Imagerie 3D haute résolution de l'infection par le virus de la rage dans un tissu cérébral éclairci par solvant

Luca Zaeck; Madlin Potratz; Conrad  M. Freuling; Thomas Müller; Stefan Finke

doi:10.3791/59402

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Article de méthode

Imagerie 3D haute résolution de l'infection par le virus de la rage dans un tissu cérébral éclairci par solvant

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DOI :

10.3791/59402

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30 avril 2019

Luca Zaeck¹ , Madlin Potratz¹ , Conrad M. Freuling¹ , Thomas Müller¹ , Stefan Finke¹

¹Institute of Molecular Virology and Cell Biology, Friedrich-Loeffler-Institut, Federal Research Institute for Animal Health

Dans cet article

Résumé

Les nouvelles techniques de compensation des tissus immunostaining-compatibles comme l'imagerie 3D ultime des organes éclaircis par solvant permettent la visualisation 3D de l'infection cérébrale du virus de la rage et de son environnement cellulaire complexe. D'épaisses tranches de tissu cérébral étiquetées par anticorps sont rendues optiquement transparentes afin d'augmenter la profondeur d'imagerie et de permettre l'analyse 3D par microscopie de balayage laser confocal.

Résumé

La visualisation des processus d'infection dans les tissus et les organes par immunolabeling est une méthode clé dans la biologie moderne d'infection. La capacité d'observer et d'étudier la distribution, le tropisme et l'abondance des agents pathogènes à l'intérieur des tissus d'organes fournit des données cruciales sur le développement et la progression de la maladie. À l'aide de méthodes de microscopie conventionnelles, l'immunolabeling est principalement limité aux sections minces obtenues à partir d'échantillons incrustés de paraffine ou congelés. Cependant, le plan d'image 2D limité de ces sections minces peut mener à la perte de l'information cruciale sur la structure complexe d'un organe infecté et le contexte cellulaire de l'infection. Les techniques modernes de compensation des tissus multicolores et immunostaining-compatibles offrent maintenant un moyen relativement rapide et peu coûteux d'étudier des piles d'images 3D à fort volume de tissus d'organes infectés par le virus. En exposant le tissu à des solvants organiques, il devient optiquement transparent. Cela correspond aux indices de réfraction de l'échantillon et conduit finalement à une réduction significative de la diffusion de la lumière. Ainsi, en combinaison avec de longs objectifs de distance de travail libre, de grandes sections de tissu jusqu'à 1 mm de taille peuvent être imaged par microscopie de balayage laser confocal e conthique conventionnelle (CLSM) à haute résolution. Ici, nous décrivons un protocole pour appliquer l'imagerie de tissu profond après dégagement de tissu pour visualiser la distribution de virus de rage dans les cerveaux infectés afin d'étudier des sujets comme la pathogénie de virus, la propagation, le tropisme, et la neuroinvasion.

Introduction

Les techniques d'histologie conventionnelles reposent principalement sur de fines sections de tissus d'organes, qui peuvent intrinsèquement fournir seulement des aperçus 2D dans un environnement 3D complexe. Bien que faisable en principe, la reconstruction 3D à partir de sections minces en série nécessite des pipelines techniques exigeants à la fois pour le découpage et l'alignement silico suivant des images acquises¹. En outre, la reconstruction transparente des z-volumes après le découpage de microtome est critique car les artefacts mécaniques et computationnels peuvent rester en raison de l'enregistrement d'image sous-optimal causé par des p....