Summary
Målet med denne protokollen er å detalj en velprøvd tilnærming for utarbeidelse av plasmonic nanopartikkel prøver og for å utføre enkelt partikkel spektroskopi på dem med differensial interferens kontrast (DIC) mikroskopi.
Abstract
Differensial interferens kontrast (DIC) mikroskopi er et kraftig tenkelig verktøy som er mest brukt for Imaging Mikroskala objekter ved hjelp av synlig rekkevidde lys. Formålet med denne protokollen er å detalj en velprøvd metode for å forberede plasmonic nanopartikkel prøver og utføre enkelt partikkel spektroskopi på dem med DIC mikroskopi. Flere viktige trinn må følges nøye for å utføre repeterbar spektroskopi eksperimenter. Først kan landemerker være etset inn i prøven underlaget, som hjelpemidler i å finne prøven overflaten og i å spore den regionen av interesse under eksperimenter. Deretter må underlaget være riktig rengjort for rusk og forurensninger som ellers kan hindre eller obskure undersøkelse av prøven. Når en prøve er skikkelig forberedt, må den optiske banen til mikroskopet justeres, ved hjelp av Kohler belysning. Med en standard Nomarski stil DIC mikroskop, rotasjon av prøven kan være nødvendig, spesielt når plasmonic nanopartikler utstillingen orientering-avhengige optiske egenskaper. Fordi DIC mikroskopi har to iboende ortogonale polarisering felt, avslører bølgelengde-avhengige DIC kontrast mønster orienteringen av Rod-formede plasmonic nanopartikler. Til slutt må datainnsamling og dataanalyser utføres nøye. Det er vanlig å representere DIC-baserte spektroskopi data som en kontrast verdi, men det er også mulig å presentere den som intensitet data. I denne demonstrasjonen av DIC for enkelt partikkel spektroskopi, er fokuset på sfærisk og stang-formet gull nanopartikler.
Introduction
Siden 1980-tallet har differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi i stor grad blitt sett på som en viktig tenkelig metode forbeholdt Mikroskala objekter innenfor biologisk vitenskap. Men under sin utvikling i 1950 og 1960, var det ment som en teknikk for Materials Science1. Med den nylige fremskritt i de materielle vitenskaper relatert til plasmonic nanopartikler, en økt interesse for karakterisering av materialer med optiske mikroskopi har funnet sted.
Mange optiske teknikker er sikkert tilgjengelig for nanomaterialebasert karakterisering (f. eks mørkt felt, brightfield, polarisert lys, fluorescens, etc.). Dark feltet er allment populær i nanopartikkel forskning, men det baserer seg utelukkende på innsamling av Scatter og gir begrenset informasjon om komplekse prøver2. Fluorescens kan være nyttig, men bare med prøver som luminesce eller som kan være riktig beiset. DIC mikroskopi har flere egenskaper som gjør det til et verdifullt verktøy for analyse av nanopartikler. De hyppigst uttalte fordelene med DIC i forhold til andre metoder og i forhold til plasmonic nanopartikler er: ingen prøve farging nødvendig, ingen Halo effekter, grunne dybdeskarphet, og høy lateral oppløsning3. DIC har flere styrker som er verdifulle for plasmonic nanopartikkel forskning. Først av alt, to iboende og ortogonale polarisering felt er til stede, og de kan måles samtidig for spektroskopi formål2. For det andre er det depolarisert signalet av nanopartikler ikke fanget i det endelige bildet2, som kan være en årsak til alvorlig bekymring i mørke felt spektroskopi målinger.
Hensikten med denne artikkelen er å gi en klar metodikk for å utnytte overført lys Nomarski DIC mikroskopi å utføre spektroskopi på plasmonic nanopartikler. Selv om DIC er en kraftig teknikk som kan brukes på svært varierte materialer, er det også en teknikk som krever stor dyktighet og forståelse for å drive det riktig når Imaging nanopartikler. Transmission-baserte Nomarski DIC mikroskopi har en kompleks lys bane1 som bare vil bli kort gjennomgått her. Den optiske toget til DIC vises i figur 1. Lyset overføres gjennom mikroskopet ved først å bli passert gjennom en polarisator og en bjelke-splitting Nomarski prisme før de blir fokusert av kondensatoren på prøven flyet. Etter å ha passert gjennom målet, møter lyset en bjelke-kombinere Nomarski prisme og en analysator før du avslutter til detektoren. De to polarisatorer og Nomarski prismer er avgjørende for dannelsen av DIC bildet og er ansvarlig for å produsere DIC to ortogonale polarisering felt1. For leseren interessert i å vite mer om arbeids prinsipper og optiske banen til Nomarski DIC mikroskop, eller forskjellene mellom Nomarski DIC og andre stiler av DIC, henvises det til andre velskrevet kontoer på disse emnene1, 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7i.
