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Article de méthode

Un modèle d’Administration orale à des réponses immunitaires innées Study Commensal-Induced Galleria mellonella

8.1K vues

DOI :

10.3791/59270

21 mars 2019

Dans cet article

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour un modèle d’administration par voie orale à l’aide de larves de Galleria mellonella et comment caractériser induit des réponses immunitaires innées. Utilisant ce protocole, les chercheurs sans expérience pratique seront en mesure d’utiliser le g. mellonella méthode de gavage.

Résumé

L’étude du potentiel immunogène de bactéries commensales sur le système immunitaire est un des éléments essentiels lors de l’étude des interactions hôtes-microorganismes intestinaux. Il est bien établi que les commensaux différents présentent un potentiel différent pour stimuler le système immunitaire intestinal. Ces enquêtes impliquant des animaux vertébrés, en particulier les rongeurs. Étant donné les préoccupations croissantes en matière d’éthique sont liés à des expériences portant sur des vertébrés, il y a une forte demande pour les modèles de remplacements d’invertébrés.

Ici, nous fournissons un modèle d’administration par voie orale de Galleria mellonella utilisant des bactéries non pathogènes commensaux et l’évaluation possible du potentiel immunogène des commensaux sur le système immunitaire de g. mellonella . Nous démontrons que g. mellonella est un modèle de remplacement d’invertébrés alternative utile qui permet l’analyse des commensaux avec potentiel immunogène différent comme Bacteroides vulgatus et Escherichia coli. Fait intéressant, les bactéries ont montré aucun effet de tuer les larves, qui est similaire aux mammifères. Les réponses immunitaires de g. mellonella étaient comparables aux vertébrés les réponses immunitaires innées et impliquent la reconnaissance de la bactérie et la production de molécules antimicrobiennes. Nous proposons que g. mellonella a réussi à rétablir l’équilibre précédent microbiote, bien connue des individus sains de mammifères. Bien que fournissant comparables les réponses immunitaires innées chez g. mellonella et de vertébrés, g. mellonella n’héberge pas un système immunitaire adaptatif. Puisque les composantes étudiées du système immunitaire inné sont évolutifs conservée, le modèle permet une présélection et première analyse des propriétés immunogènes bactériennes.

Introduction

Le microbiome intestinal est une composante essentielle pour le maintien de l’homéostasie et implique les deux réponses immunitaires innée et adaptative1,2. La communauté microbiote commensal est caractérisée par différents principaux constituants commensaux : symbiotes qui confèrent des effets bénéfiques par les fonctions immunomodulatrices important et pathobionts qui peuvent avoir des effets préjudiciables dans génétiquement prédisposé héberge et de promouvoir et de déclencher l’inflammation intestinale3,4. De nombreuses études sur les symbiotes et ....

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Protocole

1. g. mellonella élevage et préparation des larves pour les expériences

Remarque : Le cycle de l’oeuf au dernier stade larvaire larve prend environ 5-6 semaines.

  1. Transférer les oeufs pondus par des papillons adultes aux boîtes de 2 L contenant le substrat de la teigne (grains de maïs de 22 %, 22 % farine de blé, 17,5 % cire d’abeille, 11 %, lait écrémé en poudre, miel de 11 %, 11 % de glycérol, 5,5 % séché levure). Effectuer toute reproduction à 30 ° C dans l’obscurité.
  2. Le transfert de 25 g de substrat contenant les larves en substrat frais après environ 1-2 semaines où petites et minuscules larves étaient visib....

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Résultats

Le modèle d’infection g. mellonella hémolymphe chez largement utilisé pour analyser les facteurs de virulence d’une grande variété d’agents pathogènes. La plupart des mesures comprennent l’analyse de la mortalité des larves, qui est une méthode assez facile. Néanmoins, cette méthode ne pas permettre des conclusions sur la réponse immunitaire en général et les résultats des réponses immunitaires mellonella g. associer les mécanismes immunitaires vertébrés. Le modèle d’adm.......

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Discussion

Le modèle de g. mellonella est un modèle souvent utilisé pour évaluer les facteurs de virulence bactériens dans une infection systémique approche21. Puisque de nombreuses bactéries et agents pathogènes entrent l’hôte par l’intermédiaire de la colonisation ou l’infection par voie orale, nouvelles connaissances doivent être trouvées pour évaluer des g. mellonella comme un modèle de colonisation orale et l’infection.

La possibilité d’arrière g. mellon.......

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par la DFG (SPP1656), le groupe de formation de recherche DFG 1708, le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) et le centre allemand pour la recherche Infection (DZIF).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de 1,5 mLEppendorf0030120086
échelle d’ADN de 100 pb.Thermo Fisher Scientific15628019
1-Bromo-3-Chloropropane (BCP)Sigma-AldrichB9673
Tubes de 2 mLEppendorf0030120094
2x MangomixBiolineBIO-25033Colony PCR
50 mLtubes Greiner Bio-One210 261
AgaroseBiozym840004
Cired’abeilleMixed-Store.de-Cerveau
bouillon d’infusion cardiaqueThermo Fisher ScientificCM1135
CloneJET PCR Cloning Kit ThermoFisher ScientificK1232Vecteur de clonage pour fragments 16S
Gruau de maïsOstermü ; hle Naturkost GmbH306Culture biologique
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton DickinsonBD
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Becton Dickinson244610
Kit d’élimination de l’ADN sans ADN  ;Thermo Fisher Scientific244510  ; Digestion dnase
Levure sècheRaiponceCulturebiologique
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)Thermo Fisher Scientific14040
ÉthanolVWR20821.330
GlycérolSigma-AldrichW252506
MielOstermü ; hle Naturkost GmbH487
Isopropanol  ;VWR20842.330
Lightcycler 480 Instrument IIRoche Molecular Systems5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, blancRoche Molecular Systems4729692001
Pompe à microseringue manuelle avec affichage numériqueWorld Precision InstrumentsDMP
Micro-Fine+ U-100 seringue à insuline 0,3 x 8 mmBecton Dickinson324826Mortier d’administration orale
, non émailléVWR410-9327
NanodropThermo Fisher Scientific13-400-518
Eau sans nucléases  ;Thermo Fisher Scientific10977035
° Oxoïde  ;Thermo Fisher ScientificAN0025AQualité et quantité de bandes d’ARN
PCRBiozym710970
Pilon, surface de broyage non émailléeVWR410-9324  ;
Enzyme de relecture de phusion  ;Thermo Fisher ScientificF553S
AmorcesBiomers  ;-
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit  ;Qiagen204056qPCR pour la mesure du nombre de copies bactériennes
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit  ;Qiagen204156qRT-PCR pour les mesures d’expression génique
QuantiTect Reverse Transcription Kit  ;Qiagen205311synthèse d’ADNc
Qubit Tubes de dosageThermo Fisher ScientificQ32856
Qubit dsHS DNA kit  ;Thermo Fisher ScientificQ32851Quantification d’échantillons de plasmide et d’ADNc
Fluorimètre Qubit ThermoFisher ScientificQ33226Quantification d’échantillons de plasmide et d’ADNc
RNase-ExitusPlusAppliChemA7153
Rnasin Inhibiteur de ribonucléasePromegaN2511
Lait écrémé en poudreSucofin  ;-
Réactif SYBR safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
TRI.Sigma-AldrichT9424
Bateau de pesageVWR10803-148
Tourteau de bléOstermü ; hle Naturkost GmbH6462Culture biologique
Sachets d’anaérogén

Références

  1. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
  2. Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G.

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