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Genetics

Lentiviral मध्यस्थता जीन Silencing में मानव Peudoislet कम अनुलग्नक प्लेट्स में तैयार

Published: May 14, 2019 doi: 10.3791/59578
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 2,3, 1,2
1Department of Internal Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Fraternal Order of Eagles Diabetes Research Center, University of Iowa, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

Summary

छितरी हुई मानव आइलेट कोशिकाओं से जीन संशोधित मानव छद्म-लेट्स बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल जो छोटे हेयरपिन आरएनए (shRNA) ले जाने वाले lentivirus द्वारा ट्रांसड्यूसर द्वारा ट्रांसड्यूसर किया जाता है। इस प्रोटोकॉल आसानी से उपलब्ध एंजाइम और संस्कृति वाहिकाओं का इस्तेमाल करता है, आसानी से किया जा सकता है, और कार्यात्मक और आकृतिविज्ञान अध्ययन के लिए उपयुक्त आनुवंशिक रूप से संशोधित मानव छद्म उपयोग का उत्पादन करता है।

Abstract

विभिन्न आनुवंशिक उपकरण मधुमेह अनुसंधान के लिए आइलेट जीन के समारोह विच्छेदन करने के लिए कृन्तकों के अग्नाशयis में जीन ों को व्यवस्थित करने के लिए उपलब्ध हैं। हालांकि, कृंतक आइलेट्स से प्राप्त डेटा अक्सर पूरी तरह से में पुनरुत्पादित या islet में प्रसिद्ध मतभेद के कारण मानव islets के लिए लागू नहीं कर रहे हैं और प्रजातियों के बीच समारोह. वर्तमान में, तकनीक है कि मानव islets के जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए उपलब्ध हैं बहुत सीमित हैं. एडेनोवायरस, प्लाज्मिड, और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स द्वारा अक्षुण्ण आइलेट्स में ट्रांसजीन का परिचय अक्सर कम दक्षता और उच्च विषाक्तता से ग्रस्त होता है। कम दक्षता बरकरार islets, जो उच्च दक्षता की आवश्यकता में जीन downregulation अध्ययन में विशेष रूप से समस्याग्रस्त है. यह ज्ञात हुआ है कि एंजाइमी रूप से विक्षिप्त आइलेट कोशिकाएं संस्कृति में पुन: एकत्रित होती हैं जिसे स्यूडोइड कहते हैं। मानव आइलेट कोशिकाओं के आकार-नियंत्रित पुनर्समूहीकरण छद्म आइसिसलेट बनाता है जो लंबे समय तक संस्कृति के बाद गतिशील पहले चरण इंसुलिन स्राव को बनाए रखता है और कम विषाक्तता के साथ lentiviral शॉर्ट हेयरपिन आरएनए (shRNA) को कुशलतापूर्वक पेश करने के लिए एक खिड़की प्रदान करता है। यहाँ, दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मल्टीवेल प्लेटों का उपयोग कर lentiviral transduction के बाद मानव pseudoislets के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है. प्रोटोकॉल आसानी से किया जा सकता है और जीन के कुशल downregulation और मानव आइलेट कोशिकाओं का उपयोग कर इंसुलिन स्राव की गतिशीलता के आकलन के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार, lentiviral मध्यस्थता जीन मॉडुलन के साथ मानव pseudoislets मानव आइलेट कोशिकाओं के भीतर जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली और बहुमुखी मॉडल प्रदान करते हैं।

Introduction

कार्यात्मक बीटा सेल द्रव्यमान का नुकसान दोनों प्रकार 1 और प्रकार 2 मधुमेह1के लिए केंद्रीय विकृति है . जबकि बीटा कोशिकाओं अग्नाशय islets में इंसुलिन के निर्माता हैं, बीटा कोशिकाओं और गैर बीटा कोशिकाओं के बीच संचार इंसुलिन स्राव2के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इसके अलावा, ग्लूकागन स्राव का डिस्रेग्यूलेशन मधुमेह3में हाइपरग्लेसेमिया में योगदान देता है। इस प्रकार, मधुमेह में आइलेट रोग के विकास के पीछे तंत्र को संबोधित करने के लिए अग्नाशयी आइलेट्स के भीतर कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करने के लिए मजबूत रुचि है। ट्रांसजेनिक चूहों सहित दृष्टिकोण की एक किस्म माउस islets के जीन अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करने के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, मानव और माउस आइलेट्स अलग innervation, सेल वितरण, अल्फा कोशिकाओं के लिए बीटा के अनुपात, और secretagogues4के लिए प्रतिक्रिया दिखाते हैं। इसलिए, मानव islets में जीन समारोह का प्रत्यक्ष मूल्यांकन मानव अग्नाशय islets के pathophysiology को समझने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है.

एडेनोवायरल वेक्टर, गैर-विभाजित कोशिकाओं में ट्रांसडक्शन की उच्च दक्षता के कारण विट्रो में अग्नाशयी आइलेट्स को ट्रांसड्यूस करने के लिए सबसे व्यापक रूप से प्रयुक्त वायरल वेक्टर है। हालांकि, एडेनोवायरस islets के कोर में कुशलता से प्रवेश नहीं करता है, विशेषरूप से मानव आइलेट्स5में , और उच्च खुराक 6 पर साइटोटॉक्सिक है। तुलनात्मक रूप से, मसूरीवायरल वेक्टर कम साइटोटॉक्सिक होता है और बाह्य जीनों को पोस्ट-माइटोटिक कोशिकाओं के गुणसूत्र में स्थायी रूप से बचाता है, जिससे यह जीन चिकित्सा7के लिए एक व्यापक रूप से परीक्षण किया गया वाहन बना देता है। हालांकि, अक्षुण्ण मानव आइलेट्स के कोर में प्रवेश करने के लिए lentivirus की क्षमता भी सीमित है, इस प्रकार एंजाइमी पाचन द्वारा आंशिक फैलाव की आवश्यकता के लिए transduction दक्षता8में वृद्धि. बरकरार मानव islets के फैलाव के साथ चेतावनी सेल सेल और सेल मैट्रिक्स संचार, जो मनुष्यों में ग्लूकोज homeostasis के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण इंसुलिन स्राव के गतिशील विनियमन समझौता9के रुकावट है. इस प्रकार, मानव आइलेट के एक मॉडल में आइलेट फंक्शन के गतिशील विनियमन पर जीन मॉडुलन के प्रभाव का आकलन करना चुनौतीपूर्ण रहा है।