Det er like viktig å forstå grunnleggende natur plasmonic nanopartikler før du forsøker å utføre spektroskopi på dem, enten det er med Nomarski DIC, mørkt felt, eller andre mikroskopi teknikk. Innen plasmonics er nanopartikler definert som partikler med dimensjoner på skalaen på 10-100 NM8,9. Nanopartikler kan ta på mange former (f. eks, kuler, stenger, stjerner, manualer, etc.), og de fleste av deres viktige egenskaper oppstår fra interaksjoner med lys i ultrafiolett-synlig-nær infrarød rekkevidde av det elektromagnetiske spekteret. Begrepet "plasmonic" er ikke begrenset til nanopartikler10; men når du diskuterer nanopartikler, er det brukt i referanse til lokaliserte overflaten Plasmon resonans (LSPR). LSPR er et fenomen der ledning elektroner i en nanopartikkel svinge på grunn av en Coulombic interaksjon med elektromagnetisk stråling av en svært spesifikk og relativt smal frekvensbånd8. På de samme frekvensene viser plasmonic nanopartikler økt absorpsjon og spredning av lys, noe som gjør dem synlige med optiske mikroskopi. I mange tilfeller er det foretrukket å observere nanopartikler mens du plasserer bånd pass filtre før kondensatoren2, for å forbedre Imaging kontrast og for å eliminere lys som ikke klarer å indusere LSPR effekt. Bruk av filtre gjør det også mulig å utføre enkle partikkel spektroskopi eksperimenter.
LSPR-relatert optisk atferd er svært avhengig av størrelsen og formen på nanopartikler, og det kan undersøkes med mange optiske mikroskopi teknikker. Men for å dechiffrere orientering informasjon av plasmonic nanopartikler med en Anisotrop (dvs. ikke-sfærisk) form, er det nødvendig å utnytte polarisering av lysfeltet. Ved å forsiktig rotere polarisering feltet eller prøven underlaget i små intervaller, er det mulig å overvåke orientering-avhengige spektroskopiske egenskaper av individuelle nanopartikler. Rotasjon og polarisering kan også hjelpe til med å avgjøre om en Spectral funksjon skyldes en dipolar eller høyere orden pendling av nanopartikkel overflate elektroner. Men i tilfelle av isotropic (dvs. sfærisk) nanopartikler, er Spectral profilen i hovedsak uendret ved å rotere prøven under polarisert lys.
Når de vises gjennom et DIC-mikroskop (figur 2), har nanopartikler en luftig disk med en skygge støpt hvit og svart utseende mot en grå bakgrunn. Sfæriske nanopartikler vil beholde denne utseende under rotasjon og med endring av bånd pass filtre; partiklene vil imidlertid gradvis forsvinne fra visningen ettersom filter ens sentrale bølgelengde blir ytterligere adskilt fra sfæren eneste dipolar LSPR bølgelengde11. Utseendet av nanoroder kan endre ganske dramatisk som de er rotert2. Nanoroder har to LSPR-band med dipolar adferd, hvor plasseringen er basert på de fysiske dimensjonene til nanoroder. Når den langsgående aksen i en nanorod er orientert parallelt med en av de DIC polarisering feltene, vil luftig platen vises alle hvite eller alle svarte hvis sett med en båndpassfilter knyttet til at LSPR bølgelengde. Etter roterende prøven 90 °, vil det ta på motsatt farge. Alternativt, siden tverrgående aksen av en nanorod er vinkelrett på langsgående aksen, vil stangen ta på motsatt farge når du skifter mellom filtre som samsvarer med LSPR bølgelengder for de to aksene. Ved andre retninger og filterinnstillinger, vil nanoroder vises mer som kuler, og presenterer en rekke skygge-cast luftig plate mønstre. For nanoroder med en tverrgående akse < 25 NM, kan det være vanskelig å oppdage signal på at LSPR bølgelengde bruker DIC mikroskopi.
For å utføre enkelt partikkel spektroskopi er det viktig å bruke de riktige optiske komponentene og justere dem riktig. En objektiv i stand til DIC mikroskopi må brukes. For enkelt partikkel eksperimenter er 80x-eller 100-mål olje målene ideelle. Nomarski DIC prismer vanligvis kommer i tre varianter: standard, høy kontrast, og høy oppløsning. Den ideelle typen avhenger sterkt av formålet med eksperimentet og størrelsen på nanopartikler. Standard prismer er bra for mange eksperimenter; men når du arbeider med mindre nanopartikler (< 50 NM), kan høy kontrast prismer være fordelaktig, siden partikkel kontrasten reduseres etter hvert som partiklene synker i størrelse11. Justering av DIC kontrasten oppnås enten ved å rotere en polarisator eller ved å oversette en av DIC prismer, avhengig av mikroskopet merke eller modell6.
Etter innstilling Kohler belysning og polarisator innstillinger, er det avgjørende å ikke justere disse innstillingene mens samle spektroskopi data. Videre må en konstant gjennomsnittlig bakgrunns signal opprettholdes til enhver tid under datainnsamlingen, selv når du skifter mellom filtre og vinkelinnstillinger. Den faktiske ideelle bakgrunns verdien avhenger av det dynamiske spekteret til det vitenskapelige kameraet, men generelt bør bakgrunnen være i størrelsesområdet 15% – 40% av det maksimale deteksjons nivået for kameraet. Dette reduserer sannsynligheten for å mette kamerasensoren samtidig som den muliggjør optimal partikkel kontrast. For innsamling av spektroskopi data, er det nødvendig å arbeide med et vitenskapelig kamera som fanger opp bilder i svart og hvitt, i motsetning til en farge kamera.
