Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersøgelse af organelle dynamik i B-celler under dannelse af immun synapse

Published: June 1, 2019 doi: 10.3791/59621
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 1
1Laboratory of Immune Cell Biology, Department of Cellular and Molecular Biology, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Faculty of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Centro de Investigaciones en Biología Celular y Biomedicina, Facultad de Ciencia, Universidad San Sebastián
* These authors contributed equally

Summary

Heri beskriver vi to tilgange til at karakterisere celle polariserings hændelser i B-lymfocytter under dannelsen af en IS. Den første, omfatter kvantificering af organelle rekruttering og cytoskelet rearrangementerne på den synaptiske membran. Den anden er en biokemisk tilgang, at karakterisere ændringer i sammensætningen af centrosome, som gennemgår polarisering til immun synapse.

Abstract

Anerkendelse af overflade bundet antigener ved B-celle receptoren (BCR) udløser dannelsen af en immun synapse (IS), hvor både signalering og antigen optagelse koordineres. Er dannelse indebærer dynamisk actin remodeling ledsaget af polariseret rekruttering til den synaptiske membran af centrosome og associerede intracellulære organeller såsom lysosomer og Golgi apparat. Indledende stadier af actin remodeling tillade B-celler at øge deres celleoverfladen og maksimere mængden af antigen-BCR komplekser indsamlet ved synapse. Under visse betingelser, når B-celler genkende antigener forbundet til stive overflader, denne proces er koblet til den lokale rekruttering og sekretion af lysosomer, som kan lette antigen ekstraktion. Uptaget antigener internaliseret i specialiserede endo-lysosome rum til forarbejdning til peptider, som er lastet på større komplekse Complex II (MHC-II) molekyler for yderligere præsentation til T hjælper celler. Derfor er at studere organelle dynamik forbundet med dannelsen af en er afgørende for at forstå, hvordan B-celler er aktiveret. I denne artikel vil vi diskutere både billeddannelse og en biokemisk teknik, der anvendes til at studere ændringer i intracellulære organelle positionering og cytoskelet rearrangementerne, der er forbundet med dannelsen af en er i B-celler.

Introduction

B-lymfocytter er en essentiel del af det adaptive immunsystem, der er ansvarligt for at producere antistoffer mod forskellige trusler og invaderende patogener. Effektiviteten af antistof produktionen bestemmes af B-cellernes evne til at erhverve, bearbejde og præsentere antigener, der opstår enten i en opløselig eller overflade bundet form1,2. Anerkendelse af antigener knyttet til overfladen af en præsentations celle, som BCR, fører til dannelsen af en tæt intercellulære kontakt betegnes som3,4. Inden for denne dynamiske platform finder både BCR-afhængige downstream-signalering og internalisering af antigener i endo-lysosome-rum sted. Optaget antigener behandles og samles på MHC-II molekyler og efterfølgende præsenteret for T-lymfocytter. Produktive B-T-interaktioner, betegnet B-T-celle samarbejde, tillader B-lymfocytter at modtage de relevante signaler, som fremmer deres differentiering i antistof producerende plasmaceller eller hukommelsesceller8.

To mekanismer har været involveret i antigen ekstraktion med B-celler. Den første er afhængig af udskillelsen af proteaser, der stammer fra lysosomer, som gennemgår rekruttering og fusion på den synaptiske kløft5,6. Den anden, afhænger af myosin IIa-medierede trækkræfter, der udløser indkrængning af antigen indeholdende membraner, som er internaliseret i clathrin-belagte Gruber7. Tilstanden af antigen ekstraktion afhænger af de fysiske egenskaber af membranen, hvor antigener er fundet. Ikke desto mindre, i begge tilfælde, B-celler gennemgår to store remodeling begivenheder: actin cytoskelet reorganisation og polarisering af organeller til is. Actin cytoskelet remodeling involverer en indledende spredning fase, hvor actin-afhængige fremspring på den synaptiske membran øge overfladen i kontakt med antigenet. Dette efterfølges af en sammentrækning fase, hvor bcrs kombineret med antigener er koncentreret i midten af er ved samordnet handling af molekylære motorer og actin cytoskelet remodeling8,9,10, 11. polarisering af organeller er også afhængig af remodeling af actin cytoskelet. For eksempel bliver centrosome koblet fra kernen, ved lokal depolymerisering af associeret actin, som gør det muligt at repositionere denne organelle til is5,12. I B-celler, repositionering af centrosome til en celle pol (IS) guider lysosomet rekruttering til den synaptiske membran, som ved sekretion kan lette udvinding og/eller forarbejdning af overflade bundet antigener6. Lysosomer rekrutteret på IS er beriget med MHC-II, som favoriserer dannelsen af peptid-MHC-II-komplekser i endosomale rum, der skal præsenteres for T-celler13. Desuden er Golgi-apparatet også blevet observeret at være tæt rekrutteret til IS14, hvilket tyder på, at Golgi-afledte vesikler fra sekretoriske pathway kunne være involveret i antigen ekstraktion og/eller forarbejdning.

