Summary
Genellikle kültürlü hücreler üzerinde bileşiklerin bir dizi potansiyel sitotoksisite değerlendirmek için gereklidir. Burada, 96-iyi formatında toksik bileşikler için güvenilir bir tarama stratejisi açıklar.
Abstract
Sitotoksisite terapötik yararları olabilir ilaçlar çalışırken ölçülmesi gereken kritik bir parametredir. Bu nedenle, birçok ilaç tarama tahlilleri tek tek bileşikler için profilli kritik özelliklerinden biri olarak sitotoksisite kullanmak. Kültür hücreleri daha pahalı ve emek yoğun hayvan modellerinde umut verici kurşun bileşikleri takip geçmeden önce sitotoksisite değerlendirmek için yararlı bir modeldir. İnsan nöral kök hücreleri (NSC) hattında hücre büyümesini etkileyen bileşikleri belirlemek için bir strateji tanımlıyoruz. Strateji, hücre numarasını değerlendirmek için iki tamamlayıcı tahlil kullanır. Bir tsay 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) hücre numarası için bir proxy olarak formazan azaltılması ile çalışır ve diğer doğrudan tdTomato ifade NSCs sayar. İki tahlil tek bir deneyde aynı anda yapılabilir ve emek yoğun, hızlı ve ucuz değildir. Bu gösteride açıklanan strateji 96-iyi plaka formatında toksisite için bir keşif birincil ekranda 57 bileşikler test etti. Üç isabet birincil ekran olarak aynı testi set-up kullanarak altı noktalı doz yanıtı daha karakterize edildi. Toksisite için mükemmel doğrulama sağlamanın yanı sıra, iki tahlil sonuçlarının karşılaştırılması hücre büyümesinin diğer yönlerini etkileyen bileşiklerin belirlenmesinde etkili olabilir.
Introduction
Terapötik potansiyeli olan bir kimyasal bileşik için belirlenmesi gereken en önemli özelliklerinden biri hayvan hücrelerine toksisitesidir. Bu özellik bir ilaç daha kapsamlı bir çalışma için iyi bir aday olup olmadığını belirleyecektir. Çoğu durumda, minimal toksisite ile bileşikler aranır ama belirli hücre türlerini öldürmek için kapasiteye sahip bir bileşik ilgi olduğu durumlar vardır, örneğin, anti-tümörijenik ilaçlar. Tüm hayvanlar sistemik toksisiteyi belirlemek için en iyi model sistemler olmasına rağmen, maliyet ve işçilik dahil birkaç bileşikler den fazla test edilmesi gerektiğinde engelleyicidir. Bu tür memeli hücre kültürü genellikle en verimli alternatif olarak kullanılır1,2. Küçük ve orta ölçekli ilaç ekranları, hücre kültüründe toksisitenin değerlendirilebileceği önemli bir yöntemdir. Bu ekranlar, tek tek sinyal yollarını hedefleyen açıklamalı kitaplıkları sorgulamak için kullanılabilir. Böyle bir ekranın genel biçimi başlangıçta tek bir dozda kütüphanedeki tüm bileşikleri test etmektir (genellikle 10 μM) bir keşif birincil toksisite ekranında, ve sonra tam toksisite karakterize etmek için derinlemesine bir ikincil doz yanıt ekranı gerçekleştirmek birincil ekrandan isabet profili. Bu stratejiyi uygulamak için yöntemler burada açıklanacaktır ve toksik bileşikleri tanımlamak ve karakterize etmek için hızlı, verimli ve ucuz bir yol sağlar.
Memeli hücrelerinde küçük bileşiklerin ve nanomateryalin sitotoksisitesini değerlendirmek için birden fazla yöntem geliştirilmiştir3,4. Bazı malzemelerin yanıltıcı sonuçlar sağlayan tahkikat ile etkileşime girebileceği unutulmamalıdır ve bu tür etkileşimler toksisite ekranlarından isabet karakterize ederken test edilmelidir4. Sitotoksisite tahlilleri trypan mavi dışlamaiçerir 5, laktat dehidrogenaz (LDH) serbest tahlil6, Alamar mavi tahlil7, kalsin asetoksimtil ester (AM)8, ve ATP tahlil9. Tüm bu tahliller hücre numarası için bir proxy olarak hizmet verebilir hücre metabolizmasının çeşitli yönlerini ölçmek. Tüm faydalar sunarken, tetrazolium tuz bazlı tahliller 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromür (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-karboksiyanilid iç tuz (XTT)-1, ve 4-4-4-4-4-4-[ İyodofenil]-2-[4-nitrofenil]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzen disülfür (WST-1)10,11 düşük maliyetle iyi doğruluk ve kullanım kolaylığı sağlar. Bu gösteride kullanılacak olan MTT, mitokondriyal redüktaz ile çözünmez formazan'a indirgenir ve bu dönüşüm oranı hücre sayısı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bu titrek rutin olarak hem küçük ölçekte hem de 2.000 bileşiğin12'yekadar olduğu tarama kütüphanelerinde kullanılmaktadır. Hücrelerin etiketli bir işaretçi tarafından doğrudan sayma hücresel sayıyı değerlendirmek için başka bir yöntem sunar ve MTT tsay aksine hücresel büyüme dinamikleri hakkında ek bilgi sağlayabilir. Birkaç kamuya açık algoritmalar otomatik hücre sayısı analizleri gerçekleştirmek için kullanılabilir ve görüntüleme okuyucuları için yazılım paketlerinin bir parçası olan özel algoritmalar da vardır13,14. Bu yöntem açıklamasında, genetik olarak tdTomato15'i ifade etmek için düzenlenmiş bir insan nöral kök hücresi (NSC) hattı, MTT tahlilleri ile otomatik hücre sayımı arasındaki hücresel canlılık sonuçlarını karşılaştırmak için bir test hattı görevi göreceksiniz. 57 test bileşiğinin toksisitesini değerlendiren bir ekranda test edin. Bu stratejinin birincil amacı toksik bileşikleri belirlemek ve karakterize etmek olmasına rağmen, potansiyel olarak büyüme inhibitörü ve büyüme arttırıcı bileşikleri belirleme nin ek yararına sahiptir ve böylece ilaçların tanımlanması için etkili bir yöntem sağlar hücresel büyümeyi modüle edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NSC kültürü
NOT: Bir insan NSC satırının manipülasyonu aşağıda açıklanacaktır, ancak bu protokol için herhangi bir hücre satırı kullanılabilir. Tüm hücre kültürü çalışmaları biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.
