Un modèle d’Administration orale à des réponses immunitaires innées Study Commensal-Induced Galleria mellonella

Le microbiome intestinal est une composante essentielle pour le maintien de l’homéostasie et implique les deux réponses immunitaires innée et adaptative^1,2. La communauté microbiote commensal est caractérisée par différents principaux constituants commensaux : symbiotes qui confèrent des effets bénéfiques par les fonctions immunomodulatrices important et pathobionts qui peuvent avoir des effets préjudiciables dans génétiquement prédisposé héberge et de promouvoir et de déclencher l’inflammation intestinale^3,4. De nombreuses études sur les symbiotes et les pathobionts et leur influence sur le système immunitaire ont été publiés principalement étudier des réponses immunes adaptatives.

Puisque ces études impliquent beaucoup d’animaux pour les enquêtes et la protection et remplacement des animaux utilisés pour l’expérimentation est d’accroître l’intérêt du public, nous cherchons à trouver un modèle de remplacement afin de permettre un dépistage de bactéries différentes immunogènes propriétés. Insectes, en particulier la Galleria mellonella, sont un modèle de remplacement largement utilisé dans la recherche de l’infection. G. mellonella combine différents avantages tels que le faible coût et haut débit ; Il permet l’administration orale de bactéries, qui est la voie d’exposition naturelle, et qu’il permet l’infection systémique^5,6. G. mellonella plus permet d’incubation à 37 ° C, qui est la température physiologique du corps des mammifères et l’optimum pour la virulence bactérienne facteur expression⁵. Le principal avantage de g. mellonella est le système immunitaire inné conservé qui permet la discrimination du soi du non-soi et code pour une variété de récepteurs de reconnaissance de modèle comme apolipophorine ou les opsonines hemolin^{6, 7}. dès la reconnaissance de microbe, g. mellonella peut déclencher différents immunité humorale en aval. Il peut induire des réponses de stress oxydatif et sécrètent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui implique l’activité de NOS (synthase nitrique oxydase) et NOX (NADPH oxydase)^6,8. En outre, g. mellonella active une réponse puissant peptide antimicrobien (AMP), qui se traduit par la sécrétion d’un mélange d’amplis différents tels que gloverin, moricin, cécropine ou le gallerimycin de type defensin^{6, 8,9,10}. En règle générale, amplis ont une spécificité très large spectre d’hôtes contre les champignons et les bactéries gram-positives et Gram-négatives et doivent fournir une réponse puissante étant donné que les insectes ne manquent aucune réponse adaptative¹⁰. Gloverin est un amplificateur actif contre les bactéries et les champignons et inhibe la formation de la membrane externe^6,11. Moricins pièce leur fonction antimicrobienne contre les bactéries gram-positives et Gram-négatives de pénétrer la membrane et formant un pore^9,11. Objectif fournit une activité contre les bactéries et les champignons et permeabilize la membrane de la même manière comme moricins^9,10. Gallerimycin est un peptide de type defensin avec propriétés anti-fongiques⁹. Fait intéressant, il a été constaté que la combinaison de cécropine et gallerimycin avait une activité synergique contre e. coli¹⁰.

En raison de leur caractère de facile-à-utiliser g. mellonella larves sont un modèle d’infection souvent utilisé pour évaluer la pathogénicité bactérienne. En particulier, études dans lesquels des données provenant de g. mellonella sont en corrélation avec les données obtenues du support de la souris, la force de ce modèle d’hôte alternatif. Il a été constaté que les sérotypes les plus pathogènes dans un modèle d’infection de souris de Listeria monocytogenes conduisent aussi à des taux plus élevés de mortalité dans g. mellonella après l’infection systémique. En outre, moins virulentes sérotypes avéré pour être aussi moins virulente dans le modèle de g. mellonella ¹². Des observations similaires ont été faites avec les champignons pathogènes humains Candida albicans. Virulence souches différentes de c. albicans a été évaluée par infection systémique et suivi de la survie des larves. Les souches avirulentes de souris ont été également non virulente ou exposées réduit de virulence chez g. mellonella, alors que les souches virulentes de souris mènent également à forte mortalité larvaire¹³. Le modèle de g. mellonella pourrait également servir à identifier type 3 sécrétion système facteurs de pathogénicité de Pseudomonas aeruginosa¹⁴.

