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Article de méthode

Un modèle d’Administration orale à des réponses immunitaires innées Study Commensal-Induced Galleria mellonella

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DOI :

10.3791/59270

⸱

21 mars 2019

 ,  , 
1Department for Medical Microbiology, Hygiene, Interfacultary Institute for Microbiology, Infection Medicine, University of Tübingen

Dans cet article

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour un modèle d’administration par voie orale à l’aide de larves de Galleria mellonella et comment caractériser induit des réponses immunitaires innées. Utilisant ce protocole, les chercheurs sans expérience pratique seront en mesure d’utiliser le g. mellonella méthode de gavage.

Résumé

L’étude du potentiel immunogène de bactéries commensales sur le système immunitaire est un des éléments essentiels lors de l’étude des interactions hôtes-microorganismes intestinaux. Il est bien établi que les commensaux différents présentent un potentiel différent pour stimuler le système immunitaire intestinal. Ces enquêtes impliquant des animaux vertébrés, en particulier les rongeurs. Étant donné les préoccupations croissantes en matière d’éthique sont liés à des expériences portant sur des vertébrés, il y a une forte demande pour les modèles de remplacements d’invertébrés.

Ici, nous fournissons un modèle d’administration par voie orale de Galleria mellonella utilisant des bactéries non pathogènes commensaux et l’évaluation possible du potentiel immunogène des commensaux sur le système immunitaire de g. mellonella . Nous démontrons que g. mellonella est un modèle de remplacement d’invertébrés alternative utile qui permet l’analyse des commensaux avec potentiel immunogène différent comme Bacteroides vulgatus et Escherichia coli. Fait intéressant, les bactéries ont montré aucun effet de tuer les larves, qui est similaire aux mammifères. Les réponses immunitaires de g. mellonella étaient comparables aux vertébrés les réponses immunitaires innées et impliquent la reconnaissance de la bactérie et la production de molécules antimicrobiennes. Nous proposons que g. mellonella a réussi à rétablir l’équilibre précédent microbiote, bien connue des individus sains de mammifères. Bien que fournissant comparables les réponses immunitaires innées chez g. mellonella et de vertébrés, g. mellonella n’héberge pas un système immunitaire adaptatif. Puisque les composantes étudiées du système immunitaire inné sont évolutifs conservée, le modèle permet une présélection et première analyse des propriétés immunogènes bactériennes.

Introduction

Le microbiome intestinal est une composante essentielle pour le maintien de l’homéostasie et implique les deux réponses immunitaires innée et adaptative1,2. La communauté microbiote commensal est caractérisée par différents principaux constituants commensaux : symbiotes qui confèrent des effets bénéfiques par les fonctions immunomodulatrices important et pathobionts qui peuvent avoir des effets préjudiciables dans génétiquement prédisposé héberge et de promouvoir et de déclencher l’inflammation intestinale3,4. De nombreuses études sur les symbiotes et les pathobionts et leur influence sur le système immunitaire ont été publiés principalement étudier des réponses immunes adaptatives.