- Kat 96-iyi plaka ile bodrum membran / ekstrasellüler matris (ECM).
- NSC'nin buz üzerinde bağlanmasını kolaylaştıracak Olan ECM(Malzeme Tablosu)ve eritme aliquot'u. Uygun konsantrasyona seyreltin ECM (genellikle 1:100) 10 mL taban orta(Malzeme Tablosu)ve 96-iyi plaka 60 iç kuyuların her biri için kuyu başına 50 μL ekleyin(Şekil 1). Kenar etkisi16neden olabilir eserleri önlemek için sadece iç 60 kuyukullanın.
- Plaka oda sıcaklığında veya hücre kültürü kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO2)en az 30 dakika oturun.
- Ayrıştırık ve plaka nöral kök hücreleri.
NOT: Bu yöntemde kullanılacak hücreler bir T75 şişesinde en az %80 biraraya kadar yetiştirilmelidir.- Baz orta, B27, esansiyel olmayan amino asitler, 2 mM glutamin ve 10 ng/mL temel fibroblast büyüme faktöründen (FGFb veya FGF2) oluşan NSC ortamında 37 °C ve %5 CO2'de hücre kültürü kuvözdeki T75 şişedeki kültür hücreleri.
- %80 birleştiğinde hücreleri kuvözden çıkarın ve NSC ortamını aspire edin. Uygun miktarda hücre dissosilasyon reaktifi ekleyin (T75 şişesi için 3 mL; Malzeme Tablosu) ve kuvözde 5 dakika kuluçka.
- Kuluçkadan sonra, tüm hücrelerin kopmasını sağlamak için T75 şişesine 7 mL NSC ortamı ve pipet ekleyin. Ayrıştırılmış hücre çözeltisini 15 mL'lik bir tüpe ve santrifüje 200 x g'de 5 dk aktarın.
- Santrifüjden sonra, tüpten süpernatant çıkarın ve NSC orta ve sayım hücrelerinin 10 mL hücreleri resuspend.
- NSC orta ile 200.000 hücre/mL'ye hücrelerin rejust konsantrasyonu. Hücreler tamamen kuyulara homojen kaplama için resuspended olduğundan emin olun.
- Bölüm 1.1'de açıklandığı gibi kaplanmış üç 96 kuyulu üç iç kuyudaki hücre karışımının (20.000 hücre) 100°L plakası. 8 kanallı çok kanallı pipettorun sekiz yuvasından altısını, sütun lar arası hücreleri kapamak için kullanın.
- En dıştaki kuyulardan olası buharlaşmayı en aza indirmek için hücresiz tüm kuyulara 100°L baz orta veya NSC ortamı ekleyin.
- Hücre kültürü mikroskobu altında, hücrelerin beklenen yoğunlukta tohumlu olduğunu doğrulamak için üç 96 kuyulu plakanın her birinde en az 10 kuyuyu görsel olarak inceleyin. Hücreler çok seyrek veya yoğun bir yoğunlukta kaplanmış olup olmadığını titret ile devam etmeyin.
2. Bileşiklerile hücreleri tedavi
NOT: Bu gösteride test edilen ev yapımı kütüphane, kanatsız/entegre (Wnt), retinoik asit, dönüşüm faktörü-beta (TGF-β) ve sonik kirpi sinyal yollarının yanı sıra çeşitli tirozin kinazlarını modüle eden bileşikler içerir.
-
Toksisite/hücre numarası için keşif birincil ekranı
- Aliquot 50−100 mL kadar 57 test bileşikleri(Ek Tablo 1) 10 mM konsantrasyonda % 100 dimetil sülfoksit (DMSO) iç 60 kuyuiçine U dipli, V dipli veya yuvarlak dipli 96-iyi plaka üç DMSO kuyusu ile (bkz. Plaka haritası için Şekil 1). Bu dondurulmuş ve birkaç kez çözülmüş olabilir bileşik 25 μL ile ana bileşik plaka olarak hizmet edecektir.
NOT: Düz dipli plakalar, bir tezgah üstü pipettor ile küçük hacimli bileşiklerin aspire edilmesi daha zor olacağından kullanılmamalıdır. - Bölüm 1'de açıklandığı gibi bölündükten sonra hücre kültürü plakalarını 16-24 h'den çıkarın ve sekiz çok kuyulu yuvadan sadece altısını kullanarak 8 kanallı çok kuyulu pipettor ile NSC orta sütun-by-kolon aspire edin. Üç çoğaltma plakasının her birinde hücrelere 95 μL taze NSC ortamı ekleyin ve aşağıdaki adım 2.1.4 tamamlanana kadar plakaları kuvöze geri yerleştirin.