यह ज्ञात किया गया है कि मानव और कृंतक से छितरी हुई आइलेट कोशिकाओं को स्वायत्त रूप से आइलेट की तरह संरचनाओं में पुन: व्यवस्थित किया जाता है जिसे "स्यूडोइसलेट" कहा जाता है। कूटाश्मित्यै ववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववव इसके अतिरिक्त, दीर्घकालिक संस्कृति के बाद, देशी islets उत्तरोत्तर मजबूत पहले चरण इंसुलिन स्राव5,10,11,12खो देते हैं. फिर भी, छद्मइस्लेट ने उसी संस्कृति अवधि5के बाद देशी आइलेट्स की तुलना में ग्लूकोज के जवाब में पहले चरण इंसुलिन स्राव के बेहतर संरक्षण का प्रदर्शन किया। इंसुलिन स्राव के बेहतर संरक्षण होने के अलावा, कम लगाव प्लेटों में मानव आइलेट कोशिकाओं के आकार-नियंत्रित पुनर्समूहीकरण11 में उनके reaggregation से पहले lentivirus वैक्टर लागू करने का अवसर प्रदान करता है छद्म-इस्लेट। कई अध्ययनों से lentiviral मध्यस्थता transduction के साथ संयुक्त pseudoislets की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है. Caton एट अल13 की सूचना दी है कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की शुरूआत (GFP) lenivirus व्यक्त इंसुलिन स्राव पर थोड़ा प्रभाव पड़ा है, जबकि चूहे pseudoislets में GFP की समरूप अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के गैर संक्रमित नियंत्रण के साथ तुलना में. उन्होंने यह भी connexins 32, 36, और 43 lentivirus13के माध्यम से overexpressing द्वारा इंसुलिन स्राव पर विभिन्न connexins के विशिष्ट प्रभाव का प्रदर्शन किया. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 96-वेल अल्ट्रा-कम आसक्मेंट प्लेट के साथ तैयार किए गए मानव छद्म-पत्रों ने दिखा दिया कि ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर SIX3 के lentiviral-मध्यस्थ overexpression स्थैतिक ऊष्मायन14द्वारा मूल्यांकन इंसुलिन स्राव में सुधार करता है। हाल ही में, एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट के साथ तैयार मानव pseudoislets lentiviral लघु hairpin आरएनए (shRNA) के माध्यम से glucokinase को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया सिद्धांत के एक सबूत के रूप में दिखाने के लिए कि ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन स्राव कम हो जाता है, जबकि केसीएल प्रेरित इंसुलिन स्राव को संरक्षित किया गया था5. अध्ययन में यह भी प्रदर्शित किया गया है कि मानव छद्मरूप जीन अभिव्यक्ति और स्रावी प्रोफाइल में देशी आइलेट्स के समान हैं, जो इसलेट फंक्शन5के विनियमन को विभाजित करने के लिए मानव छद्म-इस्लेट की उपयोगिता का समर्थन करते हैं। हालांकि perifusion प्रदर्शन नहीं किया गया था, एक bioengineered microwell संस्कृति प्लेट है कि हाल ही में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गया, भी lentiviral transduction के लिए संगत होने की सूचना दी और मानव छद्म islets कि उत्कृष्ट इंसुलिन का प्रदर्शन किया प्रत्यारोपण के बाद इन विट्रो और विवो में स्राव11| सामूहिक रूप से, मसूरीवायरल ट्रांसडक्शन के साथ संयुक्त मानव स्यूडोइसलेट गठन मानव आइलेट पैथोफिजियोलॉजी की जांच करने के लिए एक सरल और कुशल दृष्टिकोण है, जो मानव आइलेट्स में मशीनी अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।

वर्तमान रिपोर्ट में, दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लेटफार्मों का उपयोग कर के lentivirus के साथ ट्रांसड्यूस ट्रांसड्यूस के साथ ट्रांसड्यूस के साथ ट्रांसड्यूसर बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल, एक 96-वेल अल्ट्रा कम लगाव प्लेट और एक माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट प्रस्तुत की है। दोनों जीन अभिव्यक्ति के कुशल मॉडुलन को प्राप्त करने और मानव pseudoislets कि स्थिर ऊष्मायन और perifusion सहित बहाव आकलन के लिए संगत कर रहे हैं बनाएँ.

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Protocol

अध्ययन शुरू करने से पहले, एक मानव विषयों अनुसंधान दृढ़ संकल्प आयोवा संस्थागत समीक्षा बोर्ड, जो निर्धारित किया है कि अध्ययन मानव विषयों अनुसंधान के लिए मानदंडों को पूरा नहीं किया विश्वविद्यालय द्वारा किया गया था. अध्ययन की शुरुआत से पहले स्थानीय समीक्षा बोर्ड से परामर्श करें यह निर्धारित करने के लिए कि क्या आइलेट्स और योजनाबद्ध अध्ययन के स्रोत को पूर्व अनुमोदन की आवश्यकता है।

नोट: आमतौर पर, मानव आइलेट्स के 1,200 डिग्री 1,400 आइलेट समतुल्य (IEQ) के गठन के लिए आवश्यक हैं 192 pseudoislets के आकार में 3,000 कोशिकाओं / माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट. आवश्यक islets के IEQ दाता कारकों (आयु, स्वास्थ्य, वजन), अलगाव दक्षता, और संस्कृति की स्थिति एकल सेल निलंबन की उपज को प्रभावित के रूप में मानव islets के विभिन्न तैयारियों के बीच बदलता है. इस प्रोटोकॉल में, ब्याज के एक जीन को लक्षित shRNA युक्त lentivirus प्रयोग किया जाता है. साइटोमेगागोवायरस (सीएमवी) और मानव फॉस्फोग्लिसेरेट किनेस (एचपीजीके) प्रमोटर आधारित लेन्टीवायरल वेक्टर्स को मानव स्यूडोइस्लेट5,15में कुशलता से जीन को नियंत्रित करने के लिए सूचित किया जाता है। लेन्टीवायरस के उपयोग के लिए सावधानी बरतने की आवश्यकता होती है क्योंकि बायोहैर्ड16. lentivirus के उपयोग की शुरुआत से पहले स्थानीय जैव सुरक्षा समिति से संपर्क करें.