Étant donné que la plupart des enquêtes impliquant g. mellonella ont porté sur les facteurs de virulence à l’aide de l’approche de l’infection systémique nous intéressait surtout en fournissant une méthode appropriée pour l’analyse des commensaux intestinale dans un gavage oral modèle dans lequel nous pouvons appliquer un dosage distinct des bactéries par les larves et non seulement observer le taux de mortalité larvaire mais analyser les différentes caractéristiques des réponses immunitaires innées pour maintenir l’homéostasie intestinale.

Notre méthode permet d’accroître l’utilisation de g. mellonella comme un modèle de remplacement puisque nous combinons l’application de bactéries et de l’analyse de l’expression des RNA. Il n’est pas seulement utile renforcer le sens d’études de la pathogénie bactérienne quand y compris l’analyse des réponses immunitaires après administration par voie orale et non seulement l’observation des taux de mortalité après une infection systémique. Nos méthodes permet d’analyse des propriétés immunogènes de bactéries non pathogènes commensaux puisqu’il est fournit des conditions plus complexes que la culture de cellules en offrant une barrière intestinale dans un organisme vivant.

1. g. mellonella élevage et préparation des larves pour les expériences

Remarque : Le cycle de l’oeuf au dernier stade larvaire larve prend environ 5-6 semaines.

1. Transférer les oeufs pondus par des papillons adultes aux boîtes de 2 L contenant le substrat de la teigne (grains de maïs de 22 %, 22 % farine de blé, 17,5 % cire d’abeille, 11 %, lait écrémé en poudre, miel de 11 %, 11 % de glycérol, 5,5 % séché levure). Effectuer toute reproduction à 30 ° C dans l’obscurité.
2. Le transfert de 25 g de substrat contenant les larves en substrat frais après environ 1-2 semaines où petites et minuscules larves étaient visibles. Synchroniser les larves après 2 semaines selon leur taille et garder des groupes de 30 à 40 larves dans des conteneurs de 2 L sur substrat de teigne pendant 2 semaines.
3. Sélectionnez les larves pour expériences en poids. Utiliser des larves mobiles seulement pâles et rapides d’une masse de 180 à 200 mg.

2. culture et préparation des Bacteroides vulgatus et Escherichia coli pour administration par voie orale

1. Cultiver la bactérie anaérobie obligatoire Bacteroides vulgatus mpk à 37 ° C en anaérobiose à l’aide de pots et sachets pour la création d’un environnement anaérobie (voir Table des matières)^15,16. Cultiver des b. vulgatus pendant 2 jours et cultiver une sous-culture nuitée dans bouillon de cerveau coeur cervelle (BHI).
2. Cultiver la bactérie anaérobie facultative Escherichia coli mpk dans des conditions aérobies dans le bouillon Luria-Bertani (LB) à 37 ° C. Cultiver des e. coli , du jour au lendemain dans un bouillon LB et croître la sous-culture pendant 2 h à 37 ° C le jour de l’expérience.
3. Récolter les cultures par centrifugation à 1 700 x g pendant 5 min. remettre le bactérien granulés au SPD (de Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Déterminer la densité optique (Do) des cultures bactériennes à OD 600 nm et calculer les concentrations bactériennes. Les concentrations bactériennes sont ramenées à 109/ml.

3. gavage des larves de g. mellonella avec des suspensions bactériennes

1. Gaver chaque larve avec 10 µL de la suspension bactérienne ajustée contenant 10⁷ bactéries par dose. Utiliser une seringue à insuline avec une aiguille émoussé-terminée pour application buccale de la suspension bactérienne.
   1. Difficulté de la seringue dans une pompe microseringue (Figure 1) pour assurer l’exactitude du volume suspension appliquée à chaque larve (voir Table des matières). Insérer la seringue soigneusement entre leurs mandibules. Ne forcez pas la seringue entre les mandibules. Attendez que les larves de l’ouvrir pièces buccales et insérez ensuite la seringue.
2. Incuber les larves gavés dans l’obscurité à 37 ° C entre les larves de 1 à 24 h. utilisation SPD-administré sous forme de contrôles de fond simulacre d’exclure de possibles réactions de stress induites en raison de la manipulation des larves pendant le gavage.