Puisque ces études impliquent beaucoup d’animaux pour les enquêtes et la protection et remplacement des animaux utilisés pour l’expérimentation est d’accroître l’intérêt du public, nous cherchons à trouver un modèle de remplacement afin de permettre un dépistage de bactéries différentes immunogènes propriétés. Insectes, en particulier la Galleria mellonella, sont un modèle de remplacement largement utilisé dans la recherche de l’infection. G. mellonella combine différents avantages tels que le faible coût et haut débit ; Il permet l’administration orale de bactéries, qui est la voie d’exposition naturelle, et qu’il permet l’infection systémique5,6. G. mellonella plus permet d’incubation à 37 ° C, qui est la température physiologique du corps des mammifères et l’optimum pour la virulence bactérienne facteur expression5. Le principal avantage de g. mellonella est le système immunitaire inné conservé qui permet la discrimination du soi du non-soi et code pour une variété de récepteurs de reconnaissance de modèle comme apolipophorine ou les opsonines hemolin6, 7. dès la reconnaissance de microbe, g. mellonella peut déclencher différents immunité humorale en aval. Il peut induire des réponses de stress oxydatif et sécrètent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui implique l’activité de NOS (synthase nitrique oxydase) et NOX (NADPH oxydase)6,8. En outre, g. mellonella active une réponse puissant peptide antimicrobien (AMP), qui se traduit par la sécrétion d’un mélange d’amplis différents tels que gloverin, moricin, cécropine ou le gallerimycin de type defensin6, 8,9,10. En règle générale, amplis ont une spécificité très large spectre d’hôtes contre les champignons et les bactéries gram-positives et Gram-négatives et doivent fournir une réponse puissante étant donné que les insectes ne manquent aucune réponse adaptative10. Gloverin est un amplificateur actif contre les bactéries et les champignons et inhibe la formation de la membrane externe6,11. Moricins pièce leur fonction antimicrobienne contre les bactéries gram-positives et Gram-négatives de pénétrer la membrane et formant un pore9,11. Objectif fournit une activité contre les bactéries et les champignons et permeabilize la membrane de la même manière comme moricins9,10. Gallerimycin est un peptide de type defensin avec propriétés anti-fongiques9. Fait intéressant, il a été constaté que la combinaison de cécropine et gallerimycin avait une activité synergique contre e. coli10.

En raison de leur caractère de facile-à-utiliser g. mellonella larves sont un modèle d’infection souvent utilisé pour évaluer la pathogénicité bactérienne. En particulier, études dans lesquels des données provenant de g. mellonella sont en corrélation avec les données obtenues du support de la souris, la force de ce modèle d’hôte alternatif. Il a été constaté que les sérotypes les plus pathogènes dans un modèle d’infection de souris de Listeria monocytogenes conduisent aussi à des taux plus élevés de mortalité dans g. mellonella après l’infection systémique. En outre, moins virulentes sérotypes avéré pour être aussi moins virulente dans le modèle de g. mellonella 12. Des observations similaires ont été faites avec les champignons pathogènes humains Candida albicans. Virulence souches différentes de c. albicans a été évaluée par infection systémique et suivi de la survie des larves. Les souches avirulentes de souris ont été également non virulente ou exposées réduit de virulence chez g. mellonella, alors que les souches virulentes de souris mènent également à forte mortalité larvaire13. Le modèle de g. mellonella pourrait également servir à identifier type 3 sécrétion système facteurs de pathogénicité de Pseudomonas aeruginosa14.

Étant donné que la plupart des enquêtes impliquant g. mellonella ont porté sur les facteurs de virulence à l’aide de l’approche de l’infection systémique nous intéressait surtout en fournissant une méthode appropriée pour l’analyse des commensaux intestinale dans un gavage oral modèle dans lequel nous pouvons appliquer un dosage distinct des bactéries par les larves et non seulement observer le taux de mortalité larvaire mais analyser les différentes caractéristiques des réponses immunitaires innées pour maintenir l’homéostasie intestinale.

Notre méthode permet d’accroître l’utilisation de g. mellonella comme un modèle de remplacement puisque nous combinons l’application de bactéries et de l’analyse de l’expression des RNA. Il n’est pas seulement utile renforcer le sens d’études de la pathogénie bactérienne quand y compris l’analyse des réponses immunitaires après administration par voie orale et non seulement l’observation des taux de mortalité après une infection systémique. Nos méthodes permet d’analyse des propriétés immunogènes de bactéries non pathogènes commensaux puisqu’il est fournit des conditions plus complexes que la culture de cellules en offrant une barrière intestinale dans un organisme vivant.

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Protocole

1. g. mellonella élevage et préparation des larves pour les expériences

Remarque : Le cycle de l’oeuf au dernier stade larvaire larve prend environ 5-6 semaines.