1. जहाज के बाद वसूली के लिए मानव Islets की रात भर संस्कृति

  1. कनॉट मेडिकल रिसर्च लेबोरेटरीज 1066 (सीएमआरएल-1066) मध्यम 1% मानव सीरम एल्बुमिन (एचएसए) को सीएमआरएल-1066, एचएसए के 0.5 ग्राम, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 0.5 एमएल और 100 एमजीएल के 0.5 एमएल/एचएसएल (100 एमजीएल) एचएसए के 50 एमएल के संयोजन से तैयार करें। सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) और नसबंदी के लिए एक 0.2 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से गुजर रहा है।
  2. निलंबन में islets रखने के लिए धीरे से शिपिंग बोतल घूमता है। शिपिंग माध्यम को एक 50 एमएल शंकु अपकेंद्रण ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें आइलेट्स होते हैं। ट्यूब को बीएससी में 15 मिनट के लिए बैठने दें ताकि आइलेट्स ट्यूब के नीचे तक बैठ जाएं।
  3. एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग कर आइलेट गोली परेशान बिना शिपिंग मध्यम धीरे निकालें. 400 IEQ/mL की एकाग्रता के लिए 1% HSA CMRL में आइलेट गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. स्थानांतरण एक गैर ऊतक संस्कृति इलाज पकवान में islets. यदि islets कई व्यंजन में विभाजित कर रहे हैं, विभाजन से पहले धीरे घूमता द्वारा मध्यम में समान रूप से निलंबित islets रखें. संस्कृति एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर islets.
    नोट: एक गैर ऊतक संस्कृति इलाज पकवान का उपयोग करने के लिए थाली के लिए islets के लगाव को रोकने की आवश्यकता है.

2. मानव आइलेट से एकल सेल निलंबन की तैयारी

  1. निम्नलिखित तैयार करें: सीएमआरएल-1066 मध्यम 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (HiFBS), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और ग्लूटामाइन (10% HiFBS CRML) कमरे के तापमान पर (आरटी), एक 40 डिग्री मीटर छलनी, एक 35 मिमी पेट्री डिश, एक 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज, और एक हेमोसाइटोमेट्री।
  2. रात भर की संस्कृति के बाद मानव islets स्थानांतरण एक 15 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में. एक झूलते-बकेट रोटर में 5 मिनट के लिए 190 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। आइलेट गोली परेशान किए बिना एक 5 एमएल पिपेट के साथ Aspirate मध्यम।
  3. ट्यूब में फॉस्फेट-बफरेड नमकीन (पीबीएस) के 10 एमएल जोड़कर गोली को धो लें, धीरे से मिलाएं, और 5 मिनट के लिए 190 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें। एसपिरेट पीबीएस को आईएसलेट गोली को परेशान किए बिना।
  4. आइलेट मिश्रण करने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग कर एक पूर्व-वार्म्ड प्रोटीओलिटिक और कोलेजोलिटिक एंजाइम मिश्रण और पिपेट 5x के 0.5 एमएल में आइलेट गोली को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ऊपर और नीचे धीरे से पाइपिंग द्वारा मिश्रण 1 $5 बार।
    नोट: आक्रामक पाइपिंग सेल हानि में वृद्धि होगी।
  5. बादलपन (एकल कोशिकाओं) और गुच्छे की संख्या (अपाच्य आइलेट्स) के लिए जाँच करें। बादल और गुच्छे की संख्या द्वारा निर्णय लिया पाचन की सीमा के आधार पर 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के लिए 2 $3 मिनट जोड़ें। पाचन बंद करो जब गुच्छे predigestion के 10% करने के लिए कम कर रहे हैं और समाधान बादल है.
    नोट: पाचन के लिए आवश्यक समय प्रत्येक मानव islet तैयारी के islet आकार वितरण के आधार पर अलग है.
  6. एक 35 मिमी पेट्री डिश में एक 40 डिग्री मीटर छलनी प्लेस और 10% HiFBS CMRL के 1 एमएल जोड़कर और 1 एमएल सिरिंज प्लंजर के साथ दबाने से छलनी गीला. छलनी के शीर्ष पर सभी सेल निलंबन स्थानांतरण और एक ताजा 15 एमएल ट्यूब में पास के माध्यम से इकट्ठा।
  7. बचे हुए कोशिकाओं को इकट्ठा करने और छलनी के माध्यम से धोने पारित करने के लिए ताजा सीएमआरएल माध्यम के 0.5 एमएल के साथ इस्लेट पाचन के लिए इस्तेमाल किया ट्यूब धो लें। 15 एमएल ट्यूब में पास-थ्रू को संयोजित करें। एक बार दोहराएँ.
  8. इसके बाद, 1 एमएल सीरिंज प्लंजर के साथ 35 मिमी डिश में रखे हुए छलनी को दबाकर छलनी पर शेष अलग-अलग आइसेट्स। पास-थ्रू को फिर से एकत्र करें और छलनी और डिश से सभी शेष पचे हुए आइलेट्स को हटाने के लिए नए सीएमआरएल-1066 के साथ छलनी को धो लें। एकल सेल निलंबन की कुल $ 3 एमएल अब 15 एमएल ट्यूब में होगा।
  9. सेल निलंबन की कुल मात्रा रिकॉर्ड करें और एक हीमोसाइटमापी पर सेल संख्या की गणना करने के लिए कोशिकाओं के 10 डिग्री एल एलिकोट लें।
  10. 200 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें . गोली परेशान किए बिना माध्यम निकालें. 3.1.1 कदम अगर एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट या चरण 3.2.1 का उपयोग कर अगर एक 24 अच्छी तरह से microwell संस्कृति प्लेट का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं reaggregate.

