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Article de méthode

Expression transitoire dans la betterave rouge de biopharmaceutique candidat vaccin contre le diabète de Type 1

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DOI :

10.3791/59298

⸱

19 mars 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour produire un candidat vaccin oral contre le diabète de Type 1 dans une plante comestible.

Résumé

Moléculture végétale est l’utilisation des plantes pour produire des molécules d’intérêt. Dans cette perspective, plantes peuvent servir aussi bien comme des bioréacteurs pour la production et la purification ultérieure du produit final et la livraison directe par voie orale de protéines hétérologues lors de l’utilisation des espèces de plantes comestibles. Dans ce travail, nous présentons le développement d’un vaccin oral contre le diabète de Type 1 (T1D) dans les systèmes de plantes comestibles en utilisant la technologie de base de virus recombinant DNA plante déconstruite, livrée avec infiltration sous vide. Nos résultats montrent que la betterave rouge est un hôte approprié pour l’expression transitoire d’un auto-antigène dérivée humaine associée à T1D, considéré comme un candidat prometteur comme vaccin T1D. Feuilles produisant l’auto-antigène ont été soigneusement caractérisés pour leur résistance à la digestion gastrique, la présence d’une charge bactérienne résiduelle et leur profil métabolique secondaire, ce qui donne une vue d’ensemble de la production de processus pour l’utilisation potentielle des plantes pour la prestation orale directe d’une protéine hétérologue. Notre analyse a montré une dégradation presque complète du vaccin oral candidat lyophilisés après une digestion gastrique simulée, ce qui suggère qu’il faut une stratégie d’encapsulation dans la fabrication du vaccin GAD végétale.

Introduction

Depuis la révolution de la biologie moléculaire végétale dans les années 1980, les systèmes à base de plantes pour la fabrication de produits biopharmaceutiques peuvent être considérés comme une alternative aux systèmes traditionnels basés sur des cellules microbiennes et mammifères1. Plantes affichent plusieurs avantages sur les plateformes traditionnelles, avec l’évolutivité, de rentabilité et de sécurité étant les plus pertinents2. Le produit recombinant peut être purifié à partir de tissus végétaux transformés et ensuite administré, soit par voie parentérale ou par voie orale et, en outre, plante comestible transformée peut être utilisé directement pour administration par voie orale. Voie orale favorise simultanément l’immunité muqueuse et systémique, et il élimine le besoin d’aiguilles et de personnel médical spécialisé. En outre, prestation orale élimine le traitement complexe en aval, qui représente normalement 80 % du coût total de fabrication d’une protéine recombinante3. Tous ces avantages peuvent se traduire par des économies dans la production, des fournitures et du travail en réduisant les coûts de chaque dose, rendant la drogue abordables pour la plupart de la population mondiale.

Plusieurs stratégies, tant pour la transformation stable et expression transitoire, ont été développés pour la production de protéines recombinantes dans des plantes. Parmi eux, un système d’expression de base de virus de plante déconstruite à haut rendement (p. ex., magnICON) offre des performances supérieures entraînant des rendements élevés de protéines recombinantes des échelles de temps relativement court,4. Beaucoup d’exemples d’expression transitoire dans le système d’expression de base de virus de plante Nicotiana benthamiana plants est signalés, étant l’hôte de production de l’étalon-or. Cependant, cette plante de modèle n’est pas considérée comme une espèce comestible en raison des alcaloïdes et d’autres métabolites toxiques qui sont accumulent dans ses feuilles.

Dans ce travail, nous décrivons la comparaison entre deux systèmes de plantes comestibles, betterave rouge (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) et épinards (Spinacea oleracea cv Industria), pour l’expression de deux formes de candidat de l’isoforme 65 kDa de l’acide glutamique décarboxylase (GAD65), réalisée par l’usine base de virus vecteurs5. GAD65 est un auto-antigène majeur lié au diabète de Type 1 (T1D) et il est actuellement sous enquête dans des essais cliniques humains pour prévenir ou retarder T1D en induisant la tolérance6. La production de GAD65 chez les plantes a été étudiée chez les espèces de plantes modèle Nicotiana tabacum et N. benthamiana4,5,6,7. Nous décrivons ici l’utilisation d’espèces végétales comestibles pour la production de la molécule dans les tissus qui peut être signifié pour une livraison directe par voie orale. D’un point de vue technique, nous avons étudié et sélectionné le système plante agroinfiltration et la plate-forme de plantes comestibles pour la production de GAD65 en évaluant les différents paramètres : les niveaux de l’expression de protéine recombinante, la charge microbienne résiduelle en usine tissu destiné à l’administration orale, la résistance de GAD65 à la digestion gastrique et la bioéquivalence des plantes transformées avec le type sauvage.