- Boş u dipli, V dipli veya yuvarlak dipli 96 kuyulu ve 8 kanallı çok kuyulu pipettorlu iç 60 kuyunun her birine 49 μL NSC orta ekleyin. Ana bileşik plakayı çıkarın ve ana plakadan iç 60 kuyunun her birinde 49 μL NSC ortamına kadar pipet 1 μL biliğe bir tezgah üstü pipet veya eşdeğer alet kullanın.
- Tezgah üstü pipettor ile seyreltilmiş bileşik 3x karıştırın.
- NSC'nin üç adet 96 kuyuluk plakasını kuvözden çıkarın, pipet 15°L'lik her seyreltilmiş bileşiğin 15'ini tezgah üstü pipettorile çıkarın ve üç plakanın her birine 5 μL'lik bir bileşik aliquot dağıtın.
NOT: 2.1.3 adımdaki ilk 1:50 seyreltme ile birlikte hücrelere bileşik 1:20 seyreltilmesi, NSC'lerde bileşiklerin son konsantrasyonunun %0,1 DMSO konsantrasyonu ve son konsantrasyonu ile 10 μM olacak şekilde 1:1000 seyreltme sağlar. DMSO kontrolleri için konsantrasyon %0.1 olacaktır. - 72 saat bileşik hücreleri inkübte ve sitotoksisite tahlilleri ile devam edin. Daha kısa aralıklarla kullanılabilir ancak 72 saatlik kuluçka süresi test edilen bileşiklerin potansiyel sitotoksik etkilerini en üst düzeye çıkarmalıdır.
- Aliquot 50−100 mL kadar 57 test bileşikleri(Ek Tablo 1) 10 mM konsantrasyonda % 100 dimetil sülfoksit (DMSO) iç 60 kuyuiçine U dipli, V dipli veya yuvarlak dipli 96-iyi plaka üç DMSO kuyusu ile (bkz. Plaka haritası için Şekil 1). Bu dondurulmuş ve birkaç kez çözülmüş olabilir bileşik 25 μL ile ana bileşik plaka olarak hizmet edecektir.
-
Doz yanıtı tonu
NOT: Doz yanıtı için kullanılan 96-iyi için kurulum Şekil 2'degösterilmiştir.- Altı DMSO kontrol çoğaltmaları ve 10 μM yüksek doz ile başlayan altı dozda iki kat seri seyreltme ler üç farklı bileşiklerin triplicates test için sütun 2 kullanın.
- DMSO'daki 4 μL'lik DMSO veya test bileşiği1,5 mL mikrosentrifuge tüpte 196 μL NSC ortamına seyreltin. B2-G2'den kuyusütununa 25 μL DMSO ve B3-B11'den gelen üç test bileşiği yle B3-B11'den gelen test bileşiklerinin 50 μL'sini b3-B5, B6-B8 ve B9-B11 sıralarında üç test bileşikleri ekleyin.
- Pipet 25 μL NSC orta 96-iyi plaka iç kısmında kalan boş sütunlar için. Çok kanallı pipettor ile B3-B11 kuyularından 25 μL'lik bileşiğin çıkarılmasını, C3-C11 kuyularına ekleyin ve en az beş kez karıştırın. Bileşiklerin her biri için altı doz toplam için iki kat seyreltme ler triplicates oluşturmak için kalan satırlar için işlemi tekrarlayın.
- Bölüm 2.1'deki birincil ekranda açıklandığı gibi doz yanıtı için NSC'ler oluşturun. Doz yanıtı için bileşikler eklenir ve tam olarak adımlar 2.1.5 ve 2.1.6 açıklandığı gibi hücrelerüzerinde inkübe.
NOT: Doz yanıtı tayininin üç biyolojik kopyalanması, ayrı günlerde farklı pasajlarda NSC'ler üzerindeki tayini tekrarlayarak gerçekleştirilir.
3. Plaka okuyucudaki görüntüleme hücreleri
- Hücreler ayrılan süre için bileşiklerle kuluçkaya yattıktan sonra, bir plaka okuyucuüzerindeki görüntü hücreleri her kuyubaşına işlem öncesi hücre sayısını belirler.
NOT: Görüntüleme hücreleri için talimatlar okuyucuya özgüdir ancak genellikle benzer bir strateji izler. Aşağıdaki yol tarifleri bu gösterimde kullanılan okuyucu için geçerlidir (Malzeme Tablosu). - Tabağı kuvözden çıkarın ve plaka okuyucusunun içine yerleştirin. Çalışma için protokol ve deneme dosyaları ayarlamak için görüntüleyici yazılımını açın. Task Manager'da Imager Manuel Modu'na gidin ve şimdi Yakala'yı tıklatın....
- Damar tipi olarak 96-iyi plaka seçin, büyütme için 10x seçin, ve kırmızı floresan protein (RFP) 531 ve 593 görüntüleme tdTomato için. Bir kuyu seçin, ardından görüntüyü odaklamak için Otomatik Netleme'yi tıklatın ve uygun pozlama süresi için Otomatik Pozlama'yı tıklatın. Gerekirse odaklama ve pozlamayı manuel olarak ayarlayın.
- Doğru netleme ve pozlama elde edildikten sonra, resmi yakalamak için kamera simgesine tıklayın. Ardından, protokolü oluşturmaya devam etmek için resmin üstündeki PROCESS/ANALZYE'yi tıklatın ve ANALYSIS sekmesini seçin.
