Summary
新颖的免疫染色兼容组织清除技术,如溶剂清除器官的终极 3D 成像,允许狂犬病病毒脑感染及其复杂的细胞环境的 3D 可视化。厚厚的抗体标记脑组织切片在光学上透明,以增加成像深度,并通过共聚焦激光扫描显微镜实现 3D 分析。
Abstract
通过免疫标记对组织和器官的感染过程进行可视化是现代感染生物学的关键方法。观察和研究器官组织内病原体分布、病变和丰度的能力为疾病发展和进展提供了关键数据。使用传统的显微镜方法,免疫标签主要限于从石蜡嵌入或冷冻样品获得的薄部分。然而,这些薄截面的有限2D图像平面可能导致关于受感染器官复杂结构和感染细胞背景的关键信息丢失。现代多色、免疫染色兼容的组织清除技术现在提供了一种相对快速和廉价的方式来研究受病毒感染的器官组织的大容量 3D 图像堆栈。通过将组织暴露于有机溶剂中,它变得光学透明。这与样品的折射率相匹配,最终导致光散射的显著减少。因此,结合长距离自由工作距离目标,传统的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)可以以高分辨率成像高达1毫米的大组织部分。在这里,我们描述了一个协议,在组织清除后应用深层组织成像来可视化受感染大脑中的狂犬病病毒分布,以便研究病毒发病机制、传播、肌动和神经入侵等主题。
Introduction
传统的组织学技术主要依靠器官组织的薄部分,这本质上只能提供对复杂 3D 环境的 2D 见解。虽然原则上是可行的,但串行薄截面的 3D 重建需要苛刻的技术管道,以便对采集的图像1进行切片和后续的硅对齐。此外,在微缩切片后无缝重建 z 体积至关重要,因为机械和计算伪影可能由于非重叠图像平面、染色变化和物理物理造成的图像配准不理想而保留破坏组织,例如,微托姆刀片。相比之下,对完整厚组织样本进行纯光学切片允许获取重叠的图像平面(过采样),从而有助于 3D 重建。这反过来又对分析复杂细胞群(例如,周围胶质和免疫细胞的神经元网络)中的感染过程非常有益。然而,厚组织部分的固有障碍包括光散射和有限的抗体渗透到组织。近年来,开发和优化了各种技术,以克服这些问题2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13.基本上,目标组织通过处理水性2、3、4、5、6、7进行光学透明化 ,8,9或有机溶剂基10,11,12,13溶液。引入 3DISCO (溶剂清除器官的 3D 成像)11、12及其后续 uDISCO(溶剂清除器官的最终 3D 成像)13提供了一个相对快速、简单且廉价的工具,出色的清算能力。清除协议的主要成分是有机溶剂特-丁醇(TBA)、苯基醇(BA)、苯甲酸酯(BB)和二苯醚(DPE)。iDISCO(溶剂清除器官的免疫标记支持3D成像)14的开发和添加,这是一种兼容的免疫染色方案,与现有方法形成另一个优势,使抗原的深层组织标记得以实现以及免疫染色样本的长期储存。因此,iDISCO14和 uDISCO13的组合允许使用传统的 CLSM 在大组织部分(高达 1 mm)对抗体标记蛋白进行高分辨率成像。
在所有三个维度中保存器官的复杂结构对脑组织尤其重要。神经元构成一个非常异质的细胞亚群,其基于其神经质投影的3D形态高度多样化(由马斯兰15审查)。此外,大脑由多个隔间和子隔间组成,每个隔间和子隔间由不同的细胞亚群及其比例组成,包括胶质细胞和神经元(由冯·巴托尔德等人审查)。作为一种神经性病毒,狂犬病病毒(RABV,由Fooks等人17审查)主要感染神经元,利用他们的运输机械沿着轴向方向从感染的主要部位到达中枢神经系统(CNS)。此处描述的协议(图1A)允许在从受感染的脑组织获得的大型、连贯的图像堆栈中,对RABV和RABV感染的细胞进行免疫染色辅助检测和可视化。这样就可以对感染环境进行无偏见的 3D 高分辨率评估。它适用于各种物种的脑组织,可在固定后或长期储存在甲醛(PFA)中的样品后立即进行,并允许对染色和清除的样品进行数月的储存和再成像。
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Protocol
