med NaOH.
- Förbereda färska natriumhypoklorit/NaOH-lösning genom att tillsätta 1 mL 5-6% natriumhypoklorit (blekmedel) och 180 µL 10 N NaOH till 3,8 mL avjoniserat vatten.
- Väger 60 g sackaros och lös i Ånghärdad avjoniserat vatten till en slutlig volym av 100 mL att göra 60% sackaroslösning.
- Lös 0.684 g sackaros i 10 mL av Ånghärdad avjoniserat vatten för att göra 200 mM sackaros. Kontrollera och justera till samma en osmolaritet använder osmometer. Gör 1 mL alikvoter i 1,5 mL mikrocentrifugrör och frysa vid-20 ° C.
- Väga 0.184 g AMPH (molekylvikt 184.75 g/mol) och lös i 10 mL avjoniserat vatten för att göra en 100 mM stamlösning. Blanda 2 µL stamlösning i 400 µL av vatten till 0,5 mM fungerande lösning.
-
Förbereda näringsämnen tillväxt medier (NGM) plattor
- Blanda 3 g NaCl (52.65 mM), 20 g pepton, 25 g bacto-agar och 975 mL avjoniserat vatten i en 2 L Erlenmeyerkolv. Inkludera en magnetiska rör bar och autoklav (121 ° C, 15 PSI) i 1 timme med flytande cykel.
- Kyl till och hålla temperaturen vid cirka 50 ° C genom att placera kolven på en värmare under omrörning. Tillsätt 0,5 mL av kolesterol (5 mg/mL i etanol), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2 och 25 mL 1 M kalium fosfatbuffert, pH 7,4 (108,3 g KH2PO4, 35,6 g K2HPO4 avjoniserat vatten till 1 L).
- Pipettera 25 mL varje i 100 x 15 mm Petri plåtar och låt media att stelna. Förvara plattorna upp och ner vid 4 ° C i en låda för upp till 4 veckor.
-
Beredning av Lysogeny buljong (LB) buljong
- Lös upp 5 g av LB Pulverblandning i 200 mL avjoniserat vatten i en Erlenmeyerkolv. Autoklav för 30 minuter utnyttja flytande sterilisering cykel. Låt buljongen svalna. Förvara i rumstemperatur 1-2 veckor.
-
Beredning av NA22 bakteriell plattor
- Använd en steril pipettspetsen eller en steril bakteriell loop streak en LB skylt med en liten volym av NA22 E. coli -bakterier från glycerol lager och inkubera plattan uppochner i en inkubator i 37 ° C över natten för att växa isolerade kolonier. Plocka och införa en enda koloni i 200 mL LB buljong bereddes i steg 1,8 och låt växa över natten vid 37 ° C på en skakande plattform.
- För att seeda plattorna, fördela 200 µL bakterieodling på NGM plattorna förberett tidigare i steg 1,7 och sprid med en steril glas hockeyklubba. Låt plattorna torka över natten eller längre under en huv och förvara uppochner i en lufttät låda vid 4 ° C.
- För att göra verktyget ögonfrans/platina att plocka maskar, limma en tjock ögonfransar eller en platina glödlampa i ett glas Pasteur Pipettera med superlim. Skär spetsen av ögonfrans i vinkel med ett rakblad. En bunsenbrännare kan alternativt användas för att smälta glas pipetten runt platina glödtråden spets.
2. C. elegans djurhållning
Obs: Kultur vildtyp N2C. elegans stam på Escherichia coli NA22 tallrikar. De detaljerade kultur metoderna beskrivs nedan.
-
Beredning av masken kultur
- Att göra en förrätt kultur av maskar, skär en liten bit av agar från en tallrik som innehåller välnärda djur och överföra den på NA22 E. coli bakterier plåt bereddes i steg 1,9 med hjälp av en steril spatel. Inkubera plattorna vid 20 ° C i 3-4 dagar. I stereo Mikroskop, visuellt bekräfta närvaron av dräktig vuxna.
-
Beredning av synkroniserade befolkningen av maskar
- Samla in dräktig vuxna från minst 2 plattor genom att man avskaffar Ånghärdad avjoniserat vatten runt plattan med hjälp av en spruta flaska. Snurra försiktigt på plattan för att få bort maskar och samla maskar i en 15 mL polystyren koniska rör med disponibel plast pipett.