  1. Transférer les oeufs pondus par des papillons adultes aux boîtes de 2 L contenant le substrat de la teigne (grains de maïs de 22 %, 22 % farine de blé, 17,5 % cire d’abeille, 11 %, lait écrémé en poudre, miel de 11 %, 11 % de glycérol, 5,5 % séché levure). Effectuer toute reproduction à 30 ° C dans l’obscurité.
  2. Le transfert de 25 g de substrat contenant les larves en substrat frais après environ 1-2 semaines où petites et minuscules larves étaient visibles. Synchroniser les larves après 2 semaines selon leur taille et garder des groupes de 30 à 40 larves dans des conteneurs de 2 L sur substrat de teigne pendant 2 semaines.
  3. Sélectionnez les larves pour expériences en poids. Utiliser des larves mobiles seulement pâles et rapides d’une masse de 180 à 200 mg.

2. culture et préparation des Bacteroides vulgatus et Escherichia coli pour administration par voie orale

  1. Cultiver la bactérie anaérobie obligatoire Bacteroides vulgatus mpk à 37 ° C en anaérobiose à l’aide de pots et sachets pour la création d’un environnement anaérobie (voir Table des matières)15,16. Cultiver des b. vulgatus pendant 2 jours et cultiver une sous-culture nuitée dans bouillon de cerveau coeur cervelle (BHI).
  2. Cultiver la bactérie anaérobie facultative Escherichia coli mpk dans des conditions aérobies dans le bouillon Luria-Bertani (LB) à 37 ° C. Cultiver des e. coli , du jour au lendemain dans un bouillon LB et croître la sous-culture pendant 2 h à 37 ° C le jour de l’expérience.
  3. Récolter les cultures par centrifugation à 1 700 x g pendant 5 min. remettre le bactérien granulés au SPD (de Dulbecco Phosphate-Buffered Saline). Déterminer la densité optique (Do) des cultures bactériennes à OD 600 nm et calculer les concentrations bactériennes. Les concentrations bactériennes sont ramenées à 109/ml.

3. gavage des larves de g. mellonella avec des suspensions bactériennes

  1. Gaver chaque larve avec 10 µL de la suspension bactérienne ajustée contenant 107 bactéries par dose. Utiliser une seringue à insuline avec une aiguille émoussé-terminée pour application buccale de la suspension bactérienne.
    1. Difficulté de la seringue dans une pompe microseringue (Figure 1) pour assurer l’exactitude du volume suspension appliquée à chaque larve (voir Table des matières). Insérer la seringue soigneusement entre leurs mandibules. Ne forcez pas la seringue entre les mandibules. Attendez que les larves de l’ouvrir pièces buccales et insérez ensuite la seringue.
  2. Incuber les larves gavés dans l’obscurité à 37 ° C entre les larves de 1 à 24 h. utilisation SPD-administré sous forme de contrôles de fond simulacre d’exclure de possibles réactions de stress induites en raison de la manipulation des larves pendant le gavage.