Prøveforberedelse er en annen kritisk aspekt av Imaging plasmonic nanopartikler. Det er viktig at operatørene av DIC mikroskopi har en forståelse av utvalget optiske egenskaper og av prøven er underlaget. "Pre-renset" mikroskop glass er ikke tilstrekkelig forberedt for bildebehandling nanopartikler, og det må være skikkelig re-rengjøres før prøven deponering for å sikre uhindret observasjon av prøven. Mange rengjøring protokoller for mikroskop lysbilder har tidligere vært dokumentert12, men det er ikke et skritt som normalt er rapportert i eksperimentelle studier.
Til slutt, dataanalyse metoder er den endelige komponenten til enkelt partikkel spektroskopi. Maksimums-og minimums intensiteten for hver nanopartikkel må måles, i tillegg til den lokale bakgrunns gjennomsnittet. Partikler av interesse bør plasseres i områder uten bakgrunn rusk, substrat defekter, eller ujevn belysning. En metode for å bestemme Spectral profil av en nanopartikkel er ved å beregne partikkel kontrasten på hver bølgelengde, ved hjelp av ligningen under11,13,14,15:
Alternativt kan en enkelt partikkel spektrum deles inn i sin individuelle maksimum og minimum signal komponenter, som representerer DIC to polarisering felt, og dermed viser de to samtidig samlet directionally-avhengige Spectra, gjennom de to likninger:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prøve forberedelser med standard glass mikroskopi lysbilder
- Forbered glass mikroskop lysbilder for prøven deponering.
Merk: i noen tilfeller kan det være mer hensiktsmessig å lagre glasset i ultrarent vann i stedet for etanol. Men lagring i vann eller luft gjør glasset hydrofobe over tid.- For best resultat, Kjøp glass eller kvarts mikroskop lysbilder og dekkglass.
- Bruk en scribing penn til å plassere et grunt og kort ripe merke på midten av hvert glass deksel.
- Rengjør alle mikroskop glass, selv om det er kjøpt "pre-renset", for å fjerne glass skår, støv, pulver, organiske rester, og andre forurensninger som påvirker bildekvalitet eller prøve deponering.
Merk: denne rengjøringsmetoden nedenfor fungerer bra for de typer prøver som er beskrevet her, og unngår bruk av sterke kjemikalier. Strengere kjemikalier kan etse glasset og kreve mer pleie i håndtering og avhending.- Plasser mikroskop glass på lager stativer og deretter inn i et beger, eller i en farge krukke. Ikke plasser mikroskop glass på bunnen av kanner og andre laboratorie glass uten reoler, fordi hver del og overflaten av mikroskop glass skal være fullt eksponert for rengjøringsmidler.
- Hell ~ 1 mL flytende vaskemiddel (tabell av materialer) i beholderen og topp av beholderen med vann. Sonikere i 30 min.
Merk: Når rengjøringen begynner, må du bare håndtere glasset mens du bruker hansker, for å unngå å etterlate fingeravtrykk rester på glasset. - Hell ut væskeinnholdet i rengjørings beholderen i en vask. Skyll beholderen flere ganger med ultrarent vann for å fjerne alle utse ende vaskemiddel. Fyll beholderen med ultrarent vann. Sonikere beholderen med mikroskop glass for en annen 30 min.
- Gjenta det forrige trinnet minst én gang til. Utfør ekstra runder med sonikering i vann til det er åpenbart at alle spor av vaskemiddel er fjernet.
- Hell ut innholdet i rengjørings beholderen. Skyll beholderen med ultrarent vann. Fyll beholderen med etanol. Sonikere mikroskop glass i 30 min.
- Hell ut innholdet i rengjørings beholderen i en avfallsbeholder. Påfyll med etanol. Dekk beholderen for å hindre tap av etanol gjennom fordampning. Oppbevar mikroskop glasset i denne beholderen til tidspunktet for eksperimentet. Slides forblir rene og brukbare så lenge de forblir neddykket i etanol inne i en overbygd container.
-
Utarbeidelse av nanopartikkel løsning
- Bruk en micropipette til å fjerne en 100 μL alikvot på 0,05 mg/mL gull nanopartikkel løsning fra den opprinnelige lagrings beholderen, og løs ut løsningen i et 1,5 mL sentrifugerør.
- Sentrifuger prøven i 10 min ved 6 000 x g.
- Fjern supernatanten med en micropipette for å fjerne overflødig overflateaktivt middel.
- Bruk en micropipette, og plasser 100 μL av ultrarent vann i sentrifuge røret.
Merk: Hvis ikke alle supernatanten kan fjernes ved første forsøk, gjentar du sentrifugering og blanding trinnene. - Vortex kort prøven for å resuspend pellet. Sonikere umiddelbart etterpå i 20 min til fullt resuspend og bryte opp nanopartikkel aggregater.
Merk: Hvis prøven ikke brukes umiddelbart, bør det være sonikert igjen i 20 minutter før innskudds løsning på mikroskop glass.
-
Eksempel på deponering
- Fjern de rene deksel sedlene og objektglassene fra lager beholderne. Blås tørt glasset med trykksatt nitrogen eller Argon.
- Ved hjelp av en micropipette, støpt 6 μL av nanopartikkel løsning fra trinn 1.2.5 på dekk Seddelen. Hvis du vil spre ut dråpe høyden jevnt, plasserer du et sekund, et større glass mikroskop på toppen av trekket, for eksempel en ekstra deksel slip eller et mikroskop lysbilde. Unngå å få luftbobler fanget mellom de to stykker av glass.