3. Lentivirus द्वारा Pseudoislet गठन और Transduction

  1. प्रोटोकॉल एक 96-वेल अल्ट्रा कम अनुलग्नक प्लेट का उपयोग कर
    1. प्रति स्यूडोइस्लेट कक्षों की वांछित संख्या और बनाने के लिए छद्म islets की संख्या निर्धारित करें. आमतौर पर, 1,000 डिग्री 3,000 कोशिकाओं को एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट के लिए प्रत्येक pseudoislet के लिए उपयोग किया जाता है. प्रति 3,000 कोशिकाओं के लिए, सेल निलंबन को समायोजित 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल को 10% HiFBS CMRL में चरण 2.10 से आइलेट गोली को फिर से समायोजित करके समायोजित करें ताकि सेल निलंबन के 30 $L में 3,000 सेल हो। निम्न समीकरण का उपयोग करके आवश्यक एकल कक्ष निलंबन (mL) के 1 x 105 कक्षों/mL की कुल मात्रा की गणना करें:
      एकल सेल निलंबन (एमएल) के 1 x 105 सेल की कुल मात्रा (mL) - (प्रति छद्म islet कोशिकाओंकी संख्या) x (स्यूडोइस्लेट की संख्या) /
      नोट: प्रति स्यूडोइसेलेट कोशिकाओं की वांछित संख्या के आधार पर सेल निलंबन की सांद्रता समायोजित करें ताकि 30 डिग्री सेल्सियस सेल निलंबन एक छद्म इस्लेट बनाता है।
    2. एक ताजा सेल निलंबन के एक ताजा 15 एमएल ट्यूब के लिए आवश्यक मात्रा (30 डिग्री एल एक्स संख्या छद्म islets की संख्या) स्थानांतरण। ब्याज या नियंत्रण के एक जीन को लक्षित shRNA युक्त lentivirus की 250 transduction इकाइयों (टीयू)/
      चेतावनी: Lentivirus जैव सुरक्षा स्तर 2 के रूप में वर्गीकृत किया गया है और संक्रमित कोशिकाओं के डीएनए में एकीकृत किया जा सकता है.
      नोट: केंद्रित lentivirus का उपयोग करें ताकि lentivirus जोड़ा की मात्रा कम से कम है. कुशल जीन silencing के लिए प्रति सेल आवश्यक टिटर lentiviral निर्माण के आधार पर अलग हो सकता है.
    3. एक P1000 पिपेट के साथ धीरे 5x pipeting द्वारा वायरस के साथ सेल निलंबन मिक्स. एक 8 चैनल पिपेट का उपयोग कर अगर एक 50 एमएल बाँझ अभिकर्मक जलाशय में मिश्रित कोशिकाओं स्थानांतरण।
    4. कुओं की संख्या के आधार पर एक 8-चैनल पिपेट या एक P200 पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से lentivirus के साथ मिश्रित एकल सेल निलंबन की अच्छी तरह से प्रति 30 डिग्री एल वितरित करें।
    5. 7 मिनट के लिए आरटी पर 270 x ग्राम पर एक झूलते-बकेट प्लेट सेंट्रीफ्यूज में 96-वेल प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें, जांच करें कि क्या कोशिकाओं को प्रत्येक कुएं के केंद्र में इकट्ठा किया जाता है। यदि नहीं, तो अच्छी तरह से के केंद्र में सभी कोशिकाओं के जमाव के रूप में फिर से अपकेंद्रण छद्म इस्लेट गठन के लिए महत्वपूर्ण है। एक humidified 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति रात भर.
    6. बाद की संस्कृति के दौरान कोशिकाओं के सुखाने से बचने के लिए अगली सुबह प्रति अच्छी तरह से 10% HiFBS CMRL के 100 $L जोड़ें। 270 x gपर सेंट्रीफ्यूज , आरटी के लिए 7 मिनट संस्कृति पर 37 डिग्री सेल्सियस में एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर। Pseudoislets 5 "7 दिनों में गठन पूरा हो जाएगा.
    7. छद्म इस्लेट की कटाई करते समय, 10% HiFBS CMRL (100 $L प्रति आइलेट) की वांछित मात्रा को प्री-वार्म करें, एक 50 एमएल बाँझ जलाशय, एक बाँझ 10 सेमी पेट्री डिश, और बीएससी में एक 8-चैनल पिपेट तैयार करें।
    8. इनक्यूबेटर से 96-वेल प्लेट निकालें और बीएससी में रखें। एक जलाशय में 10% HiFBS CMRL के प्रति आइलेट 100 $L पिपेट।
    9. पिपेट 100 $L प्रति अच्छी तरह से 10% HiFBS CMRL एक जलाशय से छद्म islets और pipette ऊपर और नीचे 2 "3 बार धीरे से अच्छी तरह से ऊपर उठाने के लिए islets ऊपर. फिर, एक छद्म islet युक्त अच्छी तरह से में aspirate माध्यम और एक 10 सेमी पेट्री डिश में बाहर निकालना. एक 8 चैनल पिपेट का उपयोग एक समय में 8 pseudoislets के हस्तांतरण की अनुमति देता है.
    10. सभी छद्म आइलेट को पूरी तरह से हटाने सुनिश्चित करने के लिए एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे प्लेट की जांच करें। कूटाकार फर्म समुच्चय बनाते हैं और उठाने के बाद एकत्रित रहते हैं। छद्म-लेटअब डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए तैयार हैं।
  2. एक 24 अच्छी तरह से microwell संस्कृति प्लेट का उपयोग प्रोटोकॉल
    1. कुशल अफ़ीमाइड गठन के लिए आरटी के लिए विरोधी पालन कुल्ला समाधान (सामग्रीकीतालिका) को गर्म करें। इसके अलावा, प्री-वार्म मैदान सीएमआरएल-1066 और 10% HiFBS CMRL।
    2. 24-वेल माइक्रोवेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कूप के लिए प्रति अच्छी तरह से 500 $L जोड़ें, जिसे छद्म-इस्लेट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक झूलते-बकेट प्लेट अपकेंद्रण में 5 मिनट के लिए 1,300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि वायु के बुलबुले माइक्रोवेल्स से हटा दिए जाएं, एक सूक्ष्मदर्शी के नीचे प्लेट का प्रेक्षण कीजिए। यदि वायु बुलबुले माइक्रोवेल्स में फंस जाते हैं, तो 5 मिनट के लिए फिर से 1,300 x ग्राम पर अपकेंद्रण।
    4. बीएससी में कुओं से प्रतिपक्षीय rinsing समाधान प्रेरित. गर्म सादे CMRL-1066 के 2 एमएल के साथ एक अच्छी तरह से एक बार कुल्ला. Aspirate CMRL-1066. उपयोग के लिए योजना बनाई प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए गर्म 10% HiFBS CMRL की 0.5 एमएल / अच्छी तरह से जोड़ें। कुओं अब चरण 2.10 में तैयार बिखरे मानव आलेट कोशिकाओं को लोड करने के लिए तैयार हैं।
    5. प्रत्येक कुएं के लिए आवश्यक कक्षों की कुल संख्या निर्धारित करें. 24-वेल माइक्रोवेल कल्चर प्लेट में से एक में 1,200 माइक्रोवेल्स होते हैं और 1,200 स्यूडोइसेलेट होते हैं। 500 कोशिकाओं प्रति छद्म इस्लेट x 1200 microwells - 6 x 105 कोशिकाओं. एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में 10% HiFBS CMRL के 0.8 एमएल में चरण 2.10 से 6 x 105 कोशिकाओं के लिए एकल कोशिकाओं को पुन: निलंबित।
      नोट: प्रति अच्छी तरह अधिकतम मात्रा 2 एमएल है। सेल निलंबन की मात्रा 1.5 एमएल से अधिक नहीं होनी चाहिए। प्रोटोकॉल lentivirus द्वारा ट्रांसड्यूस ट्रांसड्यूस की एक अच्छी तरह से बनाने के लिए कदम का वर्णन करता है. प्रत्येक lentivirus के लिए किए जाने वाले कुओं की संख्या के आधार पर स्केल करें।
    6. वायरल transduction के लिए, एकल सेल निलंबन के लिए 125 टीयू / वायरस की मात्रा 0.2 एमएल से नीचे रखें। चरण 3.2.8 में कोशिकाओं के संघनन से पहले वायरस के साथ कोशिकाओं के संपर्क की अनुमति देने के लिए 1 h के लिए कभी-कभी कोमल मिश्रण के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल और वायरस मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
      नोट: केंद्रित lentivirus का उपयोग करें ताकि lentivirus जोड़ा की मात्रा कम से कम है. प्रोटोकॉल 1 की तुलना में प्रोटोकॉल 2 के लिए टीयू की निम्न संख्या का उपयोग किया जाता है क्योंकि प्रति सेल संख्या माध्यम की कुल मात्रा कम है। हालांकि, कुशल जीन silencing के लिए प्रति सेल की आवश्यकता titer lentiviral निर्माण और अनुकूलन की जरूरत के आधार पर अलग हो सकता है.
      चेतावनी: Lentivirus जैव सुरक्षा स्तर 2 के रूप में वर्गीकृत किया गया है और संक्रमित कोशिकाओं के डीएनए में एकीकृत किया जा सकता है.
    7. 1 ज के बाद, 10% HiFBS CMRL जोड़कर islet सेल और वायरस मिश्रण की कुल मात्रा को 1 एमएल में समायोजित करें। यदि कोशिकाएं 1 ज ऊष्मायन के बाद झुरमुट बनाती हैं, तो कोमल और त्वरित पाइपिंग 2 "3 बार) द्वारा एकल सेल निलंबन में फैलाने के लिए। माइक्रोवेल्स में कोशिकाओं के वितरण के लिए पाइपिंग बहुत महत्वपूर्ण है। 24-वेल माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट में से एक के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण।
    8. पाइपिंग के तुरंत बाद, सभी माइक्रोवेल्स में कोशिकाओं को पकड़ने के लिए आरटी में 3 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। यह सत्यापित करने के लिए सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत प्रेक्षण कीजिए कि कोशिकाएं सभी माइक्रोवेल्स में समान रूप से वितरित की जाती हैं।
    9. एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट संस्कृति। Pseudoislets में फार्म का होगा 24 डिग्री 48 ज. Pseudoislets अप करने के लिए 7 दिनों के लिए मध्यम परिवर्तन के बिना सुसंस्कृत किया जा सकता है.
    10. जब 7 दिनों से परे संस्कृति के लिए माध्यम बदल रहा है, प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के लिए माध्यम के 50% की जगह के रूप में इस प्रकार है. धीरे धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से एक P1000 pippette का उपयोग कर मध्यम के 0.5 डिग्री 1 एमएल निकालें. माइक्रोवेल कल्चर प्लेट से छद्म आइसोलेट को अलग करने से बचने के लिए कुएं की दीवार पर टिप रखकर 0.5 डिग्री एमएल ताजा 10% HiFBS CMRL को धीरे-धीरे जोड़ें।
    11. छद्म इस्लेट की कटाई के लिए तैयार करने के लिए, 10% HiFBS CMRL माध्यम को गर्म करें। Pseudoislets सीरम मुक्त CMRL-1066 में तैरने के लिए यह मुश्किल उन्हें लेने के लिए कर रहे हैं.
    12. एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके मध्यम से 0.5 एमएल का उपयोग करें और माइक्रोवेल कल्चर प्लेट से छद्म आइलेट को उठाने के लिए मीडिया को बलपूर्वक प्लेट सतह पर लेटाएं।
    13. 1 एमएल पिपेट और ट्रांसफर आइलेट्स का उपयोग करके धीरे-धीरे एसपिरेट डिस्लॉज्ड स्यूडोइसेलेट को एक गैर-ऊतक संस्कृति में 6-वेल प्लेट का इलाज किया जाता है। 15 एमएल शंकुन ट्यूब पर रखे गए एक छोटे से 37 डिग्री मीटर प्रतिवर्ती छन्नी से होकर गुजरती हैं। Pseudoislets फिल्टर पर रहेगा; किसी भी unincorporated एकल कोशिकाओं के माध्यम से प्रवाह होगा.
      नोट: छलनी के माध्यम से छोटे आकार के छद्म रूपों की हानि से बचने के लिए, छलनी को छोड़ दिया जा सकता है।
    14. कुएं की पूरी सतह पर 10% HiFBS CMRL का 1 एमएल वितरित करें ताकि किसी भी शेष छद्म-पत्र, ऐस्पायर डिस्लॉजलेट को उखाड़ दिया जा सके, और छलनी से होकर गुजरें। कुओं से सभी pseudoislets का पूरा संग्रह सुनिश्चित करने के लिए 3x दोहराएँ.
    15. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी छद्म आइलेट एकत्र किए जाते हैं, एक व्युत्क्रम सूक्ष्मदर्शी के नीचे माइक्रोवेल कल्चर प्लेट का प्रेक्षण कीजिए। यदि स्यूडोइसेलेट बने रहते हैं तो चरण 3-2-14 के रूप में धो को दोहराएँ।