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Protocole

1. rouge culture de betterave et des épinards

  1. Cultiver la betterave rouge (b. vulgaris cv Moulin Rouge) et épinards (S. oleracea cv Industria) plantes dans une chambre de croissance, à l’aide de 150 µE d’intensité lumineuse, 65 % d’humidité relative, cycle lumière/obscurité de 12 h à 23/21 ° C, respectivement.
  2. Après la germination des graines, fertiliser les plantes deux fois par semaine avec une solution de 1 g/L d’engrais disponible dans le commerce (Table des matières). Pour agroinfiltration utiliser cinq semaines aux épinards et plantes de betterave rouge de six semaines.

2. transitoire expression grâce à la technologie de base de virus de plante déconstruite

  1. Construction usine de vecteurs d’expression
    1. Introduire les vecteurs - le module 5' (pICH20111), les 3' modules (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut et pICH7410.eGFP), préparés comme décrit précédemment1,2,7et le module de l’intégrase (pICH14011)- chez Agrobacterium tumefaciens GV3101 souche selon les techniques habituelles. Poussent sur milieu LB contenant 50 rifampicine μg/mL et les antibiotiques appropriés de vecteur spécifique (50 carbénicilline μg/mL pour pICH20111, pICH14011 et pICH7410.eGFP), 50 kanamycine μg/mL pour pICH31070 pendant 2 jours à 28 ° C.
    2. Les colonies colonie de PCR avec les amorces spécifiques suivants pour chaque vecteur de l’écran : 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' et 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' pour les 3' modules pICH31070.GAD65mut et pICH31070.∆87G65mut, avec une température de recuit de 55 ° C et un temps d’allongement de 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' et 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' pour la troisième 3' pICH7410.eGFP module, avec une température de recuit de 53 ° C et un temps d’élongation de 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' et 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' pour le module 5', avec une température de recuit de 53 ° C et un temps d’élongation de 20 s et 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' et 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' pour le module intégrase avec une température de recuit de 57 ° C et un temps d’allongement de 45 s.
    3. Effectuer la réaction de PCR dans un volume total de 20 μL en utilisant le cycle de réaction spécifique suivant : dénaturation initiale de 5 min à 95 ° C, 35 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à la température de recuit et l’étape d’élongation à 72 ° C (température et l’allongement des temps de recuit une re spécifique pour chaque couple d’amorce) et une étape d’élongation finale de 7 min à 72 ° C.
  2. Agroinfiltration seringue
    1. Inoculer les trois transformants d’a. tumefaciens dans 50 mL de LB moyen contenant 50 μg/mL la rifampicine et les vecteur spécifique des antibiotiques appropriés suivants : 50 carbénicilline μg/mL pour a. tumefaciens transformé avec pICH20111, pICH14011 ou pICH7410.eGFP ou 50 μg/mL kanamycine pour a. tumefaciens transformé avec pICH31070. Croître par agitation pendant la nuit à 28 ° C.