- Snu prøve underlaget over, og forsegle kantene av dekselet slip med en smal linje av neglelakk for å hindre fordampning av medium løsning.
- Alternativt, for å bilde prøven "tørr", la løsningen stå i 5 – 15 min på forsiden, før du fjerner det uønskede stykke glass. Blås forsiktig deksel Seddelen tørr med trykk nitrogen eller Argon.
- Hvis mulig, bilde prøver umiddelbart etter tilberedning. Hvis det ikke er mulig, bør du lagre prøvene i en beholder som dekkes, for eksempel en Petri-rett til bildebehandling.
2. DIC Imaging
- Juster objektiv og kondensator.
- Når du har plassert prøven på mikroskopet, kan du finne fokalplanet med prøven på. Først finne og fokusere på scratch merke opprettet tidligere. Deretter finjustere fokus til nanopartikler kommer i sikte.
- For å bestemme nøyaktig plassering av kondensatoren, bruke Kohler belysning metoden. 5 Kohler belysning ved høy forstørrelse (80x, 100%) er lettere å oppnå ved å først sette Kohler-belysningen ved en lavere forstørrelse, for eksempel 20x.
Merk: normalt trenger ikke Kohler-belysning å justeres på nytt under avbildning av en enkelt prøve. Det er imidlertid lurt å kontrollere at Kohler belysning er riktig innstilt når du bytter til et nytt mikroskop lysbilde.
- Optimaliser kontrastinnstillingene.
- Velg et område av interesse i utvalget for bildebehandling. Midtstill området i kameraets synsfelt og Juster fokus etter behov.
- Hvis mikroskopet har de Senarmont design, starter med polarisator satt nær maksimal bakgrunn utryddelse og gradvis rotere polarisator mot synkende bakgrunn utryddelse. Bakgrunns intensiteten vil gradvis øke.
- Hvis mikroskopet ikke har en de Senarmont design, starte med det optiske toget satt på maksimal bakgrunn utryddelse. I dette tilfellet, gradvis justere målet prisme posisjon mot avtagende bakgrunn utryddelse.
Merk: den ideelle innstillingen oppnås når nanopartikler når sin største intensitet forskjell (dvs. kontrast) fra den gjennomsnittlige lokale bakgrunns verdien. For plasmonic nanopartikler oppnås optimal kontrast normalt med en relativt mørk bakgrunn, og dermed ved innstillinger nær maksimal bakgrunn utryddelse.
- Velg et område av interesse i utvalget for bildebehandling. Midtstill området i kameraets synsfelt og Juster fokus etter behov.
- Bilde prøven.
- Slå av belysningen på rommet for å unngå at belysningen samhandler med prosessen.
- Når du ser på nanopartikler med et vitenskapelig bilde kamera, bør du finne det optimale bakgrunns nivået. Ved hjelp av en 10 NM full bredde på halv høyeste (FWHM) båndpassfilter med sin sentrale bølgelengde co-plassert med hoved LSPR bølgelengde, vise regionen av interesse. Juster lampe intensiteten eller eksponeringstiden til bakgrunns nivået er i størrelsesområdet 15% – 40% av kameraets maksimale kapasitetsnivå, og ingen objekter i regionen som interesserer deg, viser signal intensitet som overstiger 90% av kameraets maksimale styrke nivå.
Merk: Målet med trinn 2.3.2 er å forhindre at sensoren mette ved bytte mellom filtre. Det ideelle bakgrunns nivået vil variere mellom prøver og kameraer. Når dette trinnet er fullført, eksponeringstid kan justeres, men ikke lampen intensitet. - Image prøven med en rekke bånd pass filtre som hver har en FWHM på 10 NM, og at som helhet muliggjøre Imaging over hele bølgelengde spekter av interesse. Sørg for at bakgrunns intensiteten forblir konsistent fra bilde til bilde (innen ~ 5% av hverandre) ved å justere eksponeringstiden. Etter at du har byttet filtre, må du fokusere prøven på nytt før bildeopptak.
- Lagre bilder som ukomprimerte TIFF-filer og/eller i programvaren opprinnelige filformat, for å bevare all informasjon.
- Roter prøven.
- Etter å samle bilder av prøven på sin opprinnelige posisjon, kan prøven nå roteres og avbildet på flere retninger i lys banen. Utfør rotasjon med jevne mellomrom (f.eks. 10 ° eller 15 °) over enten en 180 ° eller 360 ° rekkevidde.
Merk: rotasjon krever et prøve trinn som må roteres. - Som i seksjoner 2.1-2.3, justere kamerainnstillinger for å gi en konsistent bakgrunn nivå fra bilde til bilde.
Merk: ingen justering av Kohler belysning bør foretas.
- Etter å samle bilder av prøven på sin opprinnelige posisjon, kan prøven nå roteres og avbildet på flere retninger i lys banen. Utfør rotasjon med jevne mellomrom (f.eks. 10 ° eller 15 °) over enten en 180 ° eller 360 ° rekkevidde.
3. data analyse bruker ImageJ
Merk: følgende beregninger kan utføres i en rekke programvarepakker, og noen ganger i det opprinnelige programmet brukes til å samle bildene. ImageJ er en fritt tilgjengelig programvare fra National Institutes of Health (NIH).
- Beregn partikkel kontrast eller-intensitet.