I alt, intracellulære organelle og cytoskelet rearrangementerne i B-celler under synapse dannelse er de vigtigste skridt, der muliggør effektiv antigen erhvervelse og behandling kræves for deres yderligere aktivering. I dette arbejde introducerer vi detaljerede protokoller om, hvordan man udfører billeddannelse og biokemiske analyser i B-celler for at studere den intracellulære remodeling af organeller forbundet med dannelsen af en is. Disse teknikker omfatter: (i) immunofluorescens og billedanalyse af B-celler, der aktiveres med antigen belagte perler og på antigen belagte dæksedler, som giver mulighed for visualisering og kvantificering af intracellulære komponenter, der er mobiliseret til IS, og (II ) isolering af centrosome-berigede fraktioner i B-celler med ultracentrifugering på saccharosegradienter, som gør det muligt at identificere proteiner, der er forbundet med centrosomen, som potentielt er involveret i reguleringen af celle polaritet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: følgende trin blev udført ved hjælp af IIA 1.6 B-celler.

1. B-celle aktivering med antigen belagte perler

  1. Fremstilling af antigen belagte perler
    1. For at aktivere B-celler, brug NH2-perler kovalent belagt med antigen (AG-coated perler), som er tilberedt med 50 μl (~ 20 x 106 perler) af 3 μm NH2-perler med aktivering (BCR-ligand +) eller ikke-aktiverende (BCR-ligand-) antigener.
    2. For IIA 1.6 B-celler anvendes anti-IgG-F (AB ')2 -fragment som BCR-ligand + og anti-IgM-f (AB ')2 eller bovint serumalbumin (BSA) som BCR-ligand-. Hvis du vil aktivere primær B-celler eller IgM+ B-cellelinje, skal du bruge anti-IgM-F (AB ')2 som BCR-LIGAND + og BSA som BCR-ligand-.
      Bemærk: for at undgå binding af ligander til FC-receptoren skal du bruge f (AB ') eller f (AB ')2 -antistoffer i stedet for antistoffer i fuld længde.
    3. For at fortsætte med forberedelsen af AG-belagte perler, Placer perlerne i lav proteinbinding mikrocentrifuge rør for at maksimere perlerne opsving under prøve manipulation. Tilsæt 1 mL 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS) til vask af perler og centrifuge ved 16.000 x g i 5 min. Aspirér supernatanten.
    4. Resuspendér perlerne med 500 μL 8% glutaraldehyd for at aktivere NH2 -grupperne og drej i 4 timer ved stuetemperatur (RT).
      Forsigtig: stamopløsningen af glutaraldehyd bør kun anvendes i en kemisk udsugnings hætte. Følg instruktionerne på sikkerhedsdatabladet (MSDS).
    5. Centrifuger perler ved 16.000 x g i 5 minutter, Fjern glutaraldehyd og vask perlerne tre gange mere med 1 ml 1x PBS.
      Forsigtig: glutaraldehyd opløsningen skal kasseres som farligt kemisk affald.
    6. De aktiverede perler opslæmmes i 100 μL 1x PBS. Prøven kan opdeles i to mikrocentrifuge glas med lav proteinbinding: 50 μL for BCR-ligand + og 50 μL for BCR-ligand-.
    7. Til klargøring af antigen opløsningen anvendes to 2 mL mikrocentrifuge glas med lav proteinbinding, der indeholder 100 μg/mL antigen opløsning i 150 μL PBS: et rør med BCR-ligand + og andet med BCR-ligand-.
    8. Der tilsættes 50 μL aktiverede perlerne opløsning til hvert rør, som indeholder 150 μL antigen opløsning, vortex og roterer natten over ved 4 °C.
    9. Tilsæt 500 μL 10 mg/mL BSA for at blokere de resterende reaktive NH2 -grupper på perlerne, og Roter i 1 time ved 4 °c.
    10. Centrifuge perlerne centrifugeres ved 16.000 x g i 5 minutter ved 4 °c, og supernatanten fjernes. Vask perlerne med kold 1x PBS tre gange mere.
    11. De aktiverede perler opslæmmes i 70 μL 1x PBS.