4. जीन सिलिंग दक्षता के मूल्यांकन के लिए आरएनए निष्कर्षण

  1. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में RNase मुक्त पीबीएस में pseudoislets उठाओ और 300 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट ्रीफ्यूज। इसलेट गोली परेशान किए बिना पीबीएस निकालें और पीबीएस के साथ एक बार धो लें और 300 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूगेशन के बाद धो लें।
  2. एक P1000 पिपेट का उपयोग कर PBS के अधिकांश Aspirate. फिर, आइलेट गोली परेशान किए बिना पीबीएस के बाकी को दूर करने के लिए एक P10 पिपेट में परिवर्तन।
  3. प्रति ट्यूब गुएनडिनियम थायोसाइनेट आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) की 0.5 एमएल जोड़ें। 2 -3 बार के लिए एक मोटर चालित मूसल का उपयोग कर pseudoislets homogenize. ग्वानिडिनियम थायोसाइनेट आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक में homogenate अब -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या आरएनए शुद्धि के लिए संसाधित किया जा सकता है।
    नोट: माइक्रोवेल कल्चर प्लेट में बने 96 कूप प्लेट में बने 3,000 सेल-स्यूडोइसलेट्स में से 24 या माइक्रोवेल कल्चर प्लेट में बने 500 सेल-स्यूडोइसलेट्स में से 48 आरएनए के 0.5 डिग्री ग्राम को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं।