- Åpne bildet med ImageJ.
- Velg rektangel verktøyet og tegn et rektangel rundt den viktigste regionen av interesse.
- Velg bildepå verktøylinjen, og deretter Zoomog deretter til merket område. Bildevinduet vil zoome inn på det valgte området.
- Velg bildepå verktøylinjen, og Justerderetter lysstyrke/kontrast. Et nytt vindu vises. Hvis du vil aktivere en bedre visning av eksempel området, justerer du de fire innstillingene: minimum, maksimum, lysstyrke og kontrast. Disse justeringene endrer ikke de vitenskapelige dataene, de bare gir bedre synlighet for eksempel området.
Merk: trinn 3.1.3 og 3.1.4 kan utføres flere ganger og i omvendt rekkefølge. - Bruk rektangel verktøyet igjen til å tegne en boks rundt den første nanopartikkel som skal måles. Boksen burde være bare lett større enn det nanopartikkel ' luftig skiven.
- Velg analyserpå verktøylinjen, og målderetter. Det vises et nytt vindu som rapporterer minimum, maksimum og gjennomsnittlig intensitet for pikslene som er plassert inne i den valgte boksen.
- Dra boksen som brukes til å måle nanopartikkel til et område umiddelbart ved siden av partikkel, der bakgrunns kontrasten er relativt jevn og ingen partikler eller forurensninger er til stede. Behold den opprinnelige størrelsen på boksen.
- Bruk måleverktøyet til å bestemme gjennomsnitts intensiteten for bakgrunnsområdet.
- Mål de resterende partikler og en tilstøtende bakgrunn område for hver.
- Gjenta prosessen for hver partikkel i alle bildene i serien.
- Eksporter dataene til et regneark for å beregne kontrasten eller intensiteten til hver partikkel, på tvers av alle bølgelengder og vinkler.
- Beregn kontrasten til hver partikkel ved å bruke følgende ligning13,14,15:
Merk: ved hjelp av denne ligningen bør partikkel kontrasten alltid være > 0. - Beregn partikkel bakgrunns justert maksimumsverdi ved å dele den målte maksimale partikkel intensiteten med bakgrunnen betyr:
- På samme måte kan du beregne den bakgrunns justerte minimumsverdien ved å dele den målte minste partikkel intensiteten med bakgrunnen:
Merk: som beregnet, bør maksimumsverdien ha en verdi som er større enn én, mens minimum vil være mindre enn én. Det er akseptabelt å trekke hver verdi med "1", slik at den gjennomsnittlige bakgrunnen er egentlig null, maksimal representeres som en positiv verdi, og minimumsverdien er tildelt en negativ verdi16. Denne sistnevnte tilnærmingen gjør at analytikeren til separat vurdere hva som skjer langs hver av polarisering feltene, som er nyttig når du studerer Anisotrop partikler. - For å tegne opp Spectral profilen ved en gitt nanopartikkel posisjon, plott data med bølgelengden langs x-aksen og kontrasten eller intensiteten langs y-aksen.
- Hvis du vil graf rotasjons profilen ved en gitt bølgelengde, tegner du rotasjonsvinkelen langs x-aksen og kontrasten eller intensiteten langs y-aksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når du arbeider med prøver som er store nok til å bli sett med det blotte øye, plassere landemerker på glass underlaget er normalt ikke nødvendig. Men når du arbeider med nanomaterialer eller når rotasjon av prøven er nødvendig, kan landemerker gi en enkel metode for å finne, skille og spore retningen på prøven. Selv om mer sofistikerte teknikker kan utnyttes for å forlate landemerker på glass underlag17, skrape glasset med en scribing penn er en økonomisk og enkel metode som fungerer i mange situasjoner. Det er viktig å unngå å undersøke utvalgs områder som er like ved siden av disse landemerkene, siden utviskings merker skaper en kompleks bakgrunn med potensialet for å påvirke data (Figur 3). Men på tuppen av scratch merkene, "Spider webs" ofte forlenge utover fra scratch. Disse linjene er ganske verdifulle som landemerker, men igjen bør nanopartikler unngås hvis de overlapper med disse feilene.
For å oppnå optimal bildebehandling med DIC mikroskopi, er det av avgjørende betydning for å bestemme riktig fokalplanet. Objekter som er litt ute av fokus, vil se uklare ut, ha uklare kanter og ha redusert kontrast. Figur 4 viser gull nanopartikler som er ute av fokus i varierende grad. Nanopartikler i nedre høyre hjørne er i fokus, mens nanopartikler blir lenger ute av fokus når de nærmer seg øvre venstre hjørne av dette bildet. Fordi DIC har en grunne dybde på feltet, er det ikke uvanlig at noen nanopartikler å være i fokus, mens andre er ute av fokus når Imaging dem på et glass substrat. Som et resultat er det viktig å fokusere konsekvent på de samme partiklene når du foretar justeringer i mikroskopet under et eksperiment.