    12. For at bestemme den endelige koncentration af AG-belagte perler, fortyndes en lille mængde af perler i PBS (1:200) og tælle ved hjælp af en hemocytometer. Opbevar derefter ved 4 °C indtil brug.
      Bemærk: AG-belagte perler må ikke opbevares i mere end 1 måned.
  2. Fremstilling af poly-L-lysin dæksedler
    1. Før B celle aktivering analyse med AG-belagte perler, forberede poly-L-lysin-coated dæksedler (PLL-Cover glider). Brug et 50 mL rør, der indeholder 40 mL 0,01% w/v PLL-opløsning, og Nedsænk de 12 mm-dækplader i opløsningen. Roter natten over på RT.
    2. Coveret skylles med 1x PBS, og lad det tørre på et 24-brønd plade dæksel dækket med paraffin folie. Fortsæt med B-celle aktivering.
  3. B-celle aktivering
    1. For at starte B celle aktivering med perler, først fortynde IIA 1.6 B cellelinje til 1,5 x 106 celler/ml i click medium (rpmi-1640 suppleret med 2 mm L-alanin-l-glutamin + 55 μM beta-mercaptoethanol + 1 mm pyruvat + 100 U/ml penicillin + 100 μg/ml streptomycin) + 5% varme inaktiveret føtal bovint serum [FBS]).
    2. Kombiner 100 μL (150.000 celler) af IIA 1.6 B-celler med AG-belagte perler ved 1:1 ratio i 0,6 mL rør. Bland forsigtigt med en hvirvel og frø på PLL-dæksedler. Inkubér for forskellige tidspunkter i en celle kulturinkubator (37 °C/5% CO2). De typiske aktiverende tidspunkter er 0, 30, 60 og 120 min. For time 0 placeres PLL-coveret i låget med 24-brønden på isen. Tilsæt cellerne-AG-belagt perle blanding og Inkuber i 5 min på is.
      Bemærk: det er vigtigt at blande ved vortex i stedet for pipettering op og ned, fordi dette kan reducere antallet af perler i prøven, på grund af deres ophobning i plastik spidsen af pipetten. Brug perler belagt med BCR-ligand-som en negativ kontrol for hver analyse. Vi anbefaler at aktivere den længste inkubationstid først og derefter følgende tidspunkter. Beregn intervaller for aktivering for prøver, så de er klar til fiksering på samme tid.
    3. Tilsæt 100 μL kold 1x PBS til hver dækseddel for at standse aktiveringen og fortsætte med immunofluorescens protokollen. Se protokol afsnit 3.

2. B-celle aktivering på antigen belagte dæksedler

  1. Fremstilling af antigen belagte dæksedler
    1. Før aktivering forberedes antigen opløsningen (1x PBS indeholdende 10 μg/mL BCR-ligand + og 0,5 μg/mL rotte anti-Mouse CD45R/B220).
      Bemærk: Overvej at forberede dæksedlerne dagen før analysen. B220 forbedrer B celle vedhæftning, men BCR-ligand + er tilstrækkelig til at generere sprede respons.
    2. Placer 12 mm Cover slip på et 24-brøndlåg dækket med paraffin folie, tilsæt 40 μL antigen opløsning på hver dækseddel og Inkuber ved 4 °C natten over. Forsegl pladen for at undgå fordampning af antigen opløsning.
    3. Vask dæksedlerne med 1x PBS og lufttørre.
  2. B-celle aktivering
    1. For at starte aktiveringen fortyndes IIA 1.6 B-celler til 1,5 x 106 celler/ml i click medium + 5% FBS.
    2. Tilsæt 100 μl af cellerne på en antigen belagt dækseddel (AG-dækglas), og Aktivér til forskellige tidspunkter i en celle inkubator ved 37 °c/5% CO2. De typiske aktiverende tidspunkter er 0, 30 og 60 min.
      Bemærk: som i afsnit 1 anbefaler vi, at du starter med det længste aktiveringstidspunkt for at rette alle prøverne på samme tid.
    3. For tid 0, Placer 24-brønden plade låg, der indeholder AG-Cover slip på is og tilføje cellerne. Inkuber i 5 min på is.
    4. Aspirer forsigtigt mediet på hver AG-coverslip og tilsæt derefter 100 μL kold 1x PBS for at standse aktiveringen. Fortsæt med immunofluorescens protokollen. Se afsnit 3.