4. le traitement des larves administrés par voie orale et des ARN

  1. Travailler sous une hotte et porter des lunettes de sécurité. Nettoyer le capot et spray réactif pour empêcher la contamination de la RNase.
    1. Clin d’oeil-gel les larves vivantes, après incubation dans l’azote liquide et homogénéiser les. Utiliser un mortier et un pistil pour l’homogénéisation. Ajouter l’azote liquide pour le mortier et la grille chaque individu larvaire jusqu'à homogénats en poudre sont produites.
    2. Verser l’homogénat d’un jetable pesage bateau et attendez que l’azote liquide s’évapore.
  2. Mélanger le liquide sans azote gelé homogénats en poudre avec 1 mL de Trizol dans un tube de 2 mL et incuber le mélange à température ambiante pendant 1 h.
  3. Centrifuger le mélange à 8 000 x g pendant 15 min à température ambiante et transvaser le surnageant dans un nouveau tube et éliminer le plomb. Mélanger le liquide surnageant avec 200 µL du 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP). Vortex et incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante pendant 10 minutes sur la glace.
  4. Centrifuger les réactions BCP-ajout à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Transférer la couche supérieure transparente dans un nouveau tube de 2 mL et jeter le reste. Précipiter l’ARN de la couche supérieure transférée avec 500 µL isopropanol en mélangeant et en renversant le tube pendant 5 min.
  5. Centrifuger le tube à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Laver le précipité culot RNA avec 500 µL d’éthanol 75 %.
  6. Sécher le culot de RNA pendant 5-10 min à température ambiante. Faites attention de pas trop sécher car il sera difficile de dissoudre plus tard.
  7. Diluer l’inhibiteur de la ribonucléase (1/100) dans de l’eau exempte de nucléase et 100 µL de la solution permet de resuspendre le culot de RNA séché. Vortex le tube soigneusement jusqu'à dissolution complète de la pastille.
  8. RNA de mesurer la qualité et la quantité. S’assurer que le ratio 260/280 environ 2,0 et 260/230 ratio de l’ordre de 2.0-2.2 (voir Table des matières).
  9. L’utilisation de 5 µg d’ARN isolé pour la digestion de la DNase. Mix 5 µL de 10 x tampon, 1 µL d’enzyme inhibiteur de la ribonucléase, 2 µL d’enzyme de DNase, 5 µg d’ARN et se remplissent d’exempte de nucléase l’eau jusqu'à 50 µL. incuber pendant 30 min à température ambiante.
    1. Ajouter 6 µL de réactif d’inactivation et incuber pendant 2 min à la réaction de RT et vortex occasionnellement. Centrifuger à réaction à 10 000 x g pendant 1 min. transfert surnageant dans tube frais de 1,5 mL.
      Remarque : L’ARN contient l’ARN larve ainsi que l’ARN bactérien de la souche respectif utilisée pour administration par voie orale.

5. quantification des nombres bactériens 16 s copie après gavage

Remarque : Le nombre de copies des 16 bactérienne exprimée a été déterminé à l’aide de cDNA synthétisé à partir de l’ARN extrait dans la section 4. Quantification finale est calculée à l’aide de la courbe d’étalonnage du plasmide dans lequel le fragment PCR de 16 s de b. vulgatus ou e. coli a été cloné.