Figur 5 gir et eksempel på effekten av å justere polarisator innstillingene mens Imaging gull nanosfærer. Fem nanopartikler er i fokus, mens en er litt ute av fokus. En 540 NM båndpassfilter med 10 NM FWHM var også i den optiske banen. I denne serien av bilder, bakgrunnslysstyrken ble justert med ImageJ etter bilde oppkjøpet for å gjøre de fem partiklene mer synlig mot bakgrunnen. Når polarisator er satt til 0 ° i et de Senarmont utformet Nomarski DIC mikroskop, er det ortogonale til analysator (figur 5a). Ved 0 ° vises partiklene for det meste hvitt, med en mørk stripe som går på tvers av midt delen. Dette er en indikasjon på kryss-polarisering for nanosphere prøver. Når polarisator roteres til forskjellige vinkler (figur 5B-E), partiklene ser ut til å være støping mørke skygger mot sørvest. Den svarte og hvite komponenter til signalet oppstår som følge av DIC to polarisering felt og gi informasjon om orienteringen av plasmonic nanopartikler når du arbeider med bånd pass filtre. Når polarisator roteres mot høyere vinkler, forblir skyggemønsteret tilsvarende. Partikkel kontrast verdiene endres imidlertid dramatisk. Dette er best demonstrert ved å måle kontrast verdiene for de enkelte partikler, ved hjelp av ligningen ovenfor. Partikkel merket med den svarte boksen har kontrastverdier på 0,65 (krysset polarisatorer), 0,84 (polarisator forskyvning på 5 °), 1,10 (10 °), 0,44 (20 °) og 0,23 (45 °). Derfor er den optimale bildeinnstillingen for dette eksemplet med et polarisator Skift på 10 °. Plasmonic nanopartikler krever ofte en polarisator innstilling i området 5 °-15 °, og mindre trinn enn disse bør normalt brukes til å identifisere den ideelle innstillingen. For ytterligere informasjon om bildebehandling og analyse av sfæriske gull nanopartikler, er leserne henvist til tidligere arbeid av Sun et al.11.
Anisotrop nanopartikler produserer mønstre av høyere kompleksitet enn nanosfærer. Gold nanoroder ble avbildet (figur 6) på deres langsgående LSPR bølgelengde, 650 NM. I det første bildet (figur 6a) er fem lyse nanoroder og flere dimme partikler tydelige. I stedet for å ha en skygge-cast utseende, tre av stengene har hovedsakelig svart luftig plater, mens to er stort sett hvite. Den polarisator ble satt til 10 ° til venstre for den krysset polarisering innstillingen. I figur 6b, krysset polarisering ble brukt; bare tre av partiklene vises, som helt hvite luftige plater. De andre har forsvunnet eller synes å være litt ute av fokus. Med polarisator satt til 10 ° til høyre for krysset polarisering (figur 6C), er mønstrene nå reversert av det som ble observert i figur 6a. Den polarisator ble neste slått til 45 ° høyre av krysset polarisering (figur 6D), den maksimale innstillingen, for å demonstrere at partikler beholder sine farger ved denne innstillingen, men kontrasten har sunket betraktelig. I de resterende figur panelene, innsamling av nanoroder ble trinnvis rotert en full 90 ° med klokken mens polarisator ble satt til 10 ° til høyre for krysset polarisering. Mønsteret gradvis endres for hver nanorod, og etter en full 90 ° rotasjon, har partiklene snudd sine farger fra den opprinnelige innstillingen. I korte trekk, hvis en av aksene av en plasmonic nanorod er lined opp med en av de to polarisering feltene, og hvis nanorod er avbildet på at aksen ' LSPR bølgelengde, vil nanorod synes å være stort sett hvite eller for det meste svart, avhengig av polarisering feltet det er aligne d med (figur 6a, C)2. Hvis nanopartikkel roteres en full 90 ° (figur 6h), vil det nå være stilt opp med motsatt polarisering feltet og ta på motsatt farge. Hvis stedet nanopartikkel ble rotert bare 45 ° (figur 6F), så vil det være i en posisjon hvor partikkel vil vise sin største skygge-cast utseende, viser slående likhet med hva som er observert med plasmonic nanosfærer. Som et resultat av denne optiske atferden, plasmonic nanopartikler med en Anisotrop form ser ofte flat i stedet for å ha den tredimensjonale skygge støpte utseendet av nanosfærer. Resultatet av denne forskjellen i optisk atferd er at det kan utnyttes for å skille mellom plasmonic nanopartikler som er sfærisk og Anisotrop i form, som tidligere har blitt diskutert i flere forskningsstudier2, 3,6,7,11,13,16.
Til slutt, figur 7 viser representative enkelt partikkel spektroskopi data, som kontrast av en gull Nanosphere (figur 7a)11, intensiteten av en enkelt gull nanorod med sin langsgående akse orientert parallelt med en av polarisering felt (figur 7b)6, og intensitet profil av en enkelt gull nanorod på sin LSPR bølgelengde og under rotasjon av scenen (figur 7C)6. Begge presentasjons metodene avslører bredden og plasseringen til LSPR-effekten. For plasmonic nanopartikler med en Anisotrop form, viser intensiteten og rotasjons dataene retningen av effekten, og dermed retningen av partikkel på prøve underlaget, som tidligere har blitt bevist gjennom correlative studier på slike partikler ved hjelp av dic og Transmission Electron mikroskopi2,16,18.