    2. Cultures bactériennes durant la nuit à pellets par centrifugation à 4 500 x g pendant 20 min et les remettre en suspension dans 100 mL (ou deux volumes de la culture bactérienne initiale) du tampon d’infiltration contenant de l’acide 4-morpholineethanesulfonic 10 mM (MES ; pH 5.5) et 10 mM MgSO4, sans tenir compte de l’OD600. Incuber les suspensions à température ambiante (RT) pendant 3 h.
    3. Mélanger des quantités égales de suspensions bactériennes contenant un des trois modules, GAD65mut, ∆87GAD65mut ou eGFP 3' module, avec 5' module et module de l’intégrase. Utiliser le mélange de suspension pour l’infiltration de la seringue de feuilles rouge de betterave et des épinards.
    4. Déposer 5 mL de la suspension dans une seringue sans l’aiguille. Appuyez sur l’extrémité de la seringue contre la face inférieure de la feuille pour les épinards et les usines de la betterave rouge et pendant ce temps appliquer une contrepression douce de l’autre côté de la feuille.
    5. S’infiltrer dans les trois premières feuilles complètement développées à partir de l’apex pour chaque plante. Les feuilles d’agroinfiltrated avec une étiquette en papier sur la tige de la feuille de l’étiquette. Retourner les plantes dans une chambre de croissance dans des conditions normales.
      Remarque : Pour des raisons de santé et de sécurité, porter des lunettes de protection et des gants lors de l’infiltration.
    6. Agroinfiltrated recueillir les feuilles de 4 à 14 jours après l’infection (dpi) et congelez-les dans l’azote liquide. Magasin des tissus végétaux à-80 ° C.
  3. Agroinfiltration sous vide
    1. Se développer séparément les trois transformants d’a. tumefaciens dans 50 mL de milieu LB contenant 50 rifampicine μg/mL et vecteur spécifique approprié antibiotique par agitation pendant la nuit à 28 ° C.
    2. Pellet nuit des cultures bactériennes par centrifugation à 4 500 x g pendant 20 min. resuspendre le culot dans 1 L de tampon d’infiltration à une OD600 de 0,35 et incuber les suspensions à ta pendant 3 h.
    3. Ajouter 0,01 % v/v du détergent (polysorbate 20) à chaque suspension. Mélanger des quantités égales de suspensions bactériennes contenant un des trois modules, GAD65mut, ∆87GAD65mut ou eGFP 3' module, avec 5' module et module de l’intégrase.
    4. Insérer une plante (six semaines betterave rouge planter, voir section 1) dans le support. Inverser le support et la placer sur un bécher contenant le bain d’infiltration (2 L) pour plonger les feuilles dans la suspension d’infiltration.
      Remarque : Assurez-vous que toutes les feuilles sont complètement plongés dans la suspension bactérienne. Élever le niveau avec l’ajout de suspension infiltration supplémentaire si nécessaire.
    5. Le bain d’infiltration avec la plante submergée de transfert à la chambre de l’infiltration et fermez-le. Mettre en marche la pompe à vide et ouvrir la soupape d’admission sous vide sur la chambre de l’infiltration.
    6. Une fois que la pression dans la chambre d’infiltration a réduit à 90 mbar, garder le vide pendant 3 min. sortie le vide pour 45 s. Une fois que la chambre de l’infiltration est revenue à la pression atmosphérique, ouvrir la chambre et enlever la plante infiltrée du bain bactérien.
    7. Retourner les plantes dans une chambre de croissance dans des conditions normales.
    8. Recueillent les feuilles agroinfiltrated l’expression maximale des jours, selon la protéine recombinante et congelez-les dans l’azote liquide. Magasin des tissus végétaux à-80 ° C.