  1. Élaboration de normes de plasmide
    1. Amplifier des fragments de 16 s d’e. coli mpk ou b. vulgatus mpk ADN génomique par PCR. Mix 10 µL de 5 x tampon, 1 µL de solution de dNTP 10 mM, 2,5 µL d’apprêt avant de 10 µM et 2,5 µL de dilution de 10 µM amorce inversée, 1 µL de DMSO, 1 µL de matrice d’ADN génomique, 31,5 µL d’eau exempte de nucléase et 0,5 µL d’enzyme de relecture.
    2. Exécutez le PCR (dénaturation initiale : 98 ° C pendant 30 s, dénaturation : 98 ° C pendant 10 s, recuit : 60 ° C pendant 30 s, extension : 72 ° C pendant 30 s, extension finale : 72 ° C pendant 5 min, répéter la dénaturation, recuit et extension pour 30 cycles).
      1. Utiliser les amorces d’e. coli 16 s (p_forward : GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse : ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) ou 16 b. vulgatus amorces (p_forward : AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse : CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) pour amplification.
    3. Utiliser les fragments PCR 16 s e. coli et b. vulgatus émoussé-fin clonage dans un vecteur de clonage. Mettre en place la ligature et mélanger 10 µL de 2 tampons, 1 µL de produit de PCR non-purifiés, 1 µL de plasmide clonage émoussé-fin, 7 µL d’eau exempte de nucléase et 1 µL de T4 DNA Ligase. Incuber la ligature pendant 10 min à température ambiante.
    4. Préparer les cellules compétentes d’Escherichia coli DH5α.
      1. Ensemencer 100 mL de milieu LB dans un Erlenmeyer avec 1 mL d’une culture d’une nuit ou plus. Cultiver la culture jusqu'à ce que OD 600 nm entre 0,4 et 0,6. Diviser la culture résultante en deux tubes de 50 mL et incuber les cultures sur la glace pendant 10 min.
      2. Centrifuger les cultures à 1 700 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension de chaque granule soigneusement avec 5 mL de solution RFI (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl2, ajuster le pH 5.8 avec acide glacial, stérile filtré). Remplir chaque tube avec supplémentaire 45 mL de solution RFI.
      3. Centrifuger les cultures à 1 700 x g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension de chaque granule soigneusement avec 6 mL de RFII (MOPS de 10 mM, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15 % de glycérol, stérilisés à l’autoclave) solution. Mettre en commun les deux fractions et incuber la suspension 12 mL sur la glace pour 15 min. Préparez aliquotes de suspension cellulaire (200 µL). Stocker les aliquotes à-80 ° C.
    5. Transférer la réaction de ligature d’une aliquote de compétent e. coli DH5α cellules et laisser la réaction sur la glace pendant 15 min chaleur choquent les cellules pour 45 s à 42 ° C et ajouter 1 mL de milieu LB.
      1. Incuber transformation pendant 45 min à 37 ° C. Ajouter 100 µL de la transformation d’une gélose LB contenant l’ampicilline et incuber une nuit à 37 ° C.
    6. Effectuer colonie PCR de 8 transformants résultants de la gélose LB d’étape 5.1.5. Prélever chaque colonie avec un cure-dent, trempez-le sur un plat frais de livre contenant l’ampicilline (plat principal) et ensuite tremper le cure-dents même dans un contenant bien µL de 5,5 d’eau exempte de nucléase dans une bande PCR.
      1. Ajouter 7,5 µL du mélange de x PCR 2, 0,5 µL d’apprêt avant de 10 µM et 0,5 µL de dilution de primer inverse 10 µM. Utilisez les mêmes paires d’amorces mentionnés à la section 5.1.1.
      2. Exécutez le PCR (dénaturation initiale : 95 ° C pendant 5 min, dénaturation : 95 ° C pendant 1 min, recuit : 60 ° C pendant 30 s, extension : 72 ° C pendant 1 min, extension finale : 72 ° C pendant 7 min, répéter la dénaturation, recuit et extension pour 35 cycles).
    7. Vérifier que la taille des fragments 16 s sur un gel d’agarose à 1 %. Tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) de 0,5 x permet de dissoudre 1 g d’agarose et la faire bouillir au micro-ondes. Ajouter le colorant de 1/50 000 pour le gel et la verser. Ajouter les réactions de PCR de colonie et une échelle d’ADN bp 100 au gel et exécutez le gel pendant 45 min à 110 V.