4. le traitement des larves administrés par voie orale et des ARN

1. Travailler sous une hotte et porter des lunettes de sécurité. Nettoyer le capot et spray réactif pour empêcher la contamination de la RNase.
   1. Clin d’oeil-gel les larves vivantes, après incubation dans l’azote liquide et homogénéiser les. Utiliser un mortier et un pistil pour l’homogénéisation. Ajouter l’azote liquide pour le mortier et la grille chaque individu larvaire jusqu'à homogénats en poudre sont produites.
   2. Verser l’homogénat d’un jetable pesage bateau et attendez que l’azote liquide s’évapore.
2. Mélanger le liquide sans azote gelé homogénats en poudre avec 1 mL de Trizol dans un tube de 2 mL et incuber le mélange à température ambiante pendant 1 h.
3. Centrifuger le mélange à 8 000 x g pendant 15 min à température ambiante et transvaser le surnageant dans un nouveau tube et éliminer le plomb. Mélanger le liquide surnageant avec 200 µL du 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP). Vortex et incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante pendant 10 minutes sur la glace.
4. Centrifuger les réactions BCP-ajout à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Transférer la couche supérieure transparente dans un nouveau tube de 2 mL et jeter le reste. Précipiter l’ARN de la couche supérieure transférée avec 500 µL isopropanol en mélangeant et en renversant le tube pendant 5 min.
5. Centrifuger le tube à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Laver le précipité culot RNA avec 500 µL d’éthanol 75 %.
6. Sécher le culot de RNA pendant 5-10 min à température ambiante. Faites attention de pas trop sécher car il sera difficile de dissoudre plus tard.
7. Diluer l’inhibiteur de la ribonucléase (1/100) dans de l’eau exempte de nucléase et 100 µL de la solution permet de resuspendre le culot de RNA séché. Vortex le tube soigneusement jusqu'à dissolution complète de la pastille.
8. RNA de mesurer la qualité et la quantité. S’assurer que le ratio 260/280 environ 2,0 et 260/230 ratio de l’ordre de 2.0-2.2 (voir Table des matières).
9. L’utilisation de 5 µg d’ARN isolé pour la digestion de la DNase. Mix 5 µL de 10 x tampon, 1 µL d’enzyme inhibiteur de la ribonucléase, 2 µL d’enzyme de DNase, 5 µg d’ARN et se remplissent d’exempte de nucléase l’eau jusqu'à 50 µL. incuber pendant 30 min à température ambiante.
   1. Ajouter 6 µL de réactif d’inactivation et incuber pendant 2 min à la réaction de RT et vortex occasionnellement. Centrifuger à réaction à 10 000 x g pendant 1 min. transfert surnageant dans tube frais de 1,5 mL.
      Remarque : L’ARN contient l’ARN larve ainsi que l’ARN bactérien de la souche respectif utilisée pour administration par voie orale.

5. quantification des nombres bactériens 16 s copie après gavage

Remarque : Le nombre de copies des 16 bactérienne exprimée a été déterminé à l’aide de cDNA synthétisé à partir de l’ARN extrait dans la section 4. Quantification finale est calculée à l’aide de la courbe d’étalonnage du plasmide dans lequel le fragment PCR de 16 s de b. vulgatus ou e. coli a été cloné.