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Representative Results

चित्र 1 एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट और एक microwell संस्कृति प्लेट का उपयोग कर pseudoislets के उत्पादन में महत्वपूर्ण कदम दिखाता है. चित्र 2क 96-वेल अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट में 3 x 103 मानव आइलेट कोशिकाओं से छद्म आइलेट के गठन के दौरान आकृति विज्ञान में अनुक्रमिक परिवर्तन दर्शाता है। दिन 1 में मनाया कोशिकाओं के मोनोलेयर या ढीले clumps एक चिकनी, गोल सीमा के साथ एक चिकनी, गोल सीमा के साथ ठोस समुच्चय में बदल 5 से 7 (चित्र 2a) . माइक्रोवेल कल्चर प्लेट में ठोस स्यूडोइस्लेट का निर्माण आमतौर पर 4 दिनों के भीतर दिखाई देता है (चित्र2ब)। जब 600 कोशिकाओं/माइक्रोवेल को माइक्रोवेल कल्चर प्लेट में चढ़ाया जाता था, तो मानव आईलेट कोशिकाओं को एकसमान आकार के गोलिभों में संघनित किया जाता था। यह देखा गया है कि एक microwell संस्कृति प्लेट एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट के साथ तुलना में कोशिकाओं की एक छोटी संख्या से pseudoislets के सफल गठन की अनुमति देता है. आमतौर पर, एक 96-वेल अल्ट्रा-लो लगाव प्लेट के लिए 1,500 से अधिक कोशिकाओं/स्यूडोइसलेट की आवश्यकता होती है, जबकि 24-वेल माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट के लिए 500 कोशिकाएं/ सफलतापूर्वक गठित छद्मइस्लेट 96 अल्ट्रा-लो लगाव प्लेट या माइक्रोवेल कल्चर प्लेट से वसूली के बाद स्फीरोइड के रूप में बने रहते हैं और स्थैतिक इनक्यूबेशन सहित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए संगत होते हैं (चित्र 3क) और परिफ्यूजन ( चित्र ) 3ख) कूटिकाओं का एकसमान आकार परीक्षण समूह में भिन्नता को कम करता है और स्थैतिक ऊष्मायन को प्रति माप के रूप में कम से कम 5 छद्म-लेटलता हुआ प्रयोग करने की अनुमति देता है (चित्र 3क) इसके अलावा, मानव pseudoislets मजबूत पहले चरण इंसुलिन स्राव संस्कृति के 7 दिनों के बाद ग्लूकोज के जवाब में बनाए रखा जब मूल मानव islets समय की एक समान अवधि के लिए सुसंस्कृत पहले चरण ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन स्राव दिखाया ( चित्र 3ख)5| एक एकल कोशिका निलंबन में मसूरीवायरस की शुरूआत आइलेट कोशिकाओं के कुशल और समरूप रूपांतरण को सुनिश्चित करती है और चित्र 3कमें दर्शाए अनुसार जीनों के अत्यधिक कुशल डाउन-रेगुलेशन को प्राप्त करती है। दिखाए गए सभी परिणाम गैर मधुमेह दाताओं से मानव islets का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे.

Figure 1
चित्र 1: मानव छद्म निर्देश तैयारी की प्रक्रिया. (क) मानव आइलेट्स के 4,000 आईईक्यू से युक्त निलंबन प्रोटीओलिटिक और कोलेजोलिटिक एंजाइम मिश्रण और हल्के पाइपटिंग द्वारा पाचन के बाद बादल हो जाता है। (ख) फैलाव के बाद मानव आइलेट्स छलनी से होकर गुजरते हैं। छलनी के शीर्ष पर शेष अपाच्य आइलेट्स 1 एमएल सीरिंज प्लंजर का उपयोग करके तितर-बितर हो जाते हैं। (ग, घ) एकल सेल निलंबन के माइक्रोस्कोप छवियों जिसमें 3,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 96-अच्छी अल्ट्रा कम लगाव प्लेट में पहले (ग) और बाद (घ) centrifugation. (ई, च) एकल सेल निलंबन के माइक्रोस्कोप छवियों में 500 कोशिकाओं /माइक्रोवेल युक्त एक 24-वेल माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट में पहले (ई) और बाद में (च) सेंट्रीफ्यूगेशन। स्केल बार ] 250 $m. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: मानव छद्मरूपोंग का रूपविज्ञान। मानव छद्मनिलेट्स की आकृति विज्ञान में अनुक्रमिक परिवर्तन (एक) 3,000 कोशिकाओं से एक 96-वेल अल्ट्रा-लो लगाव प्लेट में और (ख) 500 कोशिकाओं से 24-वेल माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट में । स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: के उदाहरण कार्यात्मक परख मानव छद्म islets का उपयोग कर. (क) प्रतिनिधि स्थैतिक ऊष्मायन प्रति 500 मानव आइलेट कोशिकाओं के आकार में एक दाता से माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट में बनाए गए मानव स्यूडोइस्लेट का उपयोग करते हुए किया जाता है। 5 pseudoislets के चार सेट Krebs-रिंगर बाइकार्बोनेट बफर में 1 एच के लिए incubated या तो 2 एमएम या 16.8 एमएम ग्लूकोज के साथ पूरक थे। प्रत्येक प्रतीक 5 pseudoislets के एक सेट से इंसुलिन स्राव का प्रतिनिधित्व करता है. मतलब - मतलब (SEM) के मानक त्रुटि दिखाया गया है. *, पी एंड एलटी; 0.05 छात्र टी परीक्षा द्वारा। तीन दाताओं से प्रतिनिधि परिणाम. (ख) 16.7 एमएम ग्लूकोज और 30 एमएम केसीएल विधि के जवाब में माइक्रोवेल कल्चर प्लेट में बनाए गए मानव स्यूडोइस्लेट से इंसुलिन स्राव का परीक्षण करने वाले प्रतिनिधि परिफ्यूजन का परीक्षण पहले प्रकाशित किया गया था5. इसका मतलब यह है कि एक ही दाता से माइक्रोवेल कल्चर प्लेट में बनाए गए 40 स्यूडोइस्लेट के दो सेटों से इंसुलिन स्राव का SEM 500 मानव आइलेट कोशिकाओं के आकार में दिखाया गया है। छह दाताओं से प्रतिनिधि डेटा. (ग) छद्म-पत्रों का सृजन मानव ATGL (लक्ष्यCCCTACTATGAGTATAA, बाएँ) या PLIN5 (लक्ष्य GACAAGTGAGAGAGCTT, दाएँ) को लक्षित करने वाले shRNA को लक्षित करने वाले lentivirus के साथ बनाया गया था। नियंत्रण छद्मइस्लेट lenivirus के साथ ट्रांसड्यूस ट्रांसड्यूस थे तले हुए अनुक्रम व्यक्त (Scr) पहले से प्रकाशित5. प्रत्येक जीन की MRNA अभिव्यक्ति वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) द्वारा निर्धारित किया गया था के रूप में पहले प्रकाशित5. डेटा 2-DDCT का उपयोग कर व्यक्त किए गए थे एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में peptidylprolyl Isomerase बी (PPIB) लेने17. प्रत्येक डॉट एक संकेत प्राइमर के लिए प्रत्येक दाता से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है और एक ही दाता से एक डेटा सेट एक पंक्ति से जुड़ा हुआ है. N ] 3 दाताओं. *; पी एंड 0.05 छात्र टी परीक्षा द्वारा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ, मानव pseudoislets कि एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट या एक microwell संस्कृति प्लेट का उपयोग कर lentivirus द्वारा ट्रांसड्यूस कर रहे हैं उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. छद्मरूपों को देशी मानव आइलेट्स के समान आकृति विज्ञान और स्रावी कार्यों को प्रदर्शित करने के लिए सूचित किया गया है और इन्हें विट्रो5,11,18में लंबे समय तक सुसंस्कृत किया जा सकता है . देशी मानव आइलेट्स के विपरीत जो आकार में व्यापक भिन्नता दर्शाते हैं, छद्मरूप आकार में अपेक्षाकृत एक समान होते हैं, जिससे दानदाताओं और प्रायोगिक प्रतिकृतिओं के बीच भिन्नता कम होती है5,11. ट्रांसडक्शन की उच्च दक्षता की आवश्यकता वाले जीनों का डाउनरेगुलेशन एकल कोशिका निलंबन में स्यूडोइस्लेट के गठन से पहले आसानी से किया जा सकता है। इस विधि बरकरार islets में कोशिकाओं की परतों के माध्यम से वायरल प्रवेश की कठिनाई से बचा जाता है. इस प्रकार, मानव pseudoislets के निर्माण के लिए इस सरल, अत्यधिक कुशल, और reproduible प्रोटोकॉल व्यापक अनुप्रयोगों है.