3. analyse de l’expression recombinant protein

  1. Extraction des protéines solubles totales (TSP)
    1. Moudre la seringue ou vide infiltré des feuilles rouges d’épinards et de betterave, collectées lors des étapes 2.2.6 et 2.3.8, à poudre fine dans l’azote liquide à l’aide de mortier et un pilon. Transférer la poudre dans des tubes en plastique de 15 mL et de stocker les matériaux à-80 ° C.
    2. Ajouter 900 µL de tampon d’extraction (50 mM de phosphate de sodium de pH 8,0, métabisulfite de sodium 20 mM) à 300 mg de poudre de feuilles.
      NOTE : Le rapport sélectionné entre plante tissus poids (mg) au volume (µL) de la mémoire tampon est de 1:3.
    3. Homogénéiser le mélange au vortex pendant 1 min, puis centrifuger à 30 000 x g pendant 40 min à 4 ° C.
    4. Récupérer le surnageant dans un tube propre et conserver à-80 ° C.
  2. Plante eGFP visualisation et quantification
    1. Charger 100 µL de chaque extrait TSP obtenu d’eGFP exprimant des feuilles, en trois répétitions techniques, sur une plaque à 96 puits.
    2. Mettre la plaque de 96 puits en un lecteur de fluorescence et démarrer la mesure. Utilisez le 485/535 nm filtre requis pour la détection par fluorescence eGFP.
    3. Pour la quantification absolue, dans la même assiette préparer une courbe d’étalonnage des quantités différentes de chargement (62,5, 125, 500, 750 et 1 000 ng) d’un eGFP purifiée.
  3. Bicinchoninic dosage d’acide (BCA) pour la quantification de TSP
    1. Mélanger 50 parts de réactif A (Table des matières) avec 1 partie de réactif B (Table des matières). Préparer un volume suffisant de solution de travail BCA fraîche pour les échantillons à doser et les étalons.
      Remarque : Le volume de solution de travail requis pour chaque échantillon de BCA est 1,9 mL. La procédure standard avec 9 étalons (y compris un blanc), 17,1 mL de solution de travail BCA est nécessaire.
    2. Pipetter 0,1 mL de chaque norme (y compris un blanc) et d’extraits de c. à thé dans un tube marqué.
      Remarque : Comme étalons, préparer une nouvelle série de l’albumine sérique bovine normes (BSA) dans la gamme de 10-1 000 μg/mL, préférence utilisant le diluant que les échantillons, tels que l’eau. Le blanc se compose de 0,1 mL de diluant utilisé pour la solution étalon et préparation des échantillons.
    3. Ajouter 1,9 mL de solution de travail BCA et bien mélanger. Couvrir les tubes et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
    4. Refroidir les tubes RT. mesurer l’absorbance à 562 nm de tous les échantillons dans les 10 min.
      Remarque : Même à la droite, continue le développement de la couleur. Aucune erreur significative ne sera introduit lorsque les mesures d’absorbance de tous les tubes sont effectuées en moins de 10 min.
    5. Soustrayez la valeur d’absorbance 562 nm de la vierge d’après les relevés des normes et des extraits TSP.
    6. Intrigue le blanc-corrigé 562 nm de lecture pour chaque norme sa concentration. Déterminer la concentration de la protéine de chaque extrait TSP.
  4. Effectuer le gel bleu de Coomassie coloration comme décrit précédemment dans Gecchele et al.,8.
  5. Analyse par Western blot
    1. Effectuer l’analyse par transfert western comme décrit dans Gecchele et al.,8.
    2. Après la séparation électrophorétique des protéines, transférez-les sur une membrane de nitrocellulose, selon les techniques habituelles. Préparez la solution de blocage par le mélange de lait de 4 % en (PBS) saline tamponnée au phosphate pH 7.4. Bloquer la membrane avec 10 mL de la solution de saturation à la droite pendant 1 h.
    3. Préparer l’anticorps primaire de lapin au 1/10 000 pour les anti-GAD65/67 et anti-LHCB2 et au 1/20 000 pour l’anti-eGFP dans 5 mL de solution de saturation avec 0,1 % de détergent. Incuber la membrane avec les solutions d’anticorps primaire préparés durant la nuit à 4 ° C ou de 4 h à RT avec agitation constante.
    4. Jeter l’anticorps primaire et laver la membrane 3 fois pendant 5 min chacun avec blocage solution contenant 0,1 % de détergent.
    5. Préparer la peroxydase de raifort (HRP)-des anticorps de anti-lapin conjugué au 1/10 000 en bloquant la solution avec 0,1 % de détergent. Incuber la membrane pendant 1,5 h à RT avec agitation constante.
    6. Jeter l’anticorps secondaire et laver la membrane 5 fois pour 5 min chacun avec PBS-T (PBS additionné de 0,1 % de détergent).
    7. Incubez la membrane avec une solution de luminol commercialement disponibles suivant les instructions du fabricant. Détecter le signal à l’aide d’un système d’imagerie de la chimiluminescence.