Figur 1: lyset banen i overført-lys Nomarski-baserte dic mikroskopi. Etter å ha forlatt lyskilden (S), passerer lyset gjennom en polarisator (P), en bjelke-klipping Nomarski prisme (NP), kondensatoren (C), fokalplanet (FP), målet (O), en bjelke-kombinere Nomarski prisme (NP), analysator (A), og til slutt detektoren (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempler på plasmonic nanopartikler avbildet på deres LSPR bølgelengder med 10 NM bånd pass filtre, ved hjelp av et dic mikroskop. Begge bildene blir samlet på 100%. (A) Silver nanosfærer med 40 nm diameter avbildet på 480 NM med en båndpassfilter med 10 NM FWHM. (B) Rod-lignende gull nanopartikler avbildet på 700 NM ved hjelp av en båndpassfilter med 10 NM FWHM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: bilde av en ripe laget i et glass cover slip med en scribing penn. Mot slutten av selve innrykket, en rekke smale og grunne "edderkopp Web" linjer gren ut fra scratch selv, noe som resulterer i et mønster som kan benyttes som en tenkelig landemerke. Dette bildet ble samlet inn ved hjelp av 100-forstørrelse og bredbånd hvitt lys. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Gold-nanosfærer avbildet med hvitt bredbånds lys på 100%. Partikler i nedre høyre er i fokus, men partikler går lenger fra fokalplanet mot øvre venstre hjørne. Objekt i midten av bildet er rusk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: gull nanosfærer avbildet under en rekke forskjellige polarisator innstillinger med en bølgelengde på 540 NM og en forstørrelse på 100%. Bakgrunnslysstyrken ble justert etter bildebehandling med ImageJ for å gjøre partiklene tydeligere. Polarisator innstilling av (A) 0 ° (polarisator ortogonale til analysator), (B) 5 °, (C) 10 ° (den beste kontrasten i denne serien av bilder), (D) 20 °, og (E) 45 °. Målt kontrast av partikkel i svart boks er (A) 0,65, (B) 0,84, (C) 1,10, (D) 0,44, og (E) 0,23. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: eksempel på bilde Anisotrop plasmonic nanopartikler: gull nanoroder på sin langsgående LSPR bølgelengde på 650 NM og en forstørrelse på 100%. Partikler av stor interesse er vedlagt i gul boks. Polarisator-innstillinger er: (A) venstre 10 °, (B) 0 °, (C) høyre 10 °, (D) høyre 45 °. Med polarisator satt til høyre 10 °, ble scenen rotert med klokken ved (E) 20 °, (F) 45 °, (G) 70 °, og (H) 90 °. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: representative resultater av enkelt partikkel spektroskopi data. (A) Gold nanosphere spektroskopi vises i form av dic Contrast. Hvert datapunkt representerer et gjennomsnitt på 20 nanosfærer for hver partikkel diameter, og datafangst støttet seg på 10nm FWHM bånd pass filtre. (B) en enkelt gull nanorod vises som dic intensitet data, ved hjelp av to forskjellige polarisator innstillinger (2 ° på hver side av krysset polarisering). (C) dic intensitet data for en enkelt gull NANOROD på LSPR bølgelengde på 680 NM, mens det ble rotert 180 ° og polarisator ble holdt ved 2 ° av krysset polarisering posisjon. Figur 7A er tilpasset med tillatelse fra Sun et al., analytisk kjemi. 81 (22), 9203-9208 (2009), og figur 7B, C fra stender et al., analytisk kjemi. 84 (12), 5210-5215 (2012). Copyright American Chemical Society. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når Imaging med DIC mikroskopi, er det avgjørende å optimalisere de optiske komponentene før du samler inn data. Selv mindre justeringer av polarisator midt i et eksperiment kan føre til betydelige innvirkninger på de endelige dataene6. Videre krever ulike materialer ulike polarisator innstillinger. Selv om store trinn størrelser ble benyttet her for å demonstrere effekten av polarisering vinkel, i et faktisk eksperiment, er det viktig å optimalisere polarisator innstillingen innen 1 °-2 ° av den optimale kontrasten innstillingen. Polarisator-innstillingen bør også registreres for fremtidig referanse. Det anbefales også å alltid arbeide på samme side av krysset polarisator (0 °) punkt. Bytte frem og tilbake gir ikke noen fordeler, men det kan føre til forvirring, på grunn av en reversering i skyggen mønster.
Neste i betydning, er det avgjørende å overvåke bakgrunnen intensitet når du planlegger å utføre spektroskopi. Dette oppnås best ved å justere kameraets eksponeringstid, eller ved å legge til nøytrale tetthets filtre i lys banen. Justering av blenderåpninger eller lampe intensitet kan påvirke Kohler belysning og endre kontrastverdier. Bakgrunnen må være relativt til og med på tvers av prøven, slik at valget av et bakgrunnsområde ikke endrer kontrast beregningen. Prøveeksemplarer som ikke er tilstøtende til en ren bakgrunn plass bør unngås. Dessuten, bakgrunnen intensiteten kan ikke være i utgangspunktet satt for høyt eller for lavt. Hvis bakgrunns intensiteten er satt for høyt, er det en økt risiko for at noen signaler vil overskride maksimums rekkevidden til kameraet, noe som gjør det umulig å beregne kontrasten i disse regionene. Hvis bakgrunnen intensiteten er satt for lavt, vil det være svært vanskelig å oppnå god kontrast mellom den mørke komponenten av DIC signalet og bakgrunnen signalet. Forstå typisk eller forventet virkemåte av en prøve kan hjelpe til med å velge riktig bakgrunn intensitet.