3. immunofluorescens

Bemærk: for at undgå kryds reaktivitet af det sekundære antistof med BCR af IIA 1,6 B-celler, må du ikke bruge mus-afledte primære antistoffer.

  1. Fjern 1x PBS og Fortsæt med fiksering af hver dækseddel.
    Bemærk: for at afgøre, hvilket fikserings medium der skal anvendes, se databladet for antistof/farve. For eksempel, for actin mærkning af phalloidin bruge PARAFORMALDEHYD (PFA) fikserings medium, og for centrosome mærkning af pericentrin bruge methanol fiksering.
    1. Tilsæt 50 μL 1x PBS suppleret med 4% PFA og Inkuber i 10 min ved RT.
      Forsigtig: formaldehyd er giftigt. Læs MSDS, før du arbejder med dette kemikalie. PFA-opløsninger bør kun laves under en kemisk Røghætte iført handsker og sikkerhedsbriller. PFA-opløsningen skal kasseres som farligt kemikalieaffald.
    2. Alternativt tilsættes 50 μL kold methanol og Inkuber i 20 min.
  2. Vask tre gange med 1x PBS.
    Bemærk: Dæksedler kan opbevares ved 4 °C på dette tidspunkt i højst tre dage i 1x PBS.
  3. Fjern 1x PBS og tilsæt 50 μL blokerende buffer (2% BSA + 0,3 M Glycin i 1x PBS) på hver dækseddel. Inkuber ved RT i 10 min.
  4. Aspirér forsigtigt, og tilsæt 50 μL permeabiliserings buffer (PB) (0,2% BSA + 0,05% saponin i 1x PBS). Inkuber ved RT i 20 min.
  5. Lav antistoffer eller farvestoffer i PB (brug 30 μL pr. Cover seddel), og Inkuber ved RT i 1 time eller natten over ved 4 °C. Se tabellen over materialer for yderligere oplysninger.
    1. For at mærke mikrotubulus organisere Center (MTOC) eller centrosome bruge følgende antistoffer: anti-γ-Tubulin (1:500), anti-Cep55 (1:500), anti-α-Tubulin (1:500), anti-pericentrin (1:1000).
      Bemærk: for centrosome mærkning B celler kan transficeret med en centrin-gfp Expression plasmid.
    2. Til mærkning Golgi apparater brug anti-Rab6a (1:500).
      Bemærk: andre antistoffer eller farvestoffer kan også anvendes.
    3. For mærkning lysosomer, brug anti-Lamp1 (1:200).
      Bemærk: anti-H2-DM og anti-MHC-II kan også anvendes til mærkning af antigen behandlingsrum15,16.
    4. Til mærkning endoplasmatiske reticulum brug anti-Sec61a (1:500).
    5. For actin cytoskelet Overvej følgende: polymeriseret actin kan visualiseres ved Phalloidin konjugeret til fluorescerende farvestoffer.
      Bemærk: B-celler transficeret med en lifeact-gfp/RFP-ekspression plasmid kan også bruges til at mærke actin.
  6. Vask dæksedlerne tre gange med PBS.
  7. Det sekundære antistof eller farvestoffer i PBS fortyndes (brug 30 μL pr. Cover seddel) og Inkuber 1 h ved RT.
    Bemærk: undgå at udsætte prøverne for direkte lys for at bevare kvaliteten af fluorescens signalet.
  8. Vask dæksedlerne tre gange med PBS.
  9. Fjern PBS-opløsningen fra dæksedler.
  10. Der tilsættes 4 μL monterings reagens til et mikroskopdias. Monter coversedlen på diaset med celle siden nedad. Lad slidene tørre i 30 minutter ved 37 °C eller ved RT natten over.
    Bemærk: Overvej at bruge et "anti-fade" monterings reagens (Se tabellen over materialer).
  11. Erhverve fluorescensbilleder på et Konfokal eller epifluorescens mikroskop med en 60x eller 100x olie nedsænkning mål. For hver erhvervelse overveje det transmitterede lys eller lyse felt til nemt at identificere B-celler interagere med perler.
    Bemærk: Tag tredimensionale (3D) billeder, der dækker hele cellen ved hjælp af z-stakke. Vi anbefaler at tage 0,5 μm tykke stakke, men dette afhænger af mikroskopet.