1. Élaboration de normes de plasmide
   1. Amplifier des fragments de 16 s d’e. coli mpk ou b. vulgatus mpk ADN génomique par PCR. Mix 10 µL de 5 x tampon, 1 µL de solution de dNTP 10 mM, 2,5 µL d’apprêt avant de 10 µM et 2,5 µL de dilution de 10 µM amorce inversée, 1 µL de DMSO, 1 µL de matrice d’ADN génomique, 31,5 µL d’eau exempte de nucléase et 0,5 µL d’enzyme de relecture.
   2. Exécutez le PCR (dénaturation initiale : 98 ° C pendant 30 s, dénaturation : 98 ° C pendant 10 s, recuit : 60 ° C pendant 30 s, extension : 72 ° C pendant 30 s, extension finale : 72 ° C pendant 5 min, répéter la dénaturation, recuit et extension pour 30 cycles).
      1. Utiliser les amorces d’e. coli 16 s (p_forward : GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse : ACCAGGGTATCTAATCCTGTT¹⁷, 320 bp) ou 16 b. vulgatus amorces (p_forward : AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse : CAACTGACTTAAACATCCAT¹⁸, 400 bp) pour amplification.
   3. Utiliser les fragments PCR 16 s e. coli et b. vulgatus émoussé-fin clonage dans un vecteur de clonage. Mettre en place la ligature et mélanger 10 µL de 2 tampons, 1 µL de produit de PCR non-purifiés, 1 µL de plasmide clonage émoussé-fin, 7 µL d’eau exempte de nucléase et 1 µL de T4 DNA Ligase. Incuber la ligature pendant 10 min à température ambiante.
   4. Préparer les cellules compétentes d’Escherichia coli DH5α.
      1. Ensemencer 100 mL de milieu LB dans un Erlenmeyer avec 1 mL d’une culture d’une nuit ou plus. Cultiver la culture jusqu'à ce que OD 600 nm entre 0,4 et 0,6. Diviser la culture résultante en deux tubes de 50 mL et incuber les cultures sur la glace pendant 10 min.
      2. Centrifuger les cultures à 1 700 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension de chaque granule soigneusement avec 5 mL de solution RFI (30 mM CH₃COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl₂, ajuster le pH 5.8 avec acide glacial, stérile filtré). Remplir chaque tube avec supplémentaire 45 mL de solution RFI.
      3. Centrifuger les cultures à 1 700 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension de chaque granule soigneusement avec 6 mL de RFII (MOPS de 10 mM, 15 mM CaCl₂, 10 mM KCl, 15 % de glycérol, stérilisés à l’autoclave) solution. Mettre en commun les deux fractions et incuber la suspension 12 mL sur la glace pour 15 min. Préparez aliquotes de suspension cellulaire (200 µL). Stocker les aliquotes à-80 ° C.
   5. Transférer la réaction de ligature d’une aliquote de compétent e. coli DH5α cellules et laisser la réaction sur la glace pendant 15 min chaleur choquent les cellules pour 45 s à 42 ° C et ajouter 1 mL de milieu LB.
      1. Incuber transformation pendant 45 min à 37 ° C. Ajouter 100 µL de la transformation d’une gélose LB contenant l’ampicilline et incuber une nuit à 37 ° C.
   6. Effectuer colonie PCR de 8 transformants résultants de la gélose LB d’étape 5.1.5. Prélever chaque colonie avec un cure-dent, trempez-le sur un plat frais de livre contenant l’ampicilline (plat principal) et ensuite tremper le cure-dents même dans un contenant bien µL de 5,5 d’eau exempte de nucléase dans une bande PCR.
      1. Ajouter 7,5 µL du mélange de x PCR 2, 0,5 µL d’apprêt avant de 10 µM et 0,5 µL de dilution de primer inverse 10 µM. Utilisez les mêmes paires d’amorces mentionnés à la section 5.1.1.
      2. Exécutez le PCR (dénaturation initiale : 95 ° C pendant 5 min, dénaturation : 95 ° C pendant 1 min, recuit : 60 ° C pendant 30 s, extension : 72 ° C pendant 1 min, extension finale : 72 ° C pendant 7 min, répéter la dénaturation, recuit et extension pour 35 cycles).
   7. Vérifier que la taille des fragments 16 s sur un gel d’agarose à 1 %. Tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) de 0,5 x permet de dissoudre 1 g d’agarose et la faire bouillir au micro-ondes. Ajouter le colorant de 1/50 000 pour le gel et la verser. Ajouter les réactions de PCR de colonie et une échelle d’ADN bp 100 au gel et exécutez le gel pendant 45 min à 110 V.