- Görüntünün sağındaki ANALIZ ADIMI EKLE'de Hücresel Analiz'i tıklatın ve START'ı tıklatın. Görüntü, her bir hücreyi göstermek için vurgulanan hücreleri gösterir. Floresan eşiğine veya hücre boyutuna göre hücreleri daha iyi seçmek için parametreleri değiştirmek için Seçenekler seçimi tıklanabilir. Görüntüleyici hücreleri düzgün bir şekilde sayıyorsa, ekranın altındaki ADD STEP'i tıklatın.
- Denemeyle birlikte bir pencere açacak olan görüntü kümesinden deneme oluşturmakiçin ekranın üst kısmındaki simgeyi tıklatın. Açtıktan sonra Protokol sekmesialtında Yordam'ı tıklatın ve Oku'yuaçan yeni pencerede , ardından yeni pencerede hücreleri içeren yalnızca 60 kuyuyu seçmek için tam plakayı tıklatın (B2... G11). Değişiklikleri kaydetmek için Tamam'ı tıklatın ve ardından Yordam penceresinde Tamam'ı tıklatın.
- Plaka artık bu protokol tarafından görüntülenebilir ve deneysel dosya kaydedilebilir. Plakayı çalıştırmak için oynat simgesini tıklatın. İlk plaka görüntülendikten sonra, diğer iki plakayı görüntüleyin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, hücre sayısı verilerini analiz için bir elektronik tabloya indirin. 10x büyütme tüm görüntüleri alın.
4. Terminal MTT sitotoksisite tsalimi
NOT: TDTomato görüntülemeişlemini tamamladıktan sonra iki saat içinde MTT tgelincetesini başlatın.
- 25 mg MTT tartarak ve 5 mL NSC ortamda yeniden suyararak 5 mg/mL MTT stok çözeltisi yapın. Girdap çözeltisi birkaç dakika sürebilir MTT, görünür çökeltiler kadar.
- Hücre kültür plakalarını kuvözden çıkarın ve hücre kültürü ortamını aspire edin. Hücre kültürü ortamında MTT 1:10 seyreltin ve hücrelerin her kuyuya 100 μL MTT ekleyin.
- 37 °C'de 2 saat boyunca kuluçka yada hücreler. Morumsu bir çökelti kuyudaki hücre sayısı ile orantılı olarak kabaca görülmelidir. MTT çözeltisini plakalardan aspire edin veya çözeltiyi plakadan çıkarmak için plakayı hızlıca ters çevirin.
- Her kuyuya %100 DMSO'nun 50 000'ini ekleyin ve 400 rpm'de 10 dakika oda sıcaklığında plakaları sallayın. Her kuyunun emiciliğini bir plaka okuyucusunda 595 nm'de okuyun ve verileri analiz için bir elektronik tabloya aktarın.
5. Veri analizi
- Uygun yazılım (ticari elektronik tablo, R) ile tdTomato hücre sayıları ve absorbansları bir analiz gerçekleştirin. Normalleştirme amacıyla her bir plaka üzerinde üç DMSO çoğaltmak emicilik veya hücre sayısı için ortalamaları hesaplamak, sonra bu ortalama ile plaka üzerinde her kuyu için hücre sayıları veya emiciler için değeri bölmek ve bir yüzde dönüştürmek. Bu, her plaka için DMSO kontrolüne göre normalleştirilmiş hücre sayımı veya emicilik verir.
- Üç plaka üzerindeki çoğaltma kuyuları için ortalama normalleştirilmiş sayımı veya emiciliği ve standart sapmayı hesaplayın.
NOT: Bu noktada normalleştirilmiş dört farklı değer kümesi olmalıdır: her plaka için bir tane ve üç çoğaltma plakası için bir ortalama. - Konservatif olun ve bir bileşiği toksik olarak sınıflandırmak için üç çoğaltma plakası arasında ortalama %25 veya altında normalleştirilmiş bir değer kullanın. Ayrıca, bileşik başına sadece tek bir tedavi her plaka üzerinde yapılır çünkü, toksik olarak her üç çoğaltma plakaları bu eşiğin altına düşen sadece etiket bileşikleri. Bu analizin toksisiteyi görsel olarak doğrulamak için toksik olarak filtrelediği tüm bileşiklerin floresan görüntülerini inceleyin.
NOT: Büyüme önleyici veya büyüme arttırıcı etkiye sahip bileşiklerin tanımlanması, her plakada çoğalma olmaması nedeniyle bu tür bir keşif tetkikinde değerlendirilmek daha zordur. Ancak, aşağıdaki ya yavaşlatabilir veya hücresel büyümeyi artırmak bileşikleri belirlemek için hızlı bir yoldur. - Her plakadaki üç çoğaltma DMSO denetimi için standart sapmayı hesaplayın ve ardından DMSO denetiminin üzerinde veya altında ortalama değerlere sahip bileşikler için filtre uygulayın. Üç plakanın her birinde bu filtreden çıkan bileşikler daha fazla araştırma yapılmasını gerektirebilir.
- Birincil toksisite ekranı olarak doz yanıtı için aynı analiz stratejisini kullanın. Her biyolojik çoğaltma için DMSO kontrollerinin ortalamalarını hesaplayın ve her bileşik/doz kombinasyonu için yüzde canlı hücreleri veya yüzde emicilikleri normalleştirmek için bu değerleri kullanın. Üç biyolojik çoğaltma için tüm bileşik/doz kombinasyonları için ortalamaların ve standart hatahesaplamak.