4. billedanalyse

Bemærk: følgende algoritmer er beskrevet for ImageJ software. Dette kan dog udføres ved hjælp af en tilsvarende software. Overvej også, at for alle målinger af fluorescens intensitet bruger vi den integrerede fluorescens tæthed ("RawIntDen" i ImageJ), fordi denne parameter betragter den totale fluorescens mængde i hver pixel i billedet og tager området i betragtning.

  1. Analyse af fordelingen af organeller i B-celler aktiveret med AG-belagte perler
    Bemærk: for at kvantificere polariseringen af cellekomponenterne til IS, definerer vi en vilkårlig værdi som et mål for nærhed til IS. Indekset svinger mellem-1 (anti-polariseret) og 1 (fuldt polariseret, objekt på perlen), som tidligere blev præsenteret af Reversat et al.12.
    1. Beregn polaritets indekset for apparatet centrosome og Golgi (figur 1b).
      Bemærk: denne algoritme kan bruges til organeller, der er begrænset til et enkelt punkt.
      1. Først definere perler og celleområder at analysere ved hjælp af cirkel værktøj udvælgelse til at afgrænse grænserne for begge, og derefter gemme dem som regioner af interesse (ROI). Se figur 1, figur 2, figur 3, og figur 4.
      2. Bestem Cell Center (CC) og Bead Center (BC) ved at køre analysér | Mål på henholdsvis celle-og perle arealerne. X-og Y-værdier, som er hentet fra resultat vinduet, bestemmer midterkoordinaterne.
      3. Manuelt bestemme midten af centrosome eller Golgi apparat (organelle) ved hjælp af punkt værktøj valg i ImageJ og køre analysere | Foranstaltning. X-og Y-værdier, som er hentet fra resultat vinduet, bestemmer koordinaterne.
      4. Tegn derefter en vinkel fra CC til organelle (a) og CC til BC (b) ved hjælp af vinkel værktøjet udvælgelse og Kør analysér | Foranstaltning. Vinkel værdien i resultat vinduet viser vinklen (α) mellem begge vektorer (a og b).
      5. Beregn polaritet index ved hjælp af følgende formel:
        Equation 1
    2. Beregn polaritet Index for lysosomer (figur 1f).
      Bemærk: vi bruger denne algoritme til at analysere polaritet af organeller, der viser en mere dispergeret fordeling, såsom lysosomer.
      1. Definer perler og celleområder til at analysere, ved hjælp af cirkel værktøj udvælgelse til at afgrænse grænserne for begge, og gemme dem som Roi. Når perlen og celleområderne har været determind, skal du indstille fluorescens kanalen og projicere billedet i én z-stak (billede | Stakke | Z-Project [sum Slices]), og kør derefter analysér | Måle og udtrække Mass Center (MC) koordinater (MX og My) fra resultaterne Windows.
      2. Anvend den samme algoritme nævnt før du ændrer organelle for MC. Vinklen (α) defineres således af CC-MC (a) og CC-BC (b).
      3. Beregn polariteten ved hjælp af følgende formel:
        Equation 2
    3. Vurder lysosomet rekruttering til det synaptiske område (figur 2b).
      Bemærk: denne algoritme bruges til at kvantificere en organelle støder op til IS.
      1. Når vulsten og celleområder er blevet fastlagt, bestemme vinklen af vektoren mellem CC og BC og derefter rotere billedet for at opnå en 0 ° vinkel.
      2. Indstil den fluorescerende kanal og Projicer billedet i en z-stak (billede | Stakke | Z-projekt [sum Slices]), eliminere al fluorescens, der falder uden for cellen og perle området sammen (Kør Edit | Ryd udenfor i ImageJ).
      3. Ved hjælp af rektangel værktøj udvælgelse, tegne et rektangel støder op til perlen og måle den synaptiske område fluorescens (SAF). Dette rektangel er en fjerdedel af cellebredden.
      4. Vælg hele billedet og Kør analysér | Måling for at opnå hele cellens fluorescens (WCF).
      5. Beregn organelle fluorescens procent ved siden af den er ved hjælp af følgende formel:
        Equation 4
    4. Kvantificere rekruttering af cellulære komponenter til centrosome.