   8. Ensemencer une culture de nuit LB 5 mL contenant l’ampicilline avec un clone de la plaque de maître (section 5.1.6) pour chaque plasmide 16 s e. coli et b. vulgatus qui contient la taille de l’encart de droite.
      1. Centrifuger les cultures bactériennes durant la nuit dans un tube de 2 mL à 1 700 x g. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 600 µL d’eau stérile.
      2. Ajouter 100 µL de tampon de lyse et mélanger en renversant le tube 6 fois. Ajouter 350 µL de froid (4° C) solution de neutralisation et mélanger soigneusement en renversant le tube.
      3. Centrifugeuse à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 3 min. transvaser le surnageant (~ 900 µL) dans une colonne et la centrifugeuse à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 15 s.
      4. Jeter la redistribution et ajouter 200 µL de lavage enlèvement endotoxine et centrifuger à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 15 s.
      5. Mettre 400 µL de solution de lavage dans la colonne et centrifuger à vitesse maximale dans une centrifugeuse pendant 30 s. transfert la colonne dans un tube propre 1,5 mL, ajouter 30 µL de tampon d’élution de la colonne il incuber pendant 1 min à température ambiante.
      6. Centrifugeuse à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 30 s (voir Table des matières).
   9. Déterminer la concentration d’ADN de plasmide en mélangeant 1 µL d’ADN plasmidique à 199 µL de solution de travail (1 µL de colorant fluorescent par 199 µL de tampon pour chaque réaction). Préparer deux normes en mélangeant 10 µL de standard µL 1 ou 10 de la norme 2 avec 190 µL. Vortex l’échantillon et les calibrateurs et incuber réaction pendant 2 min. mesure de la concentration (voir Table des matières).
   10. Préparer des concentrations standards en 10 fois des dilutions successives dans une gamme de 10-100 000 exemplaires : calcul de la masse de la plasmide (m = n (n) x (1.096x10-21 g/bp), = taille du plasmide, m = masse). Calculer la masse d’ADN nécessaire pour contenir le nombre de copies désiré d’intérêt plasmidique (copier nombre d’intérêt x masse du plasmide = masse du plasmide ADN nécessaire).
2. Préparation des échantillons pour la quantification
   1. Synthèse de cDNA. Mélanger 2 µL de tampon de x 7, 1 µL d’ARN DNase digéré de l’article 4 et 11 µL d’eau exempte de nucléase. Incuber pendant 2 min à 42 ° C.
      1. Placez la réaction immédiatement sur la glace. Mix 4 µL de 5 x tampon RT, 1 µL du mélange amorces RT (Transcriptase inverse), 1 µL d’enzyme RT et la réaction de l’étape 5.2.1. Incuber pendant 15 min à 42 ° C. Incuber pendant 3 min à 95° C pour inactiver les enzymes de la RT.
   2. Quantifier les ADNc concentrations de manière fluorométrique comme décrit à l’étape 5.1.9.
3. Mesure de la charge bactérienne
   1. Ajuster des concentrations d’ADNc à 5 ng par 12 réaction µL pour PCR quantitative. Mélanger le mélange de RT-PCR x 2, 0,25 µL d’apprêt avant de 100 µM, 0,25 µL de 100 amorces inverse µM (5.1.1) et 12 µL du cDNA ajusté. Exécutez qPCR (dénaturation initiale : 95 ° C pendant 5 min, dénaturation : 95 ° C pendant 10 s, recuit : 60 ° C pendant 30 s, répéter la dénaturation et recuit pour 35 cycles, fonte : 95 ° C, laissez refroidir à 4 ° C).
   2. Complot des concentrations de₁₀ journal de courbe standard de plasmide (10-100 000 exemplaires), entre 1-5 (axe x), contre les ct-valeurs correspondantes (axe y). Effectuer une régression linéaire pour obtenir l’équation de régression. Résoudre l’équation x (concentration). La formule permet de calculer le journal₁₀ le nombre de copies en y insérant ct-valeur de la formule. Calculer l’antilogarithme pour obtenir le nombre de copies.