使用RABV感染,PFA固定存档脑材料。各自的动物实验研究由国家农业、食品安全和渔业办公室负责的动物护理、使用和道德委员会(LALFF M-V)进行评估,并获得许可。7221.3-2.1-002/11(小鼠)和7221.3-1-068/16(雪铁龙)。根据批准的指南进行动物实验中使用的一般护理和方法。
注意:本议定书使用各种有毒和/或有害物质,包括PFA、甲醇(MeOH)、过氧化氢(H2O2)、阿齐德钠(NaN3)、TBA、BA、BB和DPE。MeOH 和 TBA 高度易燃。通过佩戴适当的个人防护设备(实验室外套、手套和眼睛保护)并在烟罩中进行实验,避免接触。将废物分别收集在适当的容器中,并按照当地法规进行处理。狂犬病病毒被归类为生物安全级别(BSL)-2病原体,因此,一般可在BSL-2条件下处理。某些活动,包括可能产生气溶胶、处理高病毒浓度或使用新型莱沙病毒的程序,可能需要BSL-3分类。建议高危人员进行暴露前预防,包括动物看护员和实验室工作人员18、19。请参阅地方当局法规。
1. 脑组织的固定和切片
- 在磷酸盐缓冲盐水(PBS [pH 7.4])中将脑样本固定在适当的体积为 4% PFA 中,在 4 °C 下至少 48 小时(在 4°C 下,大约组织与固定比率为 1:10 [v/v])。
- 在PBS中清洗组织样本3x,每次清洗至少30分钟,并将其储存在0.02%NaN3/PBS中,直到使用。
- 使用振动膜将组织分割成 1 毫米厚的部分(刀片进给率:0.3±0.5 mm/s,振幅:1 mm,切片厚度:1,000 μm)。
- 要保持正确的切片顺序,将每个组织部分分别存储在多孔细胞培养板的井中。加入0.02%NaN3/PBS,将组织部分储存在4°C,直到使用。
2. 甲醇样品预处理
注:在室温下,以温和的振荡执行所有孵育步骤,如果没有其他指示,则执行所有孵育步骤。保护样品免受光线照射。样品预处理有助于提高抗体扩散和减少组织自荧光,分别暴露于MeOH和H2 O2,14。
- 在蒸馏水中制备 20% (v/v)、40%、60% 和 80% MeOH 解决方案。例如,对于 20% MeOH,在适当的可密封容器中加入 10 mL 的 100% MeOH 到 40 mL 蒸馏水,并通过反转进行混合。
- 将样品转移到大小合理的容器(例如,5 mL 反应管)。注意使用耐化学腐蚀的耐此协议中使用的试剂的材料。例如,请注意,虽然聚丙烯是合适的,但聚苯乙烯并不合适。
注:本协议中的体积规格指5 mL反应管。如果使用其他容器,则相应地调整体积。 - 以每粒MeOH溶液的浓度在4 mL中孵育样品,每个上升顺序为1小时。
- 在纯(100%)中孵育样品2倍,每次1小时甲醇。
- 将样品冷却至 4°C(例如,在实验室安全的冰箱中)。
- 例如,在纯(100%) 中稀释 30% H2O2库存溶液,制备漂白溶液(MeOH 中的 5% H2O2)我,并在4°C冷却。
- 从冷藏样品中取出 100% MeOH,并加入 4 mL 的预冷漂白溶液(MeOH 中的 5% H2O2)。在4°C下孵育过夜。
- 将漂白溶液交换4mL,为80%MeOH,孵育1小时。继续使用制备的MeOH溶液系列,每个顺序为1小时,直到样品在4 mL20%MeOH中孵育1小时。
- 用 4 mL 的 PBS 清洗样品 1x 1 小时。
3. 免疫染色
注:在室温下,以温和的振荡执行所有孵育步骤,如果没有其他指示,则执行所有孵育步骤。保护样品免受光线照射。为了防止微生物生长,在本节中的溶液中加入NaN3的最终浓度为0.02%。组织样本通过非离子洗涤剂Triton X-100和Tween 20的治疗进一步渗透。正常血清用于阻断非特异性抗体结合。甘氨酸和肝素被添加以减少免疫标签背景14。
- 在 4 mL 的 0.2% Triton X-100/PBS 中,将样品清洗 2 倍,每次 1 小时。
- 在37°C下渗透样品2天,4mL为0.2%Triton X-100/20%DMSO/0.3M甘氨酸/PBS。
- 在4mL的0.2%Triton X-100/10%DMSO/6%正常血清/PBS中,在37°C下孵育样品2天,从而阻断抗体的未特异性结合。