      Bemærk: denne algoritme, der er tilpasset fra Obino et al.5, bruges til at kvantificere tilsætning af organeller i centrosome-området. Kort sagt betragter vi centrosome-området som det domæne, hvor den centrosome-associerede organelle fluorescens forbliver konstant eller over 70% i fluorescens/radius-plottet. Det er vigtigt at indstille denne parameter ved hvile betingelser, fordi denne radius kan ændre sig ved aktivering.
      1. Når perler og celleområder er blevet fastlagt, definere lokalisering af centrosome ved hjælp af punkt værktøj udvælgelse (figur 3b).
      2. Først bestemme det maksimale areal omkring centrosome, der er muligt at kvantificere, ved at tegne en 3 μm-radius cirkel omkring centrosome.
      3. Brug ImageJ plugin radial Profile, som måler fluorescens i koncentriske cirkler og viser et fluorescens/radius plot.
      4. Angiv den maksimale radius, inden for hvilken mindst 70% af fluorescens intensiteten opretholdes.
      5. Udregn fluorescens tæthed ved hjælp af følgende formel:
        Equation 5=Equation 6
        Bemærk: forholdet mellem fluorescens tæthed indikerer koncentrationen af en organelle på centrosomet sammenlignet med dets fordeling i hele cellen.
  2. Analyse af celle spredning og fordeling af organeller i B-celler aktiveret på AG-dæksedler
    1. Beregn organelle fordeling på IS (figur 4b).
      Bemærk: denne algoritme giver mulighed for kvantificering af XY fordeling af organeller og deres koncentration i midten af is. Vi definerer et forhold mellem fluorescens tæthed mellem det centrale og det totale synaptiske område. De opnåede værdier kan variere fra negativ til positiv, hvilket indikerer henholdsvis en perifer eller en central fordeling af organellen.
      1. Bestem det udsnit, hvor cellen er i kontakt med dækslet.
        Bemærk: for at afgrænse cellegrænserne kan man mærke plasma membranen eller actin, som er beriget i periferien af IS.
      2. Ændre typen af udsnit til 8-bit, derefter binarize (proces | Binær | Foretag binær), og Forbind den nærmeste outsider-point proces | Binær | Disposition. Afgræns grænserne for celleområdet (ca) ved hjælp af valget af polygonværktøjet .
        Bemærk: dette trin er nyttigt for at øge kontrasten i cellegrænserne og gøre det nemmere at identificere. Også på dette punkt, er det muligt at anvende Analysér partikel plugin af ImageJ at bestemme ca automatisk. Andre celler i samme felt kan dog forstyrre resultaterne.
      3. Tag ca parametre (højde og bredde) og afgrænse et centralt afrundet område, som er adskilt fra grænserne med en fjerdedel af højden og breddeværdier, overveje dette område som celle Center område (CCA).
      4. Beregn fluorescens tæthed fordeling i midten af er ved hjælp af følgende formel:
        Equation 7
    2. Måling af organelle fordelingen i Z-flyene (figur 4c).
      Bemærk: denne analyse bestemmer den generelle fordeling af organelle fluorescens på tværs af Z-fly af B-celler aktiveret på AG-Cover sedler, der viser procentdelen af fluorescens pr. Z-fraktion.
      1. For at kvantificere fluorescens fordelingen i Z skal du først bestemme planet for den er, hvor cellen er i kontakt med AG-Cover sedlen og derefter det plan, der svarer til cellens øvre grænse.
      2. Tegn en linje på tværs af celle centeret.
      3. Reslice billedet i Z (billede | Stakke | Reslice) for at få et XZ-billede.
      4. Mål højden og opdele XZ billedet i 10 på hinanden følgende rektangler af samme højde (Z fraktion) fra bunden (er interface) til toppen (øvre side af cellen) og kvantificere fluorescens signalet i hver enkelt.
      5. Normalisere fluorescens intensiteten for hver Z-fraktion med summen af den totale fluorescens af de 10 fraktioner.
      6. Afbild procentdelen af fluorescens intensitet pr. Z-brøkdel af cellen.

5. isolering af centrosome-beriget fraktion fra hvilende og aktiverede B-celler

Bemærk: Opbevar alle opløsninger ved 4 °C under eksperimentet for at undgå protein nedbrydning. Denne protokol blev tilpasset fra tidligere arbejde17,18.