6. détermination du gène marqueur immunitaire innée par RT-PCR quantitative

1. Vérifiez amorces pour spécificité génétique par PCR et ultérieures d’agarose gel électrophorèse pour vérifier la taille du fragment correct. Effectuer des PCR comme décrit dans la section 5.1.5.
   Ubiquitine 130 bp : avant TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, inverser CCAGTCTGCTGCTGATAAACC¹⁹ (ménage)
   Nox-4 159 bp : avant TGGCACGGCATCAGTTATCA, inverse ACAGCGACTGTCATGTGGAA⁸
   Bp n° 76 : avant ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, inverse GCCATTTTACAATCGCCACAA⁸
   Bp TPS 156 : avant GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, inverse TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA⁸
   ApoIII 265 bp : avant AGACTTGCACGCCATCAAGA, inverse TGCATGCTGTTTGTCACTGC⁸
   hemolin 267 bp : avant CTCCCTCACGGAGGACAAAC, inverse GCCACGCACATGTATTCACC⁸
   gallerimycin 161 bp : avant GAAGTCTACAGAATCACACGA, inverse ATCGAAGACATTGACATCCA⁸
   bp cécropine 158 : avant CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, inverse GTAGCTGCTTCGCCTACCAC⁸
   bp gloverin 101 : avant GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, inverse CCGTGCATCTGCTTGCTAAC⁸
   moricin 124 bp : avant GCTGTACTCGCTGCACTGAT, inverse TGGCGATCATTGCCCTCTTT⁸)
2. Évaluer l’efficacité de l’apprêt pour être E = 2.
   1. Poule 2 µL de 5-10 différents échantillons positifs (c.-à-d. les échantillons qui expriment le gène pour lequel la paire d’amorce doit être étudié).
   2. Préparer une série de dilution de 1:5 de la piscine de l’échantillon : 1 standard (S1) : non dilué de piscine ; S2 : 2 µL de S1 + 8 eau exempte de nucléase µL ; S3 : 2 µL de S2 + 8 eau exempte de nucléase µL ; S4 : 2 µL de S3 + 8 µL exempte de nucléase eau.
   3. Appliquer 1 µL de S1-S4 et un contrôle sans modèle (eau exempte de nucléase) sur une plaque de 96 puits qPCR. Ajouter 5 µL du mélange maître RT, 0.1 µL de chaque amorce de marche avant et arrière µM 100, 3,7 µL d’eau exempte de nucléase et 0.1 µL du mélange de RT / puits.
   4. Exécutez la RT-PCR quantitative (transcription inverse : 50 ° C pendant 10 min, dénaturation initiale : 95 ° C pendant 5 min, dénaturation : 95 ° C pendant 10 s, recuit : 60 ° C pendant 30 s, répéter la dénaturation et recuit pour 40 cycles, fonte : 95 ° C, laissez refroidir à 4 ° C).
   5. Intrigue log₁₀ des unités relatives pour S1-S4 (1, 0,2, 0.04, 0,008) (axe x) contre les TC-valeurs correspondantes (axe y). Effectuer une régression linéaire et déterminer la pente de la courbe standard. Calculer l’efficacité e : E = 10^-(1/slope). ²⁰
      Remarque : Une pente de-3.32 indique les conditions réactionnelles idéal et l’efficacité d’amorce de E = 2.00. Cela signifie : la quantité de produit PCR double au cours de chaque cycle.
3. Utilisez 100 ng d’ARN digérée (100 ng/µL) comme un modèle pour la RT-PCR. Réactifs de mix RT-PCR et RT-PCR exécution comme indiqué au point 6.2. Mesurer tous les échantillons de bactéries et SPD-administré avec ménage paire d’amorces et paires d’amorces de cible. Exécutez toujours les dilutions S1-S4 avec la paire d’amorces ménage et S1-S4 avec la paire d’amorces de cible sur la même plaque pour la détermination de l’efficacité.
4. Calculer le ratio (R) de l’expression génique RNA selon la formule suivante à l’aide de l’efficacité de l’apprêt déterminé expérimentalement de l’entretien ménager et la paire d’amorces de cible. Normaliser les bactéries stimulé des échantillons pour se moquer des contrôles²⁰.
   
   R : ratio
   E_cible: efficacité du S1-4 mesurée avec la paire d’amorces de cible
   E_{entretien ménager}: efficacité du S1-4 mesurée avec ménage paire d’amorces
   Δct_cible^{(contrôle-échantillon)}: Δct (CT d’échantillon SPD-fed)-(ct d’échantillon alimenté par les bactéries) mesurée à l’aide de paire d’amorces de cible
   Δct_{entretien ménager}^(témoin): Δct (CT d’échantillon SPD-fed)-(ct d’échantillon alimenté par les bactéries) mesurée à l’aide de ménage paire d’amorces

Le modèle d’infection g. mellonella hémolymphe chez largement utilisé pour analyser les facteurs de virulence d’une grande variété d’agents pathogènes. La plupart des mesures comprennent l’analyse de la mortalité des larves, qui est une méthode assez facile. Néanmoins, cette méthode ne pas permettre des conclusions sur la réponse immunitaire en général et les résultats des réponses immunitaires mellonella g. associer les mécanismes immunitaires vertébrés. Le modèle d’administration par voie orale de g. mellonella en revanche que rarement sert pour infection orale ou de la colonisation des larves en raison des difficultés à obtenir de dosage exact infection9. En outre, seulement on connaît mal g. mellonella des réponses immunitaires innées vers des bactéries non pathogènes surtout les commensaux intestinales chez les mammifères.