- Snurra ner röret i en centrifug vid 140 x g i 2 min till pellet maskar, sedan aspirera supernatanten med en vakuumpump eller med inbyggd laboratorium vakuum.
- Omsuspendera och tvätta maskar genom att fylla röret med Ånghärdad avjoniserat vatten och blanda och centrifugera vid 140 x g under 2 min. som aspirera supernatanten och upprepa detta senast steg två gånger eller tills maskar är tydliga från bakterier (vattnet verkar klart när de blandas med maskar).
- Tillsätt 5 mL av nygjorda natriumhypoklorit/NaOH-lösning (steg 1.3) till mask pelleten och blanda snabbt med en virvel. Inkubera röret på en rocker för ca 4-8 min. Tidpunkten för inkubation med natriumhypoklorit/NaOH lösning varierar mellan 4-8 minuter baserat på kvaliteten på den lager natriumhypokloritlösningen (blekmedel).
- Sätt en droppe (2-50 µL) av lösning innehållande maskar på ett glas objektglas och kontrollera varje 2 min under lupp för mask Lys. När cirka 70% av maskar är lyserat och ägg släpps, fyll röret med ägg-buffert som förberett i steg 1.2 och omedelbart Centrifugera i 1 min vid 140 x g pellets embryona och mask slaktkroppar.
- Aspirera supernatanten och tvätta pelleten 3 gånger genom att fylla röret varje gång med ägg buffert. Snurra ner vid 140 x g i 1 min och avlägsna supernatanten varje gång. Pelleten blir vit i slutet av tvättar.
- Efter den sista tvättningen, separata embryon från de döda djurkropparna i 30% sackaroslösning. Tillsätt 5 mL av Ånghärdad avjoniserat vatten till pelleten, omsuspendera och tillsätt 5 mL av 60% sackaros bereddes i steg 1.4. Blanda noga och centrifugera vid 160 x g i 6 min.
- Använd ett glas Pasteur-pipett för att överföra embryona flyter på den övre menisken i ett färskt 15 mL koniska rör. Ta inte mer än 3-4 mL. Ta bort alla återstående sackaros, tvätta embryon 3 gånger med Ånghärdad vatten genom centrifugering vid 140 x g i 3 min, ta bort supernatanten och omblandning pelleten (och fylla röret) varje gång.
- Upprepa tvättarna med 1 x M9 buffert. Efter den sista tvättningen, återsuspendera pelleten i 10 mL av M9. Lämna rören på en shaker över natten (inte mer än 14 h) för de ägg som kläcks till L1 larver. Maskar kommer att förbli i L1 larvstadium på grund av brist på mat.
- Tvätta L1 larver 3 gånger med Ånghärdad vatten för att avlägsna eventuella feromoner som släpptes av larver av centrifugering vid 140 x g i 2 min. Återsuspendera larverna i 1 mL vatten. Göra en 1:10 utspädning av maskar i vatten, pipett en 10 µL droppe på en glasskiva, sätta ett täckglas på och räkna antalet maskar under ett Stereoskop. Upprepa detta två gånger och resultaten i genomsnitt.
- Pipett volymen av maskar som motsvarar cirka 1.000 maskar på en NA22 platta (som fördes tidigare till rumstemperatur) genom att placera små droppar på plattan. Låt plattan halva-öppen tills droppe torkar ut. Sedan täcka plattan och inkubera uppochner i 20 ° C inkubator för ca 44-48 h eller tills maskarna når L4 sent, som bekräftade visuellt under ett stereomikroskop. Maskar är nu redo att testas för SWIP.
3. SWIP
Obs: Vi beskriver den manuella metoden för att bedöma SWIP i vildtyp maskar behandlas med AMPH. Vi diskuterar också kort spårning av maskar och ytterligare analys av masken kinetik med hjälp av en automatiserad mask tracker och en mjukvara som beskrevs tidigare av Hardaway et al.10.
-
Manuell metod att testa för SWIP
- Alikvotens 40 µL av 200 mOsm/L sackaroslösning med eller utan 0,5 mM AMPH in i en spot glasplatta. Under Stereoskop, plocka 8-10 sena-L4 scenen maskar med en ögonfrans eller platina plocka och dränka plocka i plattan som innehåller lösningen tills maskar flytta utanför plocka och simma in i lösningen. Notera antalet maskar plockade i brunnen, starta tiduret, observera och registrera antalet maskar uppvisar SWIP på varje minut märke.