4. traitement des matériaux végétaux

  1. Récolte de la betterave rouge exprimant le ∆87GAD65mut d’agroinfiltrated sous vide laisse à l’apogée de l’expression (11 dpi) et congelez-les dans l’azote liquide.
  2. Lyophiliser les feuilles congelées pendant 72 h à-50 ° C et 0,04 mbar. Stocker à-80 ° C.
  3. Broyer les feuilles en poudre fine et stockez-le à ta dans un récipient hermétique avec gel de silice, d’exclure l’humidité.

5. analyse d’intégrité de simulation et de la cellule gastrique digestion

  1. Simulation de la digestion gastrique
    1. Peser 100 mg de feuilles de betterave rouge lyophilisée broyé et il resuspendre dans 6 mL de PBS (pH 7,4).
    2. Ajuster le pH de l’échantillon à 2 avec du HCl 6 M.
    3. Ajouter la pepsine 4 mg/mL de muqueuse gastrique de porc dans HCl pour obtenir une concentration finale de pepsine de 1 mg/mL soit un ratio de 01:20 pour les protéines solubles totales de 10 mM. Agiter l’échantillon à 37 ° C pendant 120 min.
    4. Ajuster les échantillons à pH 8 avec 1 NaOH M pour inactiver la pepsine.
    5. Centrifuger 750 µL d’extraits de chaque échantillon à 20 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Collecter séparément le surnageant et resuspendre le culot dans un seul volume de surnageant de tampon de chargement (1,5 M Tris HCl, pH 6,8, SDS de 3 %, 15 % de glycérol et 4 % de 2-mercaptoéthanol).
      Remarque : Pour des raisons de santé et de sécurité, gants et travailler sous hotte aspirante pour la préparation de l’échantillon.
    6. Analyser le surnageant et l’extrait concentré de tache occidentale analyse8.
  2. Analyse de l’intégrité cellulaire
    1. Préparer les deux échantillons de 100 mg de feuilles de betterave rouge lyophilisée broyé et resuspendre dans 6 mL de PBS (pH 7,4).
    2. Ajuster le pH de seulement un échantillon de 2 à 6 M HCl. secouer les deux échantillons à 37 ° C pendant 120 min.
    3. Centrifuger 750 µL d’extraits de chaque échantillon à 20 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Collecter séparément le surnageant et resuspendre le culot dans un seul volume de surnageant de tampon de chargement.
    4. Analyser le surnageant et l’extrait concentré en analyse par western blot.

6. dosage de la charge microbienne

  1. Peser 100 mg de feuilles de betterave rouge lyophilisée. Remettre en suspension de la poudre en 8 mL de PBS stérile (pH 7,4) et vortexer pendant 1 min.
  2. Préparer le milieu LB sans antibiotiques ni contenant i 50 rifampicine µg/mL, (ii) 50 µg/mL chacune de rifampicine et de carbénicilline, (iii) 50 µg/mL chacune de la rifampicine et la kanamycine ou (iv) 50 µg/mL chacune de rifampicine, carbénicilline et kanamycine.
  3. Plaque de 1 mL de chaque homogénat lyophilisé de feuilles dans l’une des géloses sélectives 5 LB.
  4. Incuber les plaques de tous pendant 3 jours à 28 ° C.
  5. Compter les colonies Agrobacterium sur chaque plaque.
  6. Calculer et définir la charge bactérienne résiduelle comme le nombre d’unités formant colonies (UFC) par mL de l’homogénat de feuilles lyophilisées (UFC/mL).