注:使用来自同一物种的正常血清,在二级抗体中升高,以达到理想的阻断结果。 - 在2 mL原发抗体溶液(3%正常血清/5%DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 与肝素] + 原发抗体/抗体)中孵育样品5天,在37°C下孵育。2.5天后刷新原抗体溶液。
- 对于PTwH,在蒸馏水中重组肝素钠盐,形成10mg/mL的库存溶液(在4°C下储存此溶液,无电)。将库存溶液加入 0.2% 补间 20/PBS,最终浓度为 10 μg/mL。
注:选择正确的抗体稀释可能需要优化。一般来说,标准的免疫性化学浓度是一个很好的起点。
- 对于PTwH,在蒸馏水中重组肝素钠盐,形成10mg/mL的库存溶液(在4°C下储存此溶液,无电)。将库存溶液加入 0.2% 补间 20/PBS,最终浓度为 10 μg/mL。
- 在 4 mTwH 的 4 mL 中清洗样品 1 天,在一天中至少更换 4x-5x 洗涤缓冲液,最后清洗过夜。
- 在2 mL的二级抗体溶液(3%正常血清/PTwH +二级抗体/抗体)中孵育样品5天,在37°C下孵育。2.5天后刷新二级抗体溶液。
- 在二级抗体溶液(即 2 mL 中的 4 μL)中,在 1:500 处稀释二级抗体/抗体。
- 如步骤 3.5 所述,将样品洗涤 1 天,让最终洗涤过夜。
4. 核染色
注:在室温下,以温和的振荡执行所有孵育步骤,如果没有其他指示,则执行所有孵育步骤。保护样品免受光线照射。如果不需要核染色,或者需要 TO-PRO-3 的激发波长/发射光谱来激发或检测另一种荧光,请跳过此步骤。
- 在 PTwH 中 1:1,000 稀释核酸染色 TO-PRO-3,并在 4 mL 的核染色溶液中孵育样品 5 小时。
- 如步骤 3.5 所述,将样品洗涤 1 天,让最终洗涤过夜。
注:在进行清理后,样品可储存在PBS4°C,直到光学清除。
5. 组织清理
注:在室温下,以温和的振荡执行所有孵育步骤,如果没有其他指示,则执行所有孵育步骤。保护样品免受光线照射。组织样品在一系列分级的TBA溶液中脱水。由于免疫染色需要水溶液,所有染色程序必须在组织清除之前完成。光间隙和折射率匹配是通过BA、BB和DPE的混合物进行处理实现的。清除溶液辅以DL-α-生育酚作为抗氧化剂13。
- 在蒸馏水中制备 30% (v/v)、50%、70%、80%、90% 和 96% 的 TBA 溶液。例如,对于 30% TBA,在适当的可密封容器中加入 15 mL 的 100% TBA 到 35 mL 蒸馏水,并通过反转进行混合。
注:TBA的熔点为25~26°C;因此,在室温下,它往往是固体的。为了制备TBA溶液,在孵化器或水浴中以37°C加热密封的瓶子。 - 用制备的TBA溶液系列每浓度4 mL脱水样品,每个上升顺序为2小时。让 96% 的 TBA 过夜。
- 进一步纯脱水样品 (100%)待定2小时。
- 准备清除解决方案 BABB-D15。
注: BABB-D15 是 BA 和 BB (BABB) 的组合,它们与 DPE 混合,比例为x:1,其中x在解决方案的名称中指定,在本例中为 15。- 对于 BABB,将单部分 BA 与两个部分 BB 混合。
- 以 15:1 的比例混合 BABB 和 DPE。
- 加入0.4伏尔加DL-+生育酚(维生素E)。
注:例如,对于 20 mL 的 BABB-D15,将 6.25 mL 的 BA 与 12.5 mL 的 BB 混合。加入1.25 mL的DPE,并补充0.08 mL的DL-α-生育酚。
- 在清除溶液中清除样品,直到它们光学透明 (2~6 小时)。
- 样品可储存在BABB-D15的4°C下,在安装和成像之前不受光线照射。
6. 样品安装
- 使用 3D 打印机,打印成像室和盖子(材料:共聚酯 [CPE],喷嘴:0.25 mm,层高度:0.06 mm,壁厚:0.88 毫米,壁数:4,填充:100%,无支撑结构;相应的 。STL 文件可在本协议的补充材料中找到)。
- 组装成像室 (图 2.