- Kopiera raw-data i ett kalkylblad och beräkna procent av maskar förlamad genom att dividera antalet maskar förlamad på varje minut av totala antalet maskar testade hela analysen och multiplicera med 100. Kopiera procentvärden i någon grafritande och statistisk programvara och tomt data med procentuella värden på Y-axeln och tiden på X-axeln använder XY diagrammet format.
- Utföra tvåvägs ANOVA följt av post-hoc analys (t.ex. Bonferroni post-test) för att testa för statistisk signifikans bland kontroll, AMPH grupper och tid för behandling.
-
Automatiserad analys av SWIP
- Utföra automatiserad analys på en enda mask i taget. Protokollet till ställa upp kameran, mask tracker programvara och skript för att köra mjukvara analys beskrivs i detalj i Hardaway et al.16.
- Kort, placera en enda sen L4 scenen hermafrodit i en spot glasplatta som utnyttjar en ögonfrans plockning, som beskrivs i den manuella metoden i avsnitt 3.1.2. Videoinspelning från simning av en mask, för på tiden och använda mask tracker programvara för att beräkna frekvensen av kroppen böjar.
- Följ de skript som finns i den spårningsprogram att få masken thrashing frekvens och generera intensitetskartor från masken thrashing data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterar ett exempel på SWIP assay induceras av AMPH behandling. Figur 1 visar en schematisk representation av assay setup som beskrivs ovan. För den manuella assay, ca 8-10 år synkroniserade sena L4 scenen maskar samlas med en ögonfrans eller platina plocka och placeras i en spot glasplatta fylld med 40 µL 200 mOsm/L sackaros (kontrollösning) eller sackaros med 0,5 mM AMPH och testat för SWIP.
När djur sluta simma (dvs. uppvisar SWIP), de snabbt sjunka till botten av brunnen och inte flytta. Diskrimineringen mellan djur som fortfarande simmar på ytan av vattnet jämfört med de som är stadig på botten av brunnen är därför mycket enkel. De flesta maskar testas i kontroll lösning simma kontinuerligt i minst 10 minuter, medan under AMPH behandling, antalet djur som uppvisar SWIP successivt ökar. Den maximala andelen djur uppvisar SWIP är proportionell mot koncentrationen av AMPH används1,5,13. När DAT-1 knockout (dat-1) maskar testas i kontrollösning, uppvisar 40-70% maskar SWIP inom 10 minuter4,13. Detta resultat är jämförbar med procentandelen av förlamade djur mätt i vilda djur som behandlats med 0,5 mM AMPH (figur 2).
Maskar som utsätts för antingen sackaros eller sackaros som innehåller AMPH visar inte SWIP i den första minuten av observation (figur 2). Men medan maskar behandlas med sackaros fortsätter att simma i 10 minuter, börja maskar behandlas med AMPH uppvisa SWIP efter 2 minuter behandling och efter 10 minuter, 66 ± 3% djur visar SWIP (figur 2).
För automatiserad analys, videor av maskar under kontroll eller AMPH behandlingar registreras en mask i taget med en videoinspelning programvara. En dator spårning programvara används för att spåra mask stryk och resulterande data importeras till och analyseras med programvara kostym. Prover av värmekartor djur utsätts för kontroll eller AMPH, Visar aktivt flytta djur i röda och förlamad maskar i grönt, visas i figur 3.