- Konsantrasyonu günlük değerine dönüştürün, konsantrasyon kütüğü için normalleştirilmiş canlılık için bir doz yanıt eğrisi oluşturun ve doğrusal olmayan bir regresyon analizi ile eğriyi sığdırın (analiz R veya çeşitli ticari istatistiksel paketleri). Ölümcül doz hesaplamak 50 (veya teknik olarak bu durumda uygun doz 50) veya bu eğrinin denkleminden% 50 toksisite ile sonuçlanan bileşik konsantrasyonu. Birçok yazılım paketi bu rakamı otomatik olarak hesaplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Otomatik hücre sayısı verileri DMSO kontrolüne normalleştirildiğinde %25'ten daha az canlılığa sahip on bir bileşik tespit ederken, MTT verileri bu bileşikleri artı iki ek bileşikleri tanımlamıştır(Tablo 1 ve Tablo 2, gölgeli kırmızı). Sadece MTT testinde toksik olduğu tespit edilen iki bileşik (F3 ve G10 kuyuları) sırasıyla %31 ve %39'a sahipti, kontrol olarak tdTomato pozitif hücrelerin sayısı ve sıra sırasına göre bu kütüphanede toksik olduğu düşünülenlerden sonraki en toksik iki bileşik vardı. Bu iki kuyunun standart sapma değerleri, üç plaka arasında ortalamaları çarpıtan bir aykırılık olduğunu göstermezdi ve üç çoğaltma plakasının her birinin sayıları incelendiğinde, herhangi bir kuyudaki %25 eşiğin altına düşmedi. plakalar (veri gösterilmez). TdTomato floresanının temsili görüntüleri Şekil 3'tekiçeşitli kuyulardan gösterilmiştir. MTT ve hücre sayısı arasındaki toksisite için ayrık iki kuyunun görüntülerinin incelenmesi, F3(Şekil 3B) ve G10(Şekil 3C)bileşiklerinin her ikisinin de toksik olduğunu ortaya koymuştur. iyi G10 (veri gösterilmez) birkaç artık canlı hücre vardı. Bu durumda MTT tsay bazen görüntüleyicihücre sayma algoritması yanlışlıkla ölü / ölmekte olan hücreleri sayar gibi sitotoksisite için puan başardı görünür.
MTT tsay toksisiteyi belirlemek için tasarlanmıştır, ancak bir kütüphane hücre büyümesini geliştiren ve engelleyen bileşikler içerebileceğinden, analizin hem potansiyel büyüme inhibitörünün hem de proliferatif etkilerinin ne kadar iyi ölçüleceğini değerlendirmek bilgilendirici olacaktır. test edilmiş bileşikler. Bunu yapmak için, bileşiklerin normalleştirilmiş ortalama emicilikleri veya hücre sayıları %25'ten fazla ve kontrol altındaki iki standart sapmanın altında üç çoğaltma plakasının her birinde (gölgeli) ikiden az ise büyüme inhibitörü olarak sınıflandırıldığı bir filtre kullanılmıştır ( Tablo 1 ve Tablo 2'desarı ). Hücre sayısı tahlil için on bir bileşikler bu kriteri bir araya geldi ve sadece iki MTT tahlil için sadece bir (E10) iki tahlil arasında örtüşen hücre sayısı tahlil için onbir iki daha önce MTT tahlil (F3) tarafından toksik olduğu belirtilen olanlar olmasına rağmen , G10).
Normalleştirilmiş araçları, üç çoğaltma plakasının her birinde kontrol araçlarının üzerinde iki standart sapma olan bileşikler büyüme arttırıcı olarak sınıflandırılmıştır (Tablo 1 ve Tablo 2'degölgeli yeşil). Sadece bir bileşik her tahlil için bu kriter uygun ve bileşik tahliller arasında örtüşmedi. MTT ve hücre sayısı tahlilleri arasında tutarsızlıkları olan kuyuların görüntülerinin daha ileri incelenmesi, bazı durumlarda MTT'nin tdTomato tahlillerine göre hücre sayısını fazla büyüttüğü kuyuların hücrelerin daha büyük olduğunu gösterdiğini göstermiştir (Şekil 3C) , MTT'nin tdTomato'ya göre hücre sayısını küçümsediği kuyular ise hücrelerin daha küçük olduğu ortaya çıkmıştır (Şekil 3D). Özetle, tdTomato tsay toksik olarak on bir bileşikler, büyüme inhibitörü olarak on bir ve bir büyüme arttırıcı olarak otuz dört hücre büyümesi üzerinde belirgin bir etkiye sahip olarak sınıflandırılır(Tablo 1). MTT tetki, on üç bileşiği toksik, ikisi büyüme inhibitörü ve biri de hücre büyümesi üzerinde belirgin bir etkiye sahip olmayan kırk bir ile büyümeyi arttırıcı olarak sınıflandırılmıştır(Tablo 2).
Toksik olduğu tespit edilen bileşiklerin üçünde altı noktalı doz yanıtı araştırması yapıldı. Bu üç bileşik STAT3 inhibitörleri WP1066 (B5) ve stattik (E4) ve epidermal büyüme faktörü reseptör inhibitörü tyrphostin 9 (E11) idi. Dozlar maksimum 10 μM konsantrasyondan başlayıp en az 312,5 nM'ye giden iki kat seyreltmeydi. Bu bileşiklerden biri (WP1066) için hem hücre sayısı hem de MTT tahlilleri için canlı hücrelerin normalleştirilmiş yüzdesi karşı konsantrasyon günlüğünün grafiği Şekil 4'tegösterilmiştir. Eğri nispeten en düşük dört konsantrasyonları için hiçbir toksisite ile düz, 5 μM dozda hızla düşer ve 10 μM neredeyse tam toksisiteye düşer. Öldürücü doz 50 (LD50)tdTomato tsay için 4.4 μM ve MTT tsay için 6.0 μM olarak hesaplandı. Diğer iki bileşiğin tdTomato ve MTT LD50 değerleri sırasıyla 3.4 μM ve 4.7 μM, statik için 0.8 μM ve 1.6 μM idi.