जबकि कई अलग अलग प्लेटफार्मों छद्म12,14,19,20के गठन के लिए सूचित किया गया है , दोनों एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट और एक microwell संस्कृति प्लेट हैं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, इस तकनीक को किसी भी प्रयोगशाला द्वारा अपनाया जा करने की अनुमति. हालांकि फांसी ड्रॉप विधि12 भी आम प्रयोगशाला का उपयोग कर मानव pseudoislets के गठन की अनुमति देता है, संभावित सीमाओं के आकार को नियंत्रित करने में कठिनाई और pseudoislets के reaggregation अवधि शामिल हैं. इन सीमाओं छद्म islet के प्रति ड्रॉप सीमित मात्रा और चल रहे वाष्पीकरण के कारण थे 5 "7 दिन की संस्कृति के दौरान छद्म islet गठन के लिए आवश्यक. इसके अतिरिक्त, यह एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट या फांसी ड्रॉप विधि के साथ तुलना में एक microwell संस्कृति प्लेट के उपयोग के साथ lentivirus शामिल करने के लिए आसान है.

प्रोटोकॉल के भीतर कई चरणों के करीब ध्यान देने की आवश्यकता है. प्रोटीओलिटिक और कोलेजोलिटिक एंजाइम मिश्रण के साथ बरकरार आइलेट्स के पाचन को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है क्योंकि दोनों के तहत और अधिक पाचन एकल सेल निलंबन की उपज को कम करेगा और बाद में छद्म-पत्रों के एकत्रीकरण को प्रभावित करेगा। पाचन के दौरान, clumps के गायब होने और बादल में वृद्धि के लिए बारीकी से निगरानी करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में islets एकल कोशिकाओं में अलग. यह ध्यान दें कि पाचन के लिए इष्टतम समय विभिन्न दाताओं से islets के बीच बदलता है महत्वपूर्ण है. इष्टतम समय चिकित्सा इतिहास और प्रत्येक दाता की उम्र सहित कई कारकों पर निर्भर है, ischemia समय की लंबाई, आइलेट अलगाव प्रक्रिया का इस्तेमाल किया, आइलेट आकार, आइलेट शुद्धता, आइलेट व्यवहार्यता, और शिपिंग शर्तों. आमतौर पर, 80% से अधिक व्यवहार्यता और शुद्धता के साथ मानव islets और अलगाव के 5 दिनों के भीतर उपयोग किया जाता है. फैलाव के दौरान सावधान और कोमल पाइपिंग सेल व्यवहार्यता और वसूली को बनाए रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है जो अंततः सेल एकत्रीकरण और छद्म आइलेट के अंतिम आकार को प्रभावित करेगा। जब कुओं के लिए islet सेल निलंबन वितरण (कदम 3.1.4 और 3.2.7), कोमल और कोशिकाओं की पूरी तरह से मिश्रण microwells में एकल कोशिकाओं की एक भी वितरण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. यदि कोशिकाएं lentivirus के साथ 1 h ऊष्मायन के बाद clumps फार्म, यह कोमल pipeting की आवश्यकता है एकल सेल निलंबन में अंतिम centrifugation से पहले clumps तोड़ने के लिए.

हम दोनों एक 96 अच्छी तरह से थाली और microwell संस्कृति प्लेट का उपयोग कर lentiviral transduction के बाद मानव pseudoislets बनाने में इसी तरह की सफलता मिली है. दो प्लेटफार्मों के बीच चुनाव वांछित pseudoislets के आकार और संख्या पर निर्भर करता है। एक microwell संस्कृति प्लेट छोटे, पिरामिड के आकार के नीचे एक 96 अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट के साथ तुलना में कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के संघनन की अनुमति है. इस प्रकार, एक microwell संस्कृति प्लेट के लिए प्रति pseudoislet कोशिकाओं की संख्या को कम किया जा सकता है. इसके अलावा, एक एकल centrifugation कदम एक microwell संस्कृति प्लेट में एक साथ सभी pseudoislets बनाता है, जबकि एक 96 अच्छी तरह से थाली में छद्म पाइपिंग बनाने के लिए आवश्यक है. इस प्रकार, एक microwell संस्कृति प्लेट में pseudoislets के निर्माण स्केलिंग आसान है. हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट बनाया जा रहा है pseudoislets की संख्या में लचीलापन प्रदान नहीं करता है. वर्तमान में, एक microwell संस्कृति प्लेट का उपयोग कर बनाया pseudoislets की न्यूनतम संख्या 1,200 है और केवल 1,200 के कारक द्वारा बढ़ाया जा सकता है. इस प्रकार, हम आम तौर पर छोटे पैमाने पर पायलट प्रयोगों के लिए और एक प्रयोग है जिसमें नमूनों की छोटी मात्रा इस तरह के एक इंसुलिन स्राव परख और जीन अभिव्यक्ति के लिए आरएनए निष्कर्षण के रूप में पर्याप्त है के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करें. हम परख के लिए एक microwell संस्कृति प्लेट से pseudoislets का इस्तेमाल किया है कि इस तरह के पश्चिमी धब्बा के रूप में कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है, एक चयापचय विश्लेषक द्वारा ऑक्सीजन की खपत दर निर्धारण, और ट्राइग्लिसराइड निष्कर्षण.