- 使用 RTV-1(单组分室温-硫化)硅橡胶在成像室上安装圆形盖玻片(直径:30 mm)。用水湿棉签去除多余的硅橡胶,并一夜固化。
- 使用 RTV-1 硅橡胶在盖子上安装圆形盖玻片(直径:22 mm)。用水湿棉签去除多余的硅橡胶,并一夜固化。
- 将样品放入成像室,加入少量 BABB-D15,然后插入盖子。使用皮下针(27 G x 3/4 英寸 [0.40 mm x 20 mm])将 BABB-D15 填充到入口。
- 用 RTV-1 硅橡胶插入进气口并密封成像室。在黑暗中过夜。
7. 成像和图像处理
- 通过选择相应的激光线来匹配所使用的荧光光道来设置图像采集。调整每个探测器的检测范围,以防止通道之间的信号重叠。
注: Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568 和 TO-PRO-3 的示范检测范围分别为 500*550 nm、590*620 nm 和 645*700 nm。 - 选择采集参数,定义 z 堆栈的上下边框,并获取图像堆栈。
注: 示例采集参数是像素大小为 60-90 nm、z 步长 0.5 μm、线平均 1、扫描速度为 400 Hz 和针孔大小为 1 Airy 单位的连续扫描。 - 使用适当的图像分析软件(例如斐济)处理图像堆栈,以生成 3D 投影或执行深入分析。
注: 由于获取的图像文件大小较大,通常需要使用工作站。- 在斐济打开采集或图像文件(文件|打开|选择文件)。
- 如果使用,例如 , 。LIF 文件,在"生物格式"对话框窗口中选择或取消选择所需的选项。使用超堆栈查看堆栈。除了这一点,不需要特定的选择或刻度。按"确定"。
- 如果文件包含多个图像堆栈,请选择要分析的图像堆栈,然后按"确定"进行确认。
- 通过将合并的图像拆分为单个通道(图像|颜色|通道工具,然后选择更多|拆分通道)。对于每个通道,选择漂白剂校正(图像|调整|漂白剂校正)并选择简单比率(背景强度:0.0)。
注:在某些情况下,例如,当信号没有线性衰减或信号整体太弱时,简单比率可能会失败。或者,尝试指数拟合或跳过漂白剂校正。 - 使用滑块调整每个通道的亮度和对比度(图像|调整|亮度|对比.
- 合并通道 (图像|颜色|合并通道),制作复合 (图像|颜色|通道工具,然后选择更多|制作复合),并将其转换为 RGB 格式 (图像|颜色|通道工具,然后选择更多|转换为 RGB。
- 如有必要,调整图像堆栈的大小以减少计算时间和文件大小(图像|调整|大小,两个选项都勾选加上双线性插值)。
- 生成 3D 投影(图像|堆栈|3D项目。选择最亮点作为投影方法,并设置切片间距以匹配获取图像堆栈的 z 步长大小。为获得最佳质量,将旋转角度增量设置为1并启用插值。根据需要修改总旋转、透明度阈值和不透明度。
- 如有必要,通过将 3D 投影转换回 8 位格式来重新调整对比度和亮度(图像|类型|8 位。使用相应的滑块(图像|调整|亮度|对比)并将映像堆栈重新转换为 RGB 格式,如步骤 7.3.4 中所述。
- 将 3D 投影另存为 。TIF 文件(图像文件格式)和 。AVI 文件(视频文件格式)。
- 在斐济打开采集或图像文件(文件|打开|选择文件)。
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Representative Results
iDISCO14和 uDISCO13结合高分辨率 CLSM,可深入了解脑组织 RABV 感染和周围细胞环境的时空分辨率和可塑性。
使用RABV磷蛋白(P)的免疫染色,在小鼠大脑的厚部分可以可视化受感染神经元细胞的复杂层(图3)。随后,可以重建采集图像堆栈的无缝 3D 投影(图 3A、B、右侧面板;动画图 1。在使用来自器官物质的初级抗体和二级抗体时,必须小心谨慎。在小鼠脑组织上使用抗小鼠IgG抗体导致血管系统明显染色(图3B,左面板)。由于图像堆栈的高分辨率,感染可以评估到单细胞水平(图4),从而可以断言,例如,在细胞内的抗原的丰度和分布(图4C).