  1. Aktiver 2 x 107 B-celler med AG-belagte perler i 2 ml Click medium + 2% varme INAKTIVEREDE FBS (ratio 1:1). Overvej ikke-aktiverede B-celler som hvilende B-celler.
  2. Tilsæt cytochalasin D (2 μM) og nocodazol (0,2 μM) og Inkuber i 1 time ved 37 °C.
    Bemærk: disse stoffer bruges til forsigtigt at løsne centrosome fra kernen, ved depolymeriserende actin cytoskelet og microtubuler, henholdsvis for at undgå nuklear forurening.
  3. Hver prøve vaskes med 5 mL kold 1x TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl) og derefter med 1 mL 0,1 x TBS suppleret med 8% saccharose.
  4. Cellerne resuspenderes med 150 μL centrosome lyse buffer (1 mM HEPES, pH 7,2, 0,5% NP-40, 0,5 mM MgCl2, 0,1% Beta-mercaptoethanol, 1 mm phenylmethylsulfonyl FLUORID (pmsf) eller proteasehæmmer cocktail) og pipetter op og ned, indtil viskositet fald, hvilket indikerer, at celle lysis er identificeret i prøven. Prøven sættes i et 1,5 mL rør.
  5. Centrifugeres ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °c for at adskille organellerne fra kernen.
  6. Oversæt forsigtigt supernatanten, og Placer den oven på et 1,5 mL rør med 300 μL gradient buffer (GB) (10 mM rør pH 7,2, 0,1% Triton X-100, 0,1% Beta-mercaptoethanol) indeholdende 60% saccharose.
  7. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 °c for at koncentrere centrosomerne i 60% saccharosefraktionen.
  8. I mellemtiden, forberede en diskontinuerlig gradient i 2 ml ultracentrifuge rør ved overliggende 450 μl af GB + 70% saccharose med 270 μl af GB + 50% saccharose og derefter 270 μl af GB + 40% saccharose.
  9. Efter den første centrifugering (centrosome-koncentreret fraktion) kasseres den øvre fraktion (mindre tæt portion), indtil den når grænsefladen og vortex den resterende prøve i røret. Derefter overlay på toppen af den diskontinuerligt gradient tidligere forberedt med centrosome beriget prøve.
    Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at forstyrre forløbet, alle pipette Rings procedurer skal udføres omhyggeligt.
  10. Der centrifugeres ved 40.000 x g i 1 time ved 4 °c med minimal acceleration og med centrifuge bremsen sat til off for at undgå at forstyrre forløbet.
  11. Saml 12 fraktioner af 100 μL i separate rør, som begynder fra toppen.
  12. Identificer de centrosome berigede fraktioner ved immun ved hjælp af γ-Tubulin som centrosome markør.
    Bemærk: vi finder sædvanligvis centrosome-berigede ekstrakter mellem fraktionerne 6 og 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den nuværende artikel viser, hvordan B-celler kan aktiveres ved hjælp af immobiliseret antigen på perler eller dæksedler til at inducere dannelsen af en IS. Vi giver oplysninger om, hvordan man identificerer og kvantificerer polariseringen af forskellige organeller ved immunofluorescens, og hvordan man karakteriserer proteiner, der gennemgår dynamiske ændringer i deres Association til centrosome, som polariserer til IS, ved hjælp af en biokemisk tilgang.

Billeddannelse af B-celler ved immunofluorescens giver os mulighed for at følge dynamikken i organeller såsom centrosome, Golgi apparat og lysosomer, som er rekrutteret til er ved B-celle aktivering. Man kan opnå kvantitative parametre til at måle polariseringen af disse organeller til IS og sammenligne dem under forskellige betingelser. Som vi viser i figur 1a, er Centrosome og Golgi apparatet rekrutteret til er ved B-celle aktivering. Der blev ikke observeret ansættelse i B-celler stimuleret med BCR-ligand-hvilket indikerer, at BCR-engagementet er påkrævet for at mobilisere centrosome-og Golgi-apparatet til IS (figur 1a). For at opnå et polaritet Index for hver organelle, som en måling af dens nærhed til IS, vi overvejet tre funktioner: afstanden mellem organelle og midten af cellen, afstanden mellem perler centrum og cellecenter, og vinklen mellem disse to vektorer (figur 1b). Dette indeks spænder mellem-1 (anti-polariseret) og 1 (fuldt polariseret, objekt på perlen). Figur 1c og 1d viser grafer, hvor polaritet indekser for hver organelle er plottet versus aktiveringstidspunkt. Efter aftale med immunofluorescens farvning, både centrosome og Golgi apparatet, viser mere positive polaritet indekser ved længere tidspunkter aktivering, hvilket afspejler, hvordan de gradvist rekrutteres til IS. Denne algoritme gælder for organeller begrænset til ét punkt.