    8. Ensemencer une culture de nuit LB 5 mL contenant l’ampicilline avec un clone de la plaque de maître (section 5.1.6) pour chaque plasmide 16 s e. coli et b. vulgatus qui contient la taille de l’encart de droite.
      1. Centrifuger les cultures bactériennes durant la nuit dans un tube de 2 mL à 1 700 x g. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 600 µL d’eau stérile.
      2. Ajouter 100 µL de tampon de lyse et mélanger en renversant le tube 6 fois. Ajouter 350 µL de froid (4° C) solution de neutralisation et mélanger soigneusement en renversant le tube.
      3. Centrifugeuse à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 3 min. transvaser le surnageant (~ 900 µL) dans une colonne et la centrifugeuse à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 15 s.
      4. Jeter la redistribution et ajouter 200 µL de lavage enlèvement endotoxine et centrifuger à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 15 s.
      5. Mettre 400 µL de solution de lavage dans la colonne et centrifuger à vitesse maximale dans une centrifugeuse pendant 30 s. transfert la colonne dans un tube propre 1,5 mL, ajouter 30 µL de tampon d’élution de la colonne il incuber pendant 1 min à température ambiante.
      6. Centrifugeuse à vitesse maximale dans une centrifugeuse pour 30 s (voir Table des matières).
    9. Déterminer la concentration d’ADN de plasmide en mélangeant 1 µL d’ADN plasmidique à 199 µL de solution de travail (1 µL de colorant fluorescent par 199 µL de tampon pour chaque réaction). Préparer deux normes en mélangeant 10 µL de standard µL 1 ou 10 de la norme 2 avec 190 µL. Vortex l’échantillon et les calibrateurs et incuber réaction pendant 2 min. mesure de la concentration (voir Table des matières).
    10. Préparer des concentrations standards en 10 fois des dilutions successives dans une gamme de 10-100 000 exemplaires : calcul de la masse de la plasmide (m = n (n) x (1.096x10-21 g/bp), = taille du plasmide, m = masse). Calculer la masse d’ADN nécessaire pour contenir le nombre de copies désiré d’intérêt plasmidique (copier nombre d’intérêt x masse du plasmide = masse du plasmide ADN nécessaire).
  2. Préparation des échantillons pour la quantification
    1. Synthèse de cDNA. Mélanger 2 µL de tampon de x 7, 1 µL d’ARN DNase digéré de l’article 4 et 11 µL d’eau exempte de nucléase. Incuber pendant 2 min à 42 ° C.
      1. Placez la réaction immédiatement sur la glace. Mix 4 µL de 5 x tampon RT, 1 µL du mélange amorces RT (Transcriptase inverse), 1 µL d’enzyme RT et la réaction de l’étape 5.2.1. Incuber pendant 15 min à 42 ° C. Incuber pendant 3 min à 95° C pour inactiver les enzymes de la RT.
    2. Quantifier les ADNc concentrations de manière fluorométrique comme décrit à l’étape 5.1.9.
  3. Mesure de la charge bactérienne
    1. Ajuster des concentrations d’ADNc à 5 ng par 12 réaction µL pour PCR quantitative. Mélanger le mélange de RT-PCR x 2, 0,25 µL d’apprêt avant de 100 µM, 0,25 µL de 100 amorces inverse µM (5.1.1) et 12 µL du cDNA ajusté. Exécutez qPCR (dénaturation initiale : 95 ° C pendant 5 min, dénaturation : 95 ° C pendant 10 s, recuit : 60 ° C pendant 30 s, répéter la dénaturation et recuit pour 35 cycles, fonte : 95 ° C, laissez refroidir à 4 ° C).
    2. Complot des concentrations de10 journal de courbe standard de plasmide (10-100 000 exemplaires), entre 1-5 (axe x), contre les ct-valeurs correspondantes (axe y). Effectuer une régression linéaire pour obtenir l’équation de régression. Résoudre l’équation x (concentration). La formule permet de calculer le journal10 le nombre de copies en y insérant ct-valeur de la formule. Calculer l’antilogarithme pour obtenir le nombre de copies.