除了小鼠脑组织外,该协议还可以应用于其他动物物种(如雪铁龙)的脑组织(图5;动画图 2。从受感染的雪铁龙大脑的不同隔间取出的科室显示,RABV感染程度不同(图5A-D)。
由于大脑包含许多不同的细胞亚群,因此这些群体之间的分化至关重要。使用针对细胞标记的抗体,可以评估受感染细胞和邻近细胞的细胞特性。例如,星形细胞可以通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达进行分化(图6A,C;动画图3),而神经酸盐可以专门染色微管相关蛋白2(MAP2)(图6B,D;动画图 4。同时,病毒蛋白,在这种情况下,RABV核蛋白(N),可以共染色,以评估受感染的细胞和突出的细胞亚群之间的关系。
图 1:协议的基本原则和工作流程。(A) 基于 Renier 等人14和 Pan 等人13的协议对工作流的图形表示。(B) 两个示范性雪铁龙脑切片,一个在之前(左面板),一个在用有机溶剂处理后(右面板)。清除使组织在光学上透明,从而可以由当时可读的文本观察。清除的大脑切片嵌入在 3D 打印成像室(右侧面板)中。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:3D 打印成像室的技术插图。(A) 成像室的爆炸视图图.点线突出显示必须使用 RTV-1 硅橡胶相互安装的部件。虚线表示腔室后续装配的说明。(B) 成像室的 CAD(计算机辅助设计)文件。相应的 。用于打印成像室的STL文件可在补充材料中找到。(C) 完全组装的成像室.请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:受RABV感染的小鼠脑组织的深层组织成像。( A和B) 老鼠感染了重组的硫化物街头病毒.RABV P 染色(绿色)显示受感染的神经元层,在清除的脑组织内具有大的、纠缠的中性粒体投影。核与TO-PRO-3(蓝色)反染。(B) 在小鼠组织上使用荧光状标记抗小鼠IgG二级抗体(红色)会导致血管系统有独特的标签。采集的图像堆栈的 3D 重建允许从不同视角(A和B,右侧面板)进行观察。比例尺 = 60 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:高分辨率图像采集可实现高达单单元级别的复杂评估。大脑是从一只受SAD L16感染的老鼠解剖的。(A) RABV P 染色(绿色)突出显示单个受感染的神经元。(B和C) 详细图像和投影表明,可以对抗原丰度、分布和定位进行深入分析。核与TO-PRO-3(蓝色)反染。刻度条 = 20 μm (A), 5 μm (C)请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:受RABV感染的雪铁龙脑组织的深层组织成像。雪铁龙感染了巷道RABV。(A+D)从大脑的指定区域取出切片,免疫染色为RABV P(绿色),并光学清除。预测表明,大脑不同部位的受感染细胞在数量和形态上有所不同。此外,它们还突出了该协议对小鼠衍生组织以外的组织的适用性。核与TO-PRO-3(蓝色)反染。比例尺 = 60 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:多色免疫荧光允许细胞标记物的球化。从感染猎犬街RABV的雪铁龙的脑组织切片被使用和共免疫染色为RABV N(红色)和(A和C)GFAP(绿色)或(B和D)MAP2(绿色)。 GFAP是星形细胞标记,而MAP2特别突出神经酸盐。核与TO-PRO-3(蓝色)反染。(C和D) 在底部,从合并投影中描述枚举细节视图的单切片提取。刻度条 = 15 μm (A和B) 10 μm (C和D)。请点击此处查看此图的较大版本。
动画图 1:来自受 RABV 感染的小鼠大脑的图像堆栈的 3D 重建和详细投影。投影是从图 3中描述的图像堆栈生成的。(A和C) 整个各自的 z 堆栈的动画。(B) 视频开头突出显示区域的 z 堆栈的一部分的 3D 重建的详细投影。(D) 视频开头突出显示区域的 z 堆栈部分的图解的详细投影。绿色 = RABV P;红色 = 鼠标 IgG;蓝色 = 原子核。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
动画图2:从受RABV感染的雪铁龙大脑获取的图像堆栈的3D重建。投影是从图 5中描述的图像堆栈生成的。(A+D)注释引用相同的图形,并描述切片取自的大脑的各自区域。绿色 = RABV P;蓝色 = 原子核。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