7. extraction de métabolite

  1. Extraction de métabolite primaire
    1. Peser de 30 mg de-80 ° C stocké, sous vide agroinfiltrated ∆87GAD65mut exprimant poudre de feuilles de betterave rouge dans un tube en plastique de 2 mL.
    2. Ajouter 750 µL de froid 70/30 (v/v) de méthanol/chloroforme et vortex pendant 30 s. incuber à-20 ° C pendant 2 h.
      Remarque : Tous les solvants et additifs doivent être SM-grade.
    3. Ajouter 600 µL d’eau froide et centrifuger à 17 900 x g à 4 ° C pendant 10 min. à frais virés et transfert de la phase supérieure hydroalcoolique dans un nouveau tube de 2 mL. Jeter la phase chloroformique inférieure et l’interphase.
    4. Placer les échantillons dans une pompe à vide pour évaporer les solvants pendant 3 h.
    5. Dissoudre le culot obtenu d’étape 7.1.4 dans 300 µL de 50/50 (v/v) d’acétonitrile/eau et laisser agir les échantillons pendant 3 min.
    6. Traverser les solutions 0,2 μm membranes filtrantes et mettez-les dans un transparent fixe 300 µL insérer des tubes de verre.
  2. Extraction de métabolites secondaires
    1. Peser 300 mg de-80 ° C stocké, sous vide agroinfiltrated exprimant ∆87GAD65mut poudre de feuilles de betterave rouge dans un tube en plastique de 15 mL.
    2. Ajouter 3 mL de méthanol, vortexer pendant 30 s et ultrasons 40 kHz pendant 15 min.
      Remarque : Tous les solvants et additifs doivent être SM-grade.
    3. Centrifuger les échantillons à 4 500 x g à 4 ° C pendant 10 min et transvaser le surnageant dans nouveaux tubes de 15 mL.
    4. Diluer 100 µL d’extrait 1:3 (v/v) avec de l’eau et passer la solution à travers un filtre à membrane 0,2 μm.
    5. Mettre la solution dans un tube de verre d’insertion de 300 µL fixe transparent.
  3. Extraction de lipides polaires
    1. Peser 200 mg de-80 ° C stocké, sous vide agroinfiltrated exprimant ∆87GAD65mut poudre de feuilles de betterave rouge dans un tube en plastique de 15 mL.
    2. Ajouter 200 µL d’eau, puis 2 mL de méthanol et puis continuez sur la glace pendant 1 h.
      Remarque : Tous les solvants et additifs doivent être SM-grade.
    3. Vortexer pendant 30 s et ultrasons 40 kHz pendant 15 min.
    4. Centrifuger les échantillons à 4 500 x g à 4 ° C pendant 25 min. collecter et transfert la phase chloroformique dans des tubes de 2 mL. Jeter la phase supérieure hydroalcoolique et l’interphase.
    5. Placer les échantillons dans une pompe à vide pour évaporer le solvant pendant 3 h.
    6. Dissoudre le culot obtenu à l’étape 7.3.5 avec 600 µL de méthanol.
    7. Diluer 100 µL d’extrait 1:5 (v/v) avec du méthanol et passer la solution à travers un filtre à membrane 0,2 μm.
    8. Mettre la solution dans un tube de verre d’insertion de 300 µL fixe transparent.

8. chromatographie à la spectrométrie de masse analyse et traitement des données

  1. Mettre en place le système SM-tel que recommandé par le fournisseur.
    Remarque : La section LC se compose d’un échantillonneur automatique couplé avec HPLC équipé d’une précolonne C18 (75 x 2.1 mm, particule taille 5 µm) devant une colonne C18 (150 x 2.1 mm, particule taille 3 µm) pour l’analyse des métabolites secondaires et les lipides polaires , alors qu’avec une précolonne HILIC (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) devant une colonne HILIC (150 x 2.1 mm, particule taille 2,7 µm). La MS est un spectromètre de masse de piège à ions muni d’un ionisation par électrospray (ESI) ou d’une sources d’ionisation chimique (APCI) de la pression atmosphérique.
  2. Préparer les solvants appropriés pour les gradients de CLHP. Pour l’analyse des métabolites primaires, utiliser le formiate d’ammonium 20 mM comme solvant A ; 95 % d’acétonitrile, 5 % d’eau plus formiate d’ammonium 10 mM comme solvant B. Pour l’analyse des métabolites secondaires, utiliser l’eau plus de 0.05 % d’acide formique (A) et de l’acétonitrile plus de 0.05 % d’acide formique (B). Pour l’analyse des lipides polaires, utiliser l’eau plus 0,05 % d’acide formique (A) et 100 % d’acétonitrile (B).
    Remarque : Les solvants et additifs doivent être SM-grade.
  3. Utilisez les gradients présentés au tableau 1 pour élution de métabolite. Ensemble le débit à 0,2 mL/min. injecter 10 µL de chaque échantillon pour les métabolites secondaires et les lipides polaires, considérant qu’injecter 5 µL de métabolites primaires.
  4. Préparer un échantillon de contrôle de la qualité (CQ) en mélangeant des parts égales de différents échantillons d’avoir un mélange représentatif de chaque condition expérimentale. Analyser l’échantillon QC pendant l’expérience pour surveiller l’efficacité de l’instrument. Plus précisément, insérez une analyse d’échantillon QC après chaque échantillon-lot de 10.
  5. Alternez les échantillons afin d’éviter les effets axée sur l’instrument.
  6. Après 9 analyses, insérer une colonne nettoyage méthode ainsi qu’une analyse vide immédiatement après.
    Remarque : Effectuez un lent dégradé entre les deux solvants avec une élution isocratique à fort pourcentage de solvant plus fort. Le blanc se compose d’une injection d’un méthanol pur : l’eau (50/50, v/v) d’améliorer la reproductibilité de temps de rétention dans l’analyse qui suit.
  7. Mettre en place l’instrument en vue d’acquérir des spectres de masse dans les modes de rechange ionisation positive et négative en utilisant les paramètres répertoriés dans le tableau 2.
    Remarque : Autres paramètres dépendent de la plateforme spécifique.
  8. Effectue le traitement de données suivant comme il est expliqué dans la Dal Santo et coll.9.