6. détermination du gène marqueur immunitaire innée par RT-PCR quantitative

  1. Vérifiez amorces pour spécificité génétique par PCR et ultérieures d’agarose gel électrophorèse pour vérifier la taille du fragment correct. Effectuer des PCR comme décrit dans la section 5.1.5.
    Ubiquitine 130 bp : avant TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, inverser CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (ménage)
    Nox-4 159 bp : avant TGGCACGGCATCAGTTATCA, inverse ACAGCGACTGTCATGTGGAA8
    Bp n° 76 : avant ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, inverse GCCATTTTACAATCGCCACAA8
    Bp TPS 156 : avant GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, inverse TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8
    ApoIII 265 bp : avant AGACTTGCACGCCATCAAGA, inverse TGCATGCTGTTTGTCACTGC8
    hemolin 267 bp : avant CTCCCTCACGGAGGACAAAC, inverse GCCACGCACATGTATTCACC8
    gallerimycin 161 bp : avant GAAGTCTACAGAATCACACGA, inverse ATCGAAGACATTGACATCCA8
    bp cécropine 158 : avant CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, inverse GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8
    bp gloverin 101 : avant GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, inverse CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8
    moricin 124 bp : avant GCTGTACTCGCTGCACTGAT, inverse TGGCGATCATTGCCCTCTTT8)
  2. Évaluer l’efficacité de l’apprêt pour être E = 2.
    1. Poule 2 µL de 5-10 différents échantillons positifs (c.-à-d. les échantillons qui expriment le gène pour lequel la paire d’amorce doit être étudié).
    2. Préparer une série de dilution de 1:5 de la piscine de l’échantillon : 1 standard (S1) : non dilué de piscine ; S2 : 2 µL de S1 + 8 eau exempte de nucléase µL ; S3 : 2 µL de S2 + 8 eau exempte de nucléase µL ; S4 : 2 µL de S3 + 8 µL exempte de nucléase eau.
    3. Appliquer 1 µL de S1-S4 et un contrôle sans modèle (eau exempte de nucléase) sur une plaque de 96 puits qPCR. Ajouter 5 µL du mélange maître RT, 0.1 µL de chaque amorce de marche avant et arrière µM 100, 3,7 µL d’eau exempte de nucléase et 0.1 µL du mélange de RT / puits.
    4. Exécutez la RT-PCR quantitative (transcription inverse : 50 ° C pendant 10 min, dénaturation initiale : 95 ° C pendant 5 min, dénaturation : 95 ° C pendant 10 s, recuit : 60 ° C pendant 30 s, répéter la dénaturation et recuit pour 40 cycles, fonte : 95 ° C, laissez refroidir à 4 ° C).
    5. Intrigue log10 des unités relatives pour S1-S4 (1, 0,2, 0.04, 0,008) (axe x) contre les TC-valeurs correspondantes (axe y). Effectuer une régression linéaire et déterminer la pente de la courbe standard. Calculer l’efficacité e : E = 10-(1/slope). 20
      Remarque : Une pente de-3.32 indique les conditions réactionnelles idéal et l’efficacité d’amorce de E = 2.00. Cela signifie : la quantité de produit PCR double au cours de chaque cycle.
  3. Utilisez 100 ng d’ARN digérée (100 ng/µL) comme un modèle pour la RT-PCR. Réactifs de mix RT-PCR et RT-PCR exécution comme indiqué au point 6.2. Mesurer tous les échantillons de bactéries et SPD-administré avec ménage paire d’amorces et paires d’amorces de cible. Exécutez toujours les dilutions S1-S4 avec la paire d’amorces ménage et S1-S4 avec la paire d’amorces de cible sur la même plaque pour la détermination de l’efficacité.
  4. Calculer le ratio (R) de l’expression génique RNA selon la formule suivante à l’aide de l’efficacité de l’apprêt déterminé expérimentalement de l’entretien ménager et la paire d’amorces de cible. Normaliser les bactéries stimulé des échantillons pour se moquer des contrôles20.
    figure-protocol-1
    R : ratio
    Ecible: efficacité du S1-4 mesurée avec la paire d’amorces de cible
    Eentretien ménager: efficacité du S1-4 mesurée avec ménage paire d’amorces
    Δctcible(contrôle-échantillon): Δct (CT d’échantillon SPD-fed)-(ct d’échantillon alimenté par les bactéries) mesurée à l’aide de paire d’amorces de cible
    Δctentretien ménager(témoin): Δct (CT d’échantillon SPD-fed)-(ct d’échantillon alimenté par les bactéries) mesurée à l’aide de ménage paire d’amorces

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Résultats

Le modèle d’infection g. mellonella hémolymphe chez largement utilisé pour analyser les facteurs de virulence d’une grande variété d’agents pathogènes. La plupart des mesures comprennent l’analyse de la mortalité des larves, qui est une méthode assez facile. Néanmoins, cette méthode ne pas permettre des conclusions sur la réponse immunitaire en général et les résultats des réponses immunitaires mellonella g. associer les mécanismes immunitaires vertébrés. Le modèle d’adm...