动画图3:对RABV感染的雪铁龙脑与星形细胞标记GFAP共染的3D重建的不同通道的逐步投影。投影是从图6A中描述的图像堆栈生成的。通道的逐渐添加从RABV N(红色)开始,之后跟随细胞核(蓝色),最后是GFAP(绿色),而减法首先去除RABV N,然后去除细胞核,并最终去除GFAP。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
动画图4:与神经元标记MAP2共染的RABV感染雪铁龙大脑3D重建的不同通道的渐进投影。投影是从图6B中描述的图像堆栈生成的。通道的逐渐添加从RABV N(红色)开始,之后跟随细胞核(蓝色),最后是MAP2(绿色),而减法首先去除RABV N,然后删除细胞核,并最终删除MAP2。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。
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Discussion
近年来组织清除技术的复苏和进一步发展2、3、4、5、6、7、89,10,11,12,13,14开辟了许多新的可能性,以获得器官组织的大容量图像堆栈。这提供了一个无与伦比的和强大的工具,以研究,在许多其他主题,病毒感染。随后对这些图像堆栈的 3D 重建支持对病毒感染、丰度和感染时间过程等进行复杂的断言。该协议描述了在溶剂清除脑组织中RABV感染的免疫标签辅助可视化。
在制备和获取免疫标记、溶剂清除组织的图像堆栈方面,有几个关键步骤。长期接触PFA可以掩盖表位,从而导致抗原性降低20,21,22。因此,将固定时间限制在必要的最小值并将样品转移到适当的溶液中非常重要(例如,PBS 补充了 0.02% NaN3用于长期存储)。然而,这里提供的所有代表性图像和投影都是从存档的大脑样本中获得的,其中一些样本已储存在PFA中数周,这突出表明该技术对接触过PFA的器官材料的适用性。长时间。人类脑样本13也出现了类似的结果。另一个关键步骤是抗体孵化,如果不是最关键的话。抗体浓度必须仔细选择。虽然在大多数情况下,标准 IHC 浓度是深层组织抗体标记的良好起点,但某些抗原可能需要进一步优化抗体浓度。该协议表明,RABV N和P都很容易被所使用的抗体检测到。虽然MeOH预处理通常改善免疫标记,但一些抗原与这种治疗不相容。对于那些,Renier和同事14提供了一个替代的无MeOH样品预处理。分析采集的图像堆栈需要足够的计算能力。由于每个堆栈的文件大小高达几千兆字节,因此需要功能强大的计算机来处理映像。后处理通常包括减法背景噪声和漂白剂校正,以补偿采集相关的漂白效果。在测量距离时,必须记住,作为副作用,组织在清除过程中正在收缩。
与其他显微镜平台相比,像光片荧光显微镜 (LSFM) 或双光子激光扫描显微镜 (2PLSM) 相比,CLSM 的工作距离最有限。因此,有必要将器官预切至1毫米的厚度进行成像。此外,CLSM 具有最慢的采集速度,因为它的成像分辨率很高。使用光片显微镜可以更快地成像大体积,达到全脑成像,同时牺牲图像分辨率。另一个限制是组织自荧光与波长下降的固有增加。这使得在405nm的激光线(包括Hoechst染料)下,使用荧光草和染料,不切实际,不可能。
关于其他组织清除技术,iDISCO14和 uDISCO13的混合结合了最积极的属性:它与免疫染色高度兼容,用途广泛,相对快速且价格低廉,具有出色的清除能力,使用标准共聚焦显微镜是可行的。此外,该协议并不限于脑组织的免疫染色和清除,但也可用于各种其他软组织和病原体,包括神经侵入性和非神经侵入性。最后,此处描述的协议代表了对RABV感染的脑组织的高分辨率3D成像的管道。受感染脑组织的3D重建可用于回答有关RABV疾病进展、发病机制和神经入侵的各种问题。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢托马斯·梅滕莱特和维雷纳·特·坎普批判性地阅读了手稿。这项工作得到了梅克伦堡西波美拉尼亚联邦卓越倡议和欧洲社会基金(ESF)格兰特·科因费克特(ESF/14-BM-A55-0002/16)的支持,以及弗里德里希-勒弗勒研究所(Ri-0372)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
References
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