Şekil 1 : Birincil toksisite ekranında kullanılan ana bileşik plaka için plaka haritası. Tüm dış kuyular gri renkle gölgelenir ve bu da hücresi zolmayan ortam içerdiğini gösterir. DMSO kontrolleri (%100) B2, D6 ve G11 kuyularında kalın olarak etiketlenir. Cmpd etiketli tüm kuyularda %100 DMSO'da 10 mM konsantrasyonda benzersiz test bileşikleri bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Doz yanıtı tsedesinde kullanılan bileşik plaka için plaka haritası. Tüm dış kuyular gri gölgeli olup, sadece hücresiz ortam içerdiğini gösterir. DMSO kontrolleri sütun 2'de yer aldı. Tüm bileşik/doz kombinasyonlarının triplicates gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : tdDomates floresan görüntüleri seçilen kuyuların 72 saat tedavi sonrası. (A) Iyi B2: DMSO kontrolü, (B) Peki F3: hücre sayısı verisi toksisite önerdi ama MTT verileri yaptı, (C) Peki E6: TDTomato sayısına göre MTT tarafından fazla hesaplanmış hücre sayısı, (D) İyi G6 MTT göre küçümsenen hücre sayısı tdDomates. Tüm görüntüler 10x büyütme de uyarma / emisyon için 531/593 nm dalga boyu ile bir RFP filtre kullanılarak alınmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : Iyi B5 bileşik için günlük konsantrasyonu karşı canlılık yüzdesi DMSO eğrisi. Eğriüzerindeki noktalar, altı dozda ortalama normalleştirilmiş canlı hücreleri temsil eder ± üç biyolojik çoğaltma için ortalama standart hata. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Üç çoğaltma plakası için dmso kontrolü yüzdesi normalleştirilmiş tdTomato hücre sayıları araçları ± standart sapma. Peki gölgeleme aşağıdaki gösterir: kırmızı, toksik bileşikler; sarı, potansiyel büyüme önleyici; yeşil, potansiyel büyüme arttırıcı. Hiçbir gölgeleme bileşiklerin hücre büyümesini etkilemediğini gösterir.
Tablo 2: Üç çoğaltma plakası için yüzde DMSO kontrolüne normalleştirilmiş MTT absorbans araçları ± standart sapma. Peki gölgeleme aşağıdaki gösterir: kırmızı, toksik bileşikler; sarı, potansiyel büyüme önleyici; yeşil, potansiyel büyüme arttırıcı. Hiçbir gölgeleme bileşiklerin hücre büyümesini etkilemediğini gösterir.
| Şey, | Bileşik | Notlar |
| B2 | DMSO | Negatif kontrol |
| C2 | Kamp | Protein kiazbir Bir aktivatör |
| D2 | FRACTALKINE | Kemokin |
| E2 | LDN212854 | Kemik morfogenetik protein (BMP) reseptör inhibitörü |
| F2 | AG370 | Trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü (PDGFR) kinaaz inhibitörü |
| G2 | DAPT | Gama-sekresaz inhibitörü; nöronal farklılaşma pozitif kontrol |
| B3 | AY9944 | 7-dehidrocholestrol redüktaz inhibitörü; kirpi yolu inhibitörü |
| C3 | STA-21 | Transkripsiyon 3 (STAT3) inhibitörü sinyal dönüştürücü ve aktivatör |
| D3 | GM-CSF | Granülkocyte-makrofaj koloni uyarıcı faktör; Sitokin |
| E3 | TNP470 | Metiyonin aminipeptidaz-2 inhibitörü |
| F3 | Biyo | Glikojen synthase kiaz-3 inhibitörü; WNT yol aktivatör |
| G3 | CNTF | Siliary nörotrofik faktör; nöropeptid |
| B4 | Sant | Düzeltilmiş reseptör antagonisti; kirpi yolu inhibitörü |
| C4 | AG825 | ERBB2 inhibitörü |
| D4 | M-CSF | Makrofaj koloni uyarıcı faktör; Sitokin |
| E4 | STATTIC | Transkripsiyon 3 (STAT3) inhibitörü sinyal dönüştürücü ve aktivatör |
| F4 | SC79 | AKT (protein kinaaz B) aktivatör |
| G4 | DMH1 | Kemik morfogenetik protein (BMP) reseptör inhibitörü |
| B5 | WP1066 | Transkripsiyon 3 (STAT3) inhibitörü sinyal dönüştürücü ve aktivatör |
| C5 | Insülin | |
| D5 | IL-3 | Interlökin-3; Sitokin |
| E5 | AG494 | Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) inhibitörü |
| F5 | LY294002 | Fosfoinosit 3-kiinaz inhibitörü |
| G5 | IGF2 | insülin büyüme faktörü-2 |
| B6 | Şahin | Yumuşamış agonist; kirpi yolu aktivatör |
| C6 | AG370 | Trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptör kiaz inhibitörü |
| D6 | DMSO | Negatif kontrol |
| E6 | EC23 | Retinoik asit reseptör agonist |
| F6 | TORIN2 | Rapamisin (MTOR) inhibitörü mekanistik hedef |
| G6 | Y27362 | Rho-ilişkili, bobin içeren protein kigaz (ROCK) inhibitörü |
| B7 | CELECOXCIB | Siklooksijenaz-2 (COX-2) inhibitörü |