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Discussion

Le modèle de g. mellonella est un modèle souvent utilisé pour évaluer les facteurs de virulence bactériens dans une infection systémique approche21. Puisque de nombreuses bactéries et agents pathogènes entrent l’hôte par l’intermédiaire de la colonisation ou l’infection par voie orale, nouvelles connaissances doivent être trouvées pour évaluer des g. mellonella comme un modèle de colonisation orale et l’infection.

La possibilité d’arrière g. mellon...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par la DFG (SPP1656), le groupe de formation de recherche DFG 1708, le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) et le centre allemand pour la recherche Infection (DZIF).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de 1,5 mLEppendorf0030120086
échelle d’ADN de 100 pb.Thermo Fisher Scientific15628019
1-Bromo-3-Chloropropane (BCP)Sigma-AldrichB9673
Tubes de 2 mLEppendorf0030120094
2x MangomixBiolineBIO-25033Colony PCR
50 mLtubes Greiner Bio-One210 261
AgaroseBiozym840004
Cired’abeilleMixed-Store.de-Cerveau
bouillon d’infusion cardiaqueThermo Fisher ScientificCM1135
CloneJET PCR Cloning Kit ThermoFisher ScientificK1232Vecteur de clonage pour fragments 16S
Gruau de maïsOstermü ; hle Naturkost GmbH306Culture biologique
Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton DickinsonBD
Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Becton Dickinson244610
Kit d’élimination de l’ADN sans ADN  ;Thermo Fisher Scientific244510  ; Digestion dnase
Levure sècheRaiponceCulturebiologique
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)Thermo Fisher Scientific14040
ÉthanolVWR20821.330
GlycérolSigma-AldrichW252506
MielOstermü ; hle Naturkost GmbH487
Isopropanol  ;VWR20842.330
Lightcycler 480 Instrument IIRoche Molecular Systems5015278001
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, blancRoche Molecular Systems4729692001
Pompe à microseringue manuelle avec affichage numériqueWorld Precision InstrumentsDMP
Micro-Fine+ U-100 seringue à insuline 0,3 x 8 mmBecton Dickinson324826Mortier d’administration orale
, non émailléVWR410-9327
NanodropThermo Fisher Scientific13-400-518
Eau sans nucléases  ;Thermo Fisher Scientific10977035
° Oxoïde  ;Thermo Fisher ScientificAN0025AQualité et quantité de bandes d’ARN
PCRBiozym710970
Pilon, surface de broyage non émailléeVWR410-9324  ;
Enzyme de relecture de phusion  ;Thermo Fisher ScientificF553S
AmorcesBiomers  ;-
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1222
QuantiFast SYBR Green PCR kit  ;Qiagen204056qPCR pour la mesure du nombre de copies bactériennes
QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit  ;Qiagen204156qRT-PCR pour les mesures d’expression génique
QuantiTect Reverse Transcription Kit  ;Qiagen205311synthèse d’ADNc
Qubit Tubes de dosageThermo Fisher ScientificQ32856
Qubit dsHS DNA kit  ;Thermo Fisher ScientificQ32851Quantification d’échantillons de plasmide et d’ADNc
Fluorimètre Qubit ThermoFisher ScientificQ33226Quantification d’échantillons de plasmide et d’ADNc
RNase-ExitusPlusAppliChemA7153
Rnasin Inhibiteur de ribonucléasePromegaN2511
Lait écrémé en poudreSucofin  ;-
Réactif SYBR safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102
TRI.Sigma-AldrichT9424
Bateau de pesageVWR10803-148
Tourteau de bléOstermü ; hle Naturkost GmbH6462Culture biologique
Sachets d’anaérogén

Références

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