Contrairement aux agents pathogènes, germes commensaux conteste l’hôte et déclencher des réponses immunitaires, mais le système immunitaire est en mesure de maintenir l’homéostasie immunitaire. G. mellonella est capable d’effacer la charge bactérienne gavée initiale jusqu'à ce que finalement aucune bactérie n’était détectables plus (Figure 2)8. Les 16 nombre de copies du gène de vulgatus b. et e. coli a sensiblement diminué dans les 24h.

Nous avons démontré qu’administrés commensal des larves de g. mellonella induisent l’expression des gènes RNA des gènes marqueurs de l’immunité innée différents : molécules de LPS-reconnaissance - apolipophorine (ApoIII) et hemolin (Figure 3A, B) se sont avérés être généralement plus exprimée chez e. coli-administré des larves par rapport à b. vulgatus-administré larves8. En outre, l’expression des gènes marqueurs de deux types de molécules antimicrobiennes peut être surveillée. La production d’oxygène réactif et azotés (ROS/Ia) peut être estimée par la mesure de l’expression des gènes amendements et Nox-4 qui ont été démontrés pour être fortement augmentée sur e. coli gavage par rapport à B. vulgatus (Figure 4A, B)8. En outre, l’expression des gènes des antioxydants TPS on observe (Figure 4C). 8

En outre, nous avons montré qu’expression de différents peptides antimicrobiens fut poussée plus fort après l’administration d’e. coli qu’en réponse à b. vulgatus gavage. Nous avons observé une augmentation de gallerimycin defensin-like peptide, interaction LPS gloverin peptide, cécropine et moricin (Figure 5A, B, C, D)8.

Figure 1 : Le programme d’installation à l’aide d’une microseringue pompe de gavage. Une aiguille émoussé-terminée est ajustée dans la pompe microseringue qui permet une injection précise des bactéries. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Persistance de la charge bactérienne chez les larves de Galleria mellonella après gavage. Copier les numéros de b. vulgatus- et e. coli-spécifique 16 s rADN ont été déterminées à partir 5 ng de l’ADNc à différents moments par RT-PCR. Points de données sont affichés avec indication de la médiane. Modification de la référence 8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Reconnaissance de formes différentielles des bactéries par g. mellonella. Les larves ont été administrés avec deux différents commensaux intestinale, l’ARN a été isolé après 1 à 6 h et expression de l’ARNm de LPS reconnaissance molécule apolipophorine (ApoIII) (A) et hemolin (B) a été déterminée. Points de données représentent des moyennes géométriques avec écart-type de la moyenne (SEM) (p > 0,05 ; *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001). 8 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Expression du gène marqueur ROS après défi bactérien. E. coli et b. vulgatus ont été gavés et l’expression des gènes marqueurs ROS défense a été analysée au fil du temps. Nos (A), Nox-4 (B) et TPS (C) expression de l’ARNm a été mesurée en ARN larvaire. Points de données représentent des moyennes géométriques avec écart-type de la moyenne (SEM) (p > 0,05 ; *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001). Modification de la référence 8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Expression induite par le commensal defensin-like peptide antimicrobien chez les larves de g. mellonella et cellules épithéliales humaines. Les larves ont été administrés par voie orale avec b. vulgatus ou e. coli, des réponses immunitaires ont été observées au fil du temps et ARN a été isolé par des individus larvaires. gallerimycin (A), cécropine (B), gloverin (C), moricin (D) expression de l’ARNm a été déterminée. Points de données représentent des moyennes géométriques avec écart-type de la moyenne (SEM) (p > 0,05 ; *, p < 0,05 ; **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001). Modification de la référence 8. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.