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Résultats

Dans ce travail, le flux de travail pour l’élaboration d’un vaccin oral dans les tissus végétaux comestibles est présenté. L’objectif de ce travail est l’expression d’une protéine cible dans une espèce de plante hôte comestibles et la caractérisation du potentiel vaccin oral.

La première étape consistait à l’évaluation de la pertinence de la technologie d’expression à base de virus de plante pour produire des protéines recombina...

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Discussion

Dans cette étude, nous avons montré une analyse préliminaire pour la conception d’un candidat-vaccin oral pour diabète auto-immun. La protéine cible pour cette expérience a été une forme mutante de l’humain 65 kDa Glutamate Décarboxylase, dont la production et la fonctionnalité sont facilement détectable et mesurable12. Son expression dans des tissus différents végétaux comestibles a été véhiculée par les vecteurs5, qui véhiculent un haut niveau de production de protéines r...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet commun « L’utilisation des plantes pour la production d’un vaccin comestible de diabète auto-immun (eDIVA) » (projet ID : 891854) financé par l’Université de Vérone, dans le cadre de l’appel de 2014.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2-&mu ; m Minisart RC4 filtres à membraneSartorius-Stedim17764
2&ndash ; mercaptoéthanolSigmaM3148Toxique ; 4 % pour fabriquer un tampon de charge avec du glycérol, du SDS et du Tris-HCl
4-Acide morpholinéthanesulfonique (MES)SigmaM8250pH 5,5
Plaque à 96 puitsSarstedt833924
Acide acétiqueSigma27221
Acétonitrile corrosif LC-MS gradeSigma34967
AcétosyringoneSigmaD134406Toxique &ndash ; 0,1 M stock dans DMSO
Agar Bacteriological GradeApplichemA094915 g/L pour fabriquer un milieu LB (pH 7,5 avec NaOH) avec extrait de levure, NaCl et Tryptone
Ammoniumformate Sigma70221
Anticorps anti-eGFPABCamab290
Anticorps anti-GAD 65/67SigmaG5163
Anticorps anti-LHCB2AgriseraAS01 003
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
C18 ColumnGrace  ;   ; -Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm ; 3 &mu ; m) Colonne
C18 Colonne de gardeGrace  ;   ; -Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm ; 5 &mu ; m) Garde Colonne
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15Engrais
Carbenicilline disodiqueDuchefa BiochemieC0109Système
d’imagerie par chimiluminescenceBioRad1708370ChemiDoc Système d’imagerie tactile
ChloroformSigmaC2432
DétergentSigmaP5927Polysorbate 20
Lecteur de fluorescencePerkin-Elmer  ; 1420-011VICTOR Multilabel Compteur
d’acide formique LC-MS gradeSigma94318
GlycérolSigmaG551615 % pour faire tampon de chargement avec Tris-HCl, SDS et 2&ndash ; mercaptoéthanol
GoTaq G2 polymérasePromegaM7841
HClSigmaH1758Colonne
HILICGrace  ;   ; -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm ; particules de taille 2,7 &mu ; m) Colonne