मानव छद्म islets की पीढ़ी के लिए प्रमुख सीमित कारक एकल सेल निलंबन की तैयारी के दौरान कोशिकाओं की हानि है. जबकि मानव आइलेट के 1 IEQ के आसपास 2,000 कोशिकाओं को शामिल करने के लिए माना जाता है, एकल सेल निलंबन की वसूली आम तौर पर 30% या कम कई धोने और एक छलनी के माध्यम से गुजर के कारण है. आइलेट के आकार की विषमता भी सभी आइलेट्स को एक साथ अलग करने में कठिन हो जाती है। जबकि कोमल pipeting और प्रोटोकॉल में proteolytic और collagenolytic एंजाइम मिश्रण का उपयोग एकल कोशिकाओं की अधिकतम वसूली के लिए यांत्रिक और एंजाइमी बलों गठबंधन करने के प्रयास कर रहे हैं, वहाँ अभी भी कोशिकाओं का एक अनिवार्य नुकसान है. इस प्रकार, pseudoislets के आवेदन बरकरार मानव islets के अध्ययन पर स्पष्ट औचित्य की आवश्यकता है. यह भी याद दिलाया जाना चाहिए कि छद्मइलेट से इंसुलिन स्राव समय की इसी अवधि के लिए सुसंस्कृत आइलेट्स की तुलना में अधिक मजबूत होता है , लेकिन ताजा पृथक आइलेट्स5,11की तुलना में कम होता है .

हालांकि सीमाएं मौजूद हैं, स्थिर और अत्यधिक कुशल जीन संस्कृति में लंबे समय तक के लिए ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन स्राव के बेहतर संरक्षण के साथ संयुक्त silencing मानव आइलेट कोशिकाओं में जीन समारोह के आकलन को सक्षम. इसके अतिरिक्त, बीटा-बीटा और बीटा-गैर बीटा कोशिकाओं के बीच जटिल अंतरकोशिकीय संचार को इस्लेट समारोह में एक नियामक भूमिका का प्रस्ताव है। हालांकि, वर्तमान में मानव आइलेट्स के भीतर अंतरकोशिकीय संचार के बारे में सीमित जानकारी है। सेल विशिष्ट मार्करों21की बढ़ती उपलब्धता के साथ, यह परिभाषित सेल संरचना के साथ मानव छद्म islets बनाने के लिए संभव है, के रूप में हाल ही में माउस आइलेट कोशिकाओं में रिपोर्ट22,जो सेल सेल की बेहतर समझ की सुविधा होगी मानव आलेट कोशिकाओं के बीच संचार. तीन आयामी ऊतकों की इमेजिंग की हाल ही में प्रगति भी संभावित कैसे सेलुलर polarity और intercellular संचार मानव islets में विनियमित कर रहे हैं बेनकाब करने के लिए एक मॉडल के रूप में मानव pseudoislets की उपयोगिता बढ़ जाती है. इस प्रकार, मानव छद्म-विज्ञान एक उपयोगी मॉडल प्रदान करते हैं जो आइलेट जीव विज्ञान के क्षेत्र में रुचि के जीनों और अन्य प्रश्नों के प्रचलनों को विभाजित करता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम वित्तीय रूप से Y.I. (R01-DK090490) और अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन को Y.I. (1-17-IBS-132) के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था. जे.ए. और Y.I. ईगल्स मधुमेह अनुसंधान केंद्र के भाईचारे के आदेश द्वारा समर्थित हैं. ए.बी. स्वास्थ्य प्रशिक्षण अनुदान के एक राष्ट्रीय संस्थान (T32NS45549) द्वारा समर्थित है. लेखकों मानव अग्नाशय islets NIDDK द्वारा प्रदान की-वित्त पोषित एकीकृत आइलेट वितरण कार्यक्रम (IIDP) आशा के सिटी में (2UC4DK098085).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-adherence rinsing solution Stemcell technologies 7919
Biological safety cabinet Thermo Scientific 1300 Series Type A2
Cell strainer, 40 micrometer Corning 431750
CMRL-1066 ThermoFisher 11530037
CO2 incubator Thermo Scientific Heracell VIOS 160i
Conical centrifuge tube, 15 mL VWR 89039-666
Conical centrifuge tube, 50 mL VWR 89039-658
Fetal bovine serum ThermoFisher 26140079
Guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent ThermoFisher 15596026 Trizol
Glutamine ThermoFisher 25030164
Hemocytometer Marien Feld Neubauer-Improved Bright line
Human serum albumin Sigma A1653
Inverted microscope Fisher brand 11-350-119
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 20
Microcentrifuge tube, 1.5 mL USA Scientific 1615-5500
Microwell culture plate Stemcell technologies 34411 Aggrewell 400, 24 well
Motor-driven pestle GAMUT #399X644
Non-tissue culture treated dish, 10 cm Fisher Scientific FB0875713
PBS ThermoFisher 14190250
Penicillin-streptomycin ThermoFisher 10378016
Petri dish, 35 mm Celltreat 229638
Pipette, 5 mL DOT Scientific, 667205B
Pipette, 8-channel VWR #613-5253
Pipette, 10 mL VWR 667210B
Pipette, P10 Denville UEZ-P-10
Pipette, P200 Denville UEZ-P-200
Pipette, P1000 Denville UEZ-P-1000
Proteolytic and collagenolytic enzyme mixture Sigma A6965 Accutase
Reagent reservoir, 50 mL VWR 89094-680
Reversible strainer, 37 micrometer Stemcell technologies 27251
Swing bucket plate centrifuge Beckman Coulter Allegra X-14R
Swing bucket rotor Beckman Coulter SX4750A
Tuberculin syringe, 1 mL BD 309659
Ultra low attachment microplate, 96 well Corning 4515

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References

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जेनेटिक्स अंक 147 shRNA lentivirus इंसुलिन स्राव संस्कृति एकल कोशिका पुनर्समूहन
Lentiviral मध्यस्थता जीन Silencing में मानव Peudoislet कम अनुलग्नक प्लेट्स में तैयार
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