| C7 | SB525334 | Transforming büyüme faktörü beta-reseptör (TGBFR) inhibitörü |
| D7 | DAPT | Gama-sekresaz inhibitörü; nöronal farklılaşma pozitif kontrol |
| E7 | CHIR99021 | Glikojen synthase kiaz-3 inhibitörü; WNT yol aktivatör |
| F7 | LDN 193189 | Kemik morfogenetik protein (BMP) reseptör inhibitörü |
| G7 | TARAZOTINE | Retinoik asit reseptör agonist |
| B8 | AM580 | Retinoik asit reseptör agonist |
| C8 | DHBP | Kalsiyum salınım inhibitörü |
| D8 | Jsk | Nitrik oksit donörü |
| E8 | DORSOMORPHIN | Kemik morfogenetik protein (BMP) reseptör inhibitörü; 5' adenozin monofosit aktive protein kinaz (AMPK) inhibitörü |
| F8 | İmATINIB | Tirozin kinaz inhibitörü |
| G8 | BMS 493 | ters retinoik asit reseptör agonist |
| B9 | SIKLOMAMİn | Düzeltilmiş reseptör antagonisti; kirpi yolu inhibitörü |
| C9 | SEMAGACESTAT | Gama-sekresaz inhibitörü |
| D9 | BOSUTINIB | Tirozin kinaz inhibitörü |
| E9 | PURMORFAMIn | Yumuşamış agonist; kirpi yolu aktivatör |
| F9 | JAG | Pürüzlü; Çentik reseptör agonist |
| G9 | SB431542 | Transforming büyüme faktörü beta-reseptör (TGBFR) inhibitörü |
| B10 | SC79 | AKT (protein kinaaz B) aktivatör |
| C10 | DANTROLENE | Ryanodin reseptör antagonist |
| D10 | TYRPHOSTIN46 | Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) inhibitörü |
| E10 | AM80 | Retinoik asit reseptör agonist |
| F10 | IFN-Y | interferon-gama; Sitokin |
| G10 | PQ401 | İnsülin benzeri büyüme faktörü reseptörü (IGF1R) inhibitörü |
| B11 | DAPT | Gama-sekresaz inhibitörü; nöronal farklılaşma pozitif kontrol |
| C11 | A2M | Ekstrasellüler glikoprotein; proteaz inhibitörü |
| D11 | AG490 | Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) inhibitörü |
| E11 E- | TYRPHOSTIN9 | Trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü (PDGFR) kinaaz inhibitörü |
| F11 | BMP-2 | Kemik morfogenetik protein-2 |
| G11 | DMSO | Negatif kontrol |
Ek Tablo 1: Birincil elek bileşiklerinin listesi. Peki konumu, adı ve birincil ekranda kullanılan bileşiklerin her biri üzerinde notlar sağlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalenin temel amacı, düşük ila orta verimli taramada hücre büyümesini etkileyen bileşikleri verimli ve ucuz bir şekilde tanımlayabilecek bir stratejiyi tanımlamaktı. Sonuçlara olan güveni artırmak ve sadece tek bir töz kullanılmışsa mevcut olmayacak ek bilgiler sunmak için hücre sayısını değerlendirmek için iki ortogonal teknik kullanılmıştır. Tahlillerden biri doğrudan tdTomato-pozitif hücreleri saymak için bir floresan hücre görüntüleyici kullanılan ve ikinci böylece hücre numarası10için bir proxy olarak hizmet formazans mtt cleave mitokondri iyi karakterize yeteneğine bağlı ydı. Bu gösteride toplam 57 test bileşiği değerlendirilmiş, ancak bu gösterinin MTT kanadı 2.000 kadar bileşim14'ekadar olan bir kütüphaneyi test etmek için kullanılmıştır. Ekranın sonuçları, iki tahlilin belirli sonuçlara daha fazla güvenle ulaşmada birbirini nasıl güçlendirebileceğine işaret etti ve iki tahtın normalde ek bilgi sağlayan tamamlayıcı olduğu senaryoları vurguladı. en az iki ayrı deneme yapılmasını gerektirir.
Protokoldeki en kritik adım, hücrelerin kapamadan hemen önce gerçekleşir. Hücre kültüründe metabolik koşullar çok uçucu olabilir, özellikle glutamin ve glikoz tüketimi durumunda, hücreler çok yüksek yoğunlukta17tohumlu ise,18. Bu koşullar altında hücre ölümü hücre kültürü koşullarına doğasında ve test edilen bileşiklerin toksisitesi ile ilgisi olmayan faktörlere bağlı olacaktır. Sonuç sitotoksik bileşikler için yanlış pozitif artış yanı sıra sonuçları çoğaltma da zorluk olacaktır18. Bu adımda başarı, kullanılan hücre hattının uygun hücre yoğunluğunu bilmek, kaplamadan önce hücre sayısının doğru belirlenmesini ve 96 kuyusunda ve kuyular boyunca homojen kaplama dağılımını sağlamak için hücrelerin tam olarak yeniden uzaklaştırılmasını gerektirir. -iyi plaka. Ayrıca, hücrelerin mikroskop altında bakarak kaplamadan sonra yaklaşık olarak doğru yoğunlukta 2-3 saat içinde mevcut olduğunu görsel olarak doğrulamak da önemlidir.