HILIC Guard Column Grace  ;   ; -Vision HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm ; 3 &mu ; m) Garde Colonne Anticorps
anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)SigmaA6154Ne pas congeler/décongeler trop de fois
HPLC AutosamplerBeckman Coulter  ;   ; -Système Gold 508 Échantillonneur automatique
Système HPLCBeckman Coulter  ;   ; -System Gold 128 Module de solvant HPLC
IsopropanolSigma24137Sulfate
kanamycineSigmaK4000Toxique
KClSigmaP95412 g/L avec NaCl , Na2HPO4 et KH2PO4 pour faire
PBS KH2PO4 SigmaP97912,4 g/L avec NaCl , Na2HPO4 et KCl pour fabriquer une solution PBS
Loading Buffer
LuminolGe HealthcareRPN2232Préparez la solution à l’aide du kit commercial ECL Prime Western Blotting System
Lyophilizator5PascalLIO5P0000DGT
Mass SpectometerBruker Daltonics  ; -Bruker Esquire 6000 ; le spectromètre de masse était équipé d’une source ESI et l’analyseur était un piège à ions
MethanolSigma32213
MgSO4SigmaM7506
Solution de blocage du laitRistora  ;   ; -3 % dans le
PBS Na2HPO4SigmaS7907Utiliser avec NaH2PO4 pour faire un tampon de phospate de sodium
NaClSigmaS301480 g/L avec KCl, Na2HPO4 et KH2PO4 pour faire du PBS ; 10 g/L pour faire du milieu LB (pH 7,5 avec NaOH) avec de l’extrait de levure, Tryptone et gélose de qualité bactériologique
NaH2PO4SigmaS8282  ; À utiliser avec du Na2HPO4 pour fabriquer un tampon de phospate de sodium ; 14,4 g/L pour fabriquer PBS
NaOHSigmaS8045
Membrane nitrocellulaseGe Healthcare10600002
Pepsin à partir de la muqueuse gastrique porcineSigmaP7000
Substrat de peroxydase ECLGE HealthcareRPN2235Matériau sensible à la lumière
Pompe Presse à videVWR111400000098
Réactif ASigmaB9643Utilisez 50 parties de ce réactif avec 1 partie de réactif B pour préparer la solution de travail BCA
Réactif BSigmaB9643Utilisez 1 partie de ce réactif avec 50 parties de réactif A pour préparer la solution de travail BCA
RifampicineDuchefa BiochemieR0146Toxique &ndash ; 25 mg/mL stock dans DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulfate)SigmaL3771Inflammable, toxique, corrosif-10 % de stock ; 3 % pour faire un tampon de charge avec du Tris-HCl, du Glycérol et 2&ndash ; mercaptoéthanol
Métabisulfite de sodiumSigma7681-57-4
Système de sonicateurSoltec090.003.0003Sonica® ; 2200 MH ; fréquence 40 khz
SeringueTerumo  ;   ; -
Transparent fixe 300-& micro ; Tubes en verre à insert en LThermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT1503Ajustez le pH avec 1N HCl pour faire un tampon Tris-HCl, utilisez 1,5M Tris-HCl (pH 6,8) pour faire un tampon de chargement avec SDS, Glycérol et 2&ndash ; mercaptoéthanol
TryptoneFormediumTRP0310 g/L pour faire un milieu LB (pH 7,5 avec NaOH) avec extrait de levure, NaCl et gélose Concentrateur sous vide de qualité bactériologique
Heto3878 F1-3Système Speed-vac
Eau de qualité LC-MSSigma39253
Extrait de levureSigmaY13335 g/L pour fabriquer un milieu LB (pH 7,5 avec NaOH) avec du tryptone, du NaCl et de la gélose de qualité bactériologique
toxique corrosive de inflammable

Références

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