Finne riktig fokalplanet er også viktig. En av Nomarski DIC fordeler er at den har en grunne dyp på feltet. Dette gjør det imidlertid mer utfordrende å fokusere på tynne prøver, for eksempel nanopartikler. Med tykkere prøver, er utfordringen i å finne den faktiske fokalplanet av størst interesse. Mange fokal fly kan være interessante og ha nanopartikler på seg, så det er viktig å bestemme tidlig på nanopartikler av størst interesse.
Når det gjelder nanopartikler, er det viktig for microscopist å erkjenne at de ser på en luftig plate eller "punkt sprednings funksjon" av objekt2. I alminnelighet, det luftig skiven er nyttig inne avgjør hvorvidt en plasmonic nanopartikkel har en skikkelsen det er isotropic eller Anisotrop, bortsett fra nanopartikkel tenkelig er faktisk meget mere innviklet enn hva er omtalt her over. Komplekse nanopartikkel aggregater kan noen ganger ligne isotropic partikler, og som et resultat, elektron mikroskopi metoder er da nødvendig å karakterisere de nanopartikkel mønstrene2,16,18, 19. til bilde plasmonic nanopartikler med dic mikroskop, er det avgjørende å bruke filtrert bildebehandling og til bilde partiklene på en av sine svært absorberende plasmonic bølgelengder6. Imaging på en upassende bølgelengde eller uten filtre kan føre til fangst av skygge-cast mønstre som er vanskelig å tyde.
Når Imaging nanopartikler sammen med objekter som er større enn den Diffraksjon grensen av lys, er det viktig å huske at mikroskopet mål "ser" et relativt flatt fokal plan. En vanlig misforståelse av DIC er at det muliggjør visning av et objekt i selve 3D lettelse. Dette er forårsaket av skygge støpte mønstre, som faktisk gjør at mange objekter synes å være tredimensjonale. Men for å samle vertikal informasjon på flere fokal fly, ville det være nødvendig å heve eller senke scenen og samle en sekvens av bilder. Dette kan være svært vanskelig å utføre og å tolke, spesielt for tykkere prøver, for eksempel celler. Dermed trenger microscopist en dyp forståelse av alle materialer som er involvert når du utfører slike eksperimenter og må registrere posisjonene til de enkelte fokal flyene som ble utnyttet.
Til slutt er dataanalyse trinnet like kritisk som datainnsamlingen. Når du måler kontrasten eller intensiteten verdier av prøven, flere faktorer bør holdes i tankene. Vanligvis er analytikeren primært interessert i minimum og maksimum verdier for partikkel av interesse. Når kontrasten til støyforhold for prøven er tilstrekkelig høy, og hvis bakgrunnen området er rent og jevnt opplyst, så en enkel geometrisk form kan trekkes rundt prøven regionen uten bekymring for signal blir innført av forurensninger. Videre, hvis bakgrunnen er ren og jevnt opplyst, kan en bakgrunn måling gjøres i alle områder umiddelbart ved siden av prøven. Men hvis det er forurensninger eller hvis bakgrunnen er ujevn, så analytikeren må foreta en kritisk gjennomgang av prøven omgivelser, og analytikeren må vurdere om det er enda mulig å gjøre en rimelig bakgrunn måling. Det er også viktig å måle prøven og bakgrunnen områder med samme størrelse og formet verktøy, for å unngå innføring av bias i beregningen. Vanligvis har mindre måle områder en lavere sannsynlighet for å påvise outliers (f.eks. forurensninger, dårlige piksler osv.), men større prøveområder gir ofte en mer pålitelig måling av bakgrunns gjennomsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dr. Anthony S. stender ønsker å anerkjenne teknisk støtte gjennom nanoskala og Quantum fenomener Institute (NQPI) ved Ohio University. Denne artikkelen ble gjort mulig gjennom oppstart finansiering gitt til Dr. stender ved Ohio University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Contrad 70 | Decon Labs, Inc. | 1002 | For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers |
| Ethanol | Fisher Scientific | A962-4 | For cleaning and storing microscope glass |
| Glass microscope cover slips | Ted Pella | 260148 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26007 | |
| Gold nanorods | Nanopartz | DIAM-SPR-25-650 | |
| Gold nanospheres (80 nm) | Sigma Aldrich | 742023-25ML | |
| ImageJ | NIH | N/A | Free Software availabe for data analysis from NIJ |
| Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | N/A | |
| Nitrogen gas | Airgas | N/A | |
| ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera | Hamamatsu | 77054098 | |
| Scribing pen | Amazon | N/A | Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version. |
| Ultrapure water | 18 megaohm |
References
- Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. Advanced Light Microscopy. 2, Elsevier. 146-197 (1989).
- Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response. ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).
- Stender, A. S., et al. Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy. Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).
- Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope. Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).
- Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition. , Wiley. 1-20 (2012).
- Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy. Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).
- Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).
- Mulvaney, P. Not All That's Gold Does Glitter. MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).
- Maier, S. A. Plasmonics: Fundamentals and Applications. , Springer US. (2007).
- Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells. Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).
- Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).
- Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles. Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).
- Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 2: Light and Color. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , Wiley. 21-33 (2012).
- Wayne, R. Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light. Light and Video Microscopy (Second Edition). , Academic Press. 43-78 (2014).
- Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries. The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).
- Hu, M., et al. Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance. Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).
- Choo, P., et al. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).
- Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries. Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).