Figur 1 : Assay som inrättats för SWIP. Dräktig vuxna vildtyp (N2) maskar var lyserat med natriumhypoklorit/NaOH behandling att släppa embryon. Embryona var tillåtet att kläcks och utvecklas till synkroniserade L1 larver i M9 buffert för 14 h på en shaker och sedan ströks på en NGM tallrik seedade med NA22 bakterier. Efter 42-48 h var sen L4 scenen larver visuellt identifieras enligt Stereoskop och plockade med en ögonfrans plocka in i en spot tallrik med eller utan amfetamin i kontroll sackaroslösning och gjorde för SWIP manuellt eller genom automatiserad analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Amfetamin-inducerad SWIP med manuell analys. Maskar i sackaros eller sackaros med 0,5 mM amfetamin (AMPH) var visuellt gjorde för SWIP beteende varje minut med ett Stereoskop. Procent av djur som uppvisar SWIP beräknades genom att dividera antalet förlamad maskar av det totala antalet maskar analyseras för varje tidpunkt, och sedan multiplicera resultatet med 100. Procentandel av maskar som utsätts för AMPH (blå fyrkanter) visar SWIP ökar övertid, medan de obehandlade maskarna (röda cirklar) fortsätter att simma under fönstret 10 minuter. N representerar antalet djur testas i varje grupp. Felstaplar visar standardfel för medel (SEM). Statistisk signifikans bedömdes genom att utföra tvåvägs ANOVA med Bonferroni flera jämförande test (p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Amfetamin-inducerad SWIP via automatiserad analys. Videor av maskar i sackaros eller sackaros med 0,5 mM AMPH spelades in med hjälp av en kamera monterad på ett Stereoskop. Simning videor av enskilda maskar spårades med ett spårningsprogram och analyseras med spårning programvara kostym. Värmekartor genererades från data där röda områden Visa maskar som aktivt på väg, och grönområden anger förlamade maskar. Varje experimentella gruppen är representativ för 6 djur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett stegvisa protokoll för att utföra en beteendevetenskaplig analys, SWIP, i C. elegans. Detta protokoll är enkel och okomplicerad med inga större tekniska hinder att göra denna analys mycket användarvänlig. Det finns dock några viktiga aspekter som måste beaktas för att effektivt utföra analysen.
Försiktighet bör iakttas så att de maskar som används för analysen är välgödd, eftersom dietrestriktioner påverkar SWIP17. Skonsam hantering av maskar medan plockning så välplanerade natriumhypoklorit/NaOH behandling under Lys är kritiska moment, trauma under plockning (vanligare när du använder en platina plocka) eller långvarig exponering av embryon för natriumhypoklorit/NaOH-lösning kan orsaka permanenta skador på de maskar18 och därmed äventyra deras förmåga att simma.
Sterila tekniker bör följas för att undvika kontaminering. Kontaminering av agarplattor äventyrar hälsan hos djuren och därmed förändrar deras förmåga att simma. Liten skillnad i andelen djur uppvisar SWIP kan observeras med agarplattor ympats med olika stammar av E. coli -bakterier (NA22, OP50, etc.). I våra protokoll använder vi NA22 för att ge ett stort antal maskar.
Glas-spot plattor, används under SWIP analysen, är föredrog att plast tallrikar eftersom de kan noggrant tvättas, lättbetong och autoklaverad och återanvändas när olika typer av droger är testade.
En annan viktig faktor som bör beaktas i en SWIP-analys är flytande media där djuren är testade19osmolaritet. I våra protokoll använder vi sackaros för att föra osmolaritet vatten upp till 200 mOsm/L som tidigare visat sig vara en optimal förutsättning för djuren (Blakely RD. personlig kommunikation). Vatten med en kontrollerad osmolaritet är att föredra eftersom det eliminerar eventuella skillnader i vattnets kvalitet över flera analyser utförs i olika dagar, veckor eller månader. Särskilt, uppvisar dat-1 och vilda djur som behandlats med AMPH inte SWIP om salt lösningar (t.ex. M9 lösning) används som kontroll media.
Den tid som krävs för de flesta av djuren uppvisar SWIP kan något ändra bland olika mask faser (L1-L4). Till exempel rapporterade Masoudi et al. (2014) att efter 5 min 80% av dat-1 L1 djur fortfarande simma, således endast 20% av djuren uppvisar SWIP. Däremot, simma endast 50% av L4 dat-1 djur fortfarande efter 5 min20. Därför är det viktigt att djur som testats för SWIP är analyseras vid samma ålder. Vi har optimerat vår analys använder alltid sena L4 iscensatt djur. Sen L4 larver har fördelen av att lätt igenkännliga bland övriga larval etapper eftersom detta skede djur har nått sin vuxenstorlek och uppvisar en karakteristisk tunn linje att dela den vita fläcken i mitten av sin kropp som kommer senare differentieras till en mogen vulva. Tidsrymden för analysen är också kritisk. Exempelvis efter 15 minuter 90% av L4 dat-1 mutanter uppvisar SWIP men på senare tid (30 min), endast 60% av dem uppvisar SWIP20.
Automatiserad SWIP analysen eliminerar mänskliga fel och förbättrar high-throughput screening med avseende på manuella analyser. Dock spårning programvara program är tidskrävande eftersom de kan endast spåra en enda mask i taget.