Tahliller kendilerini bildiğim kadarıyla, MTT tahlil için en kritik adım MTT hücre kültürü ortamda tamamen çözülmüş olmasını sağlamaktır. MTT'nin artık çökeltileri tek başlarına akut hücresel toksisiteye neden olabilir, bu nedenle MTT'yi güçlü girdaplarla tamamen eritmek önemlidir. Hücre sayma tsay için en kritik nokta görüntüleme tdTomato için doğru pozlama süresi kurmaktır. Çok kısa olan pozlama süreleri, yazılım tarafından sayılmayan gerçekten floresan hücrelerin inmelerine neden olabilir ve çok uzun olan pozlama süreleri, sinyali komşu hücreleri bir araya getirecek kadar güçlü hale getirebilir, böylece yazılım birden fazla hücreyi tek bir hücre olarak sayar onları çözmek mümkün değildir çünkü14. Görüntüleme okuyucularıyla birlikte gelen çoğu yazılım paketi, hangi hücrelerin sayıldığını gösteren bir önizleme adımına izin verir. Bu önizleme adımını birkaç pozlama kez çalıştırmak ve floresan hücreleri en doğru şekilde tanımlayan ı seçmek önemlidir.
Herhangi bir yöntem olduğu gibi bu tahliller için bazı sınırlamalar vardır. Daha yüksek iş elde etmek için, birincil toksisite testi daha yanlış pozitif ve yanlış negatifler pahasına gelebilir sadece tek bir tedavi / tek doz paradigma kullanır. Ayrıca, birkaç önceki çalışmalar mtt ya bir koloni oluşturan bir koloni oluşturan assaykullanırken hücre sayısı ile çok iyi ilişkili olduğunu göstermiştir rağmen 19 veya timidin birleşme asssay20, bazı bileşikler ile tedavi ya artırabilir ya da artırabilir mtt tahsin sonuçları artık hücre sayısı21ile ilişkili olduğu şekilde mitokondriyal aktiviteyi inhibe. Bu gösteriden elde edilen sonuçlar, MTT toksik bileşikleri belirlemede mükemmel olmakla birlikte, bu bileşiklerin mitokondriyal aktiviteyi bir hücre numarası ile daha az ilişkili olduğu şekilde. TdTomato sayma tsay bazı sınırlamalar da vardır. Bariz bir sınırlama bir hücre hattı stably bir floresan protein ifade olması gerekir. Genom manipülasyonundaki son gelişmeler bu tür çizgilerin geliştirilmesini çok daha kolay hale getirmiştir ancak bunları üretmek için gereken iş bazı laboratuvarların yeteneklerinin ötesinde olabilir. Teknik açıdan bakıldığında, görüntü analizi kullanan herhangi bir hücre sayma tahlil ile en büyük sorunlar bir undercount14sonuçlanan birlikte kümelenmiş hücreler arasında ayırt etmek için bu tahlillerin yetersizliği , bu nedenle, uygun kaplama olduğunu doğru sonuçlar için kritik öneme yöneliktir. Başka bir potansiyel sorun parlak floresan ölü veya ölmekte olan hücrelerin sayma olduğunu. Bu sorunu önlemek için bir yolu bu arka plan hücreleri kaldırmak için sayma önce PBS ile hücreleri yıkamaktır. Bu, canlı hücreler yıkama üzerine kopabileceğinden, hücre çizgilerini daha az iyi yapıştırmak için uygun olmayabilir. Bu soruna alternatif bir çözüm, sadece canlı, floresan hücrelerin sayılması için dar bir aralıkta hücre tanımlama parametrelerini özelleştirmek için birçok analiz programında doğasında bulunan esnekliği kullanmaktır.
Bu makalede açıklanan strateji verimli birkaç yüz bileşikler kadar ekran için güçlü bir yol sağlar. MTT tahsin okuma mitokondriyal aktivitenin fizyolojik sonucudur ve yanlış sonuçlar üretebilir hücre hattı veya bileşik özgü etkileri olabilir4,21. Floresan bir muhabir kullanarak bir hücre sayma taması ile birleştirerek, bu sınırlamalar büyük ölçüde azaltılabilir. Gösterildiği gibi, her iki tahlil sonuçları karşılaştırarak toksik bileşiklerin belirlenmesinde% 100'e yakın doğruluk neden olabilir. Bir önceki çalışmada bir HEK293T satır da stably tdTomato ifade göstermiştir, toksik bileşikler22bir kütüphane için MTT ve tdTomato arasında yüksek IC50 korelasyon olduğunu göstermiştir . Bu çalışma, benzer bir konkordans analizi yapmak için yeterli isabet bileşikleri üzerinde ikincil onaylar çalışmamış olsa da, test edilen üç bileşikler için hesaplanan LD50 değerleri benzerdi.
Toksisite ile ilgili sonuçları pekiştirme yeteneklerine ek olarak, test bileşiklerinin potansiyel büyüme önleyici ve proliferatif etkilerini ele alırken iki tahlil birbirini tamamlayabilir. Birkaç test bileşikleri için iki tahlil arasındaki veriler önemli ölçüde farklı. Bu bileşiklerin bazıları için tdTomato floresan görüntüleri incelendiğinde, tedavi ve kontrol arasında gözle görülür morfolojik değişiklikler vardı. Bu, iki tahlil arasındaki normalleştirilmiş değerlerdeki sapmanın MTT okumasını ve tdTomato hücre sayısını farklı etkileyen fizyolojik değişikliklere dayandığını göstermektedir. Bu tür verileri tek bir denemeyle elde edebilme yeteneği, bu stratejinin sağlamlığını büyük ölçüde artırarak daha genel olarak uygulanabilir hale getirir. Bu nedenle, sadece yüksek doğruluk ile toksik bileşikleri belirlemek için değil, daha kapsamlı karakterize edilebilir hücre büyümesi / fizyolojisi üzerinde daha ince etkileri olan bileşikler işaret kapasitesine sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NINDS Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , National Academies Press. Washington DC. (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