Beträffande andra C. elegans DA-beroende beteenden är SWIP en mindre tidskrävande typ av test. Exempelvis är den basala avtagande svar2 inte en omedelbar-typ av test. I själva verket maskar behöver matas kroniskt med droger, och detta kan resultera i penetrant och off-target effekter. Således, det kanske inte lika effektivt att skärmen för droger.
En av de stora tillämpningarna av SWIP är att skärmen för olika droger som mål den dopaminerga vägen. I fall där droger inte är vattenlösliga (t.ex. mazindol), bör ordentlig utspädningar utföras för att uppnå koncentrationer där transportören lösningen är inte giftigt för maskar. Dessutom om olika koncentrationer av samma läkemedel används5,13,14, kan dos-responskurvor också analyseras. Exempelvis kan graden av progression (lutningen på kurvan för djur per minut, figur 2) rapporteras som funktion av koncentrationen och används för att jämföra effekterna av olika läkemedel (t.ex. AMPH vs kokain).
När SWIP används för att undersöka verkningsmekanismen av droger i de dopaminerga synapserna, bör uppmärksammas om resultat utvidgas till andra djur. Imipramin, en specifik hämmare av däggdjur noradrenalin transportören (NET) har exempelvis använts för att framkalla DA-medla SWIP i N2 djur4. C. elegans gör inte syntetisera noradrenalin och följaktligen uttrycker inte NET. C. elegans DA transportören delar emellertid homologi med däggdjur netto21. Av denna anledning Visa läkemedel som är hämmare av däggdjur NET och har begränsade effekter på däggdjur DAT (t.ex. imipramin) hög selektivitet för C. elegans DAT. Arter selektivitet kan således begränsa vår förmåga att extrapolera resultaten från C. elegans till människor.
Den viktigaste faktorn att överväga när utforma SWIP analyser är införandet av experiment bevisa att SWIP medieras av dopaminerga systemet. I själva verket genereras nedsatt simning av andra faktorer än gener besläktade med DA systemet (t.ex. allmänna fel i muskler kontraktion). För att säkerställa att SWIP verkligen medieras av DA, bör protokoll omfatta experiment som utförs med djur där DA har utarmat. Detta kan uppnås genom att antingen använda knockout djur saknas uttryck för katt-2, det C. elegans homologt av tyrosin-hydroxylas, som är det hastighetsbegränsande enzymet för DA syntes eller av pre behandlande vildtyp djur med reserpin, en läkemedel som orsakar DA utarmning från blåsor3. Exempelvis visade McDonald et al.3 att basala SWIP observerats i dat-1 mutanter återfanns när dessa djur var förbehandlade med reserpin. Detta resultat tyder på att SWIP är DA-medierad. Däremot, visat använder cat-2, dat-1 och mutanter saknas uttryck av varje av de dopaminerga receptorerna, Safratowich et al. (2014) att den spåra amine β-fenyletylamin (βPEA) inducerar SWIP inom 1 minut av behandling självständigt från DA men av direkt aktivering av ligandreglerade jonen kanalisera LGC-5514. Författarna visade att βPEA - och DA-inducerad SWIP är slentrianmässigt olika och de kan enkelt diskrimineras experimentellt. I själva verket, medan βPEA-inducerad SWIP är DA- och dop-3-oberoende, den når maximal värden inom 1 min och snabbt minskar efter 2 min14, DA-medierad SWIP är katt-2 och dop-3 beroende och är i princip noll efter 1 minut (figur 2). Således finns det en stor skillnad i den tid som krävs för att nå maximal effekt, och detta tillåter att snabbt skilja mellan de två fenomen: 1) den snabbt βPEA-inducerad SWIP inom 1 minut erhålls genom direkt aktivering av LGC-55 kanaler och 2) de långsamma DA-medierad SWIP som uppstår när ett överskott av extracellulära DA byggs upp över tid (10-15 min) och DA receptorerna DOP-3 är överstimulerad3.
Sammanfattningsvis, med rätt uppsättning av experiment, som omfattar användningen av knockout djur för nyckelspelare gener av dopaminerga systemet (cat-2, dat-1, dop-3) och användning av droger som bryter ned ozonskiktet DA lagringar (reserpin), har SWIP varit framgångsrikt använts för att belysa verkningsmekanismen av droger som AMPH5,13, βPEA14,15 och azaperon6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Osama Refai från Dr Randy Blakely's lab för vägledning med automatiserad analys av SWIP. Detta arbete stöds av medel från NIH R01 DA042156 till LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionized water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500 g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate - DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate - MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12x16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
References
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