Derudover kvantificerede vi polariseringen af organeller, der viser en dispergeret fordeling, såsom lysosomer (figur 1E), ved at anvende den samme algoritme nævnt før, men at ændre punktet koordinere af masse Center koordinaterne for lysosomer (figur 1f). Vi kan konstatere, at polaritet indekser af lysosomet puljer nå mere positive værdier ved aktivering, hvilket indikerer, at lysosomer er ved at blive mobiliseret mod synapse ved B-celle aktivering (figur 1G).

Vi har også defineret to algoritmer til at bestemme organeller, der er i kontakt med den synaptiske grænseflade (perle) og mængden af organeller i nærheden af synapse, men ikke nødvendigvis i kontakt. Som vi viser i figur 2, vi kvantificerede lysosomer at kontakte den synaptiske grænseflade (figur 2a), ved at dividere lampen-1 signal på vulst området ved den totale fluorescens i cellen plus perlen (figur 2b). Det er vigtigt at overveje, at diameteren af vulst området bestemmer intervallerne for de opnåede procenter. For eksempel, i den viste kvantificering (figur 2b), tegner vi en cirkel med en 3 μm diameter for at måle fluorescens ved perlen, som er en restriktiv parameter i betragtning af vulstens størrelse (3 μm). Ved hjælp af denne parameter, viser resultaterne, at lysosomer gradvist rekrutteres til den synaptiske grænseflade ved B-celle aktivering, nå 10-15% af den samlede masse (figur 2c). En anden tilgang, der er vist, er kvantificeringen af lysosomer til det synaptiske område. Figur 2D viser, at lysosomer gradvist akkumulerer op til 25% af deres lysosomer på is. Samlet, ved at udføre begge typer af analyse kan man evaluere polarisering og docking af organeller på IS.

Under B-celle aktivering er ændringer i puljen af centrosome-associerede proteiner blevet dokumenteret5. For eksempel, en af disse proteiner, der ændrer deres Association på Centrosome under B-celle aktivering er actin. I dette tilfælde actin bliver forarmet inden for denne region, som gør det muligt for centrosome at blive løsrevet fra kernen, fremme af sin polarisering til IS5. Her præsenterer vi kvantificeringen af actin på Centrosome og hvordan den er opbrugt ved B-celle aktivering (figur 3). For at definere det centrosome område, der anvendes til at kvantificere associeret actin, målte vi fluorescens intensiteten af dette mærke i koncentriske cirkler omkring centrosome. Radius blev defineret ud fra det punkt, hvor mindst 70% af etikettens fluorescens intensitet opretholdes (figur 3b). Ved hjælp af denne metode kan man kvantificere faldet i actin tæthed på centrosome ved B-celle aktivering, som vist i figur 3c.

For at opnå større opløsning i distributionen af organeller på is-grænsefladen aktiverede vi B-celler på antigen belagte dæksedler, mærknings actin, Golgi-apparatet og endoplasmatiske reticulum (figur 4a). Fordelingen af organeller på IS kan udføres ved at dykke det synaptiske område i et centralt og perifert område, anvende et kriterium, der er vist i figur 4b. Dette var baseret på tidligere arbejde, der viser, at bcrs samles inden for dette centrale område, hvilket mest sandsynligt svarer til det centrale Supramolekylær-aktiverings kompleks (csmac)10,19. Figur 4a viser, at organeller, der rekrutteres til is, såsom Golgi-apparatet og endoplasmatiske reticulum, viser modsatte fordelinger. Deres distributions indekser korrelerer med deres immunofluorescens farvning vist i figur 4c. Golgi-apparatet viser en positiv værdi, hvilket betyder, at det er koncentreret i midten af is, mens endoplasmatiske reticulum viser negative værdier, hvilket betyder, at det primært er lokaliseret i den perifere region af is. Derudover er det muligt at tage værdierne af det synaptiske område, der tidligere er fastlagt, for at måle spredningsområdet under B-celle aktivering, da det er vist i figur 4d og 4e. Disse resultater viser en stigning i spredningsområdet ved B-celle aktivering, som tidligere beskrevet10,20.

Som i Perlen analyse, kan vi bestemme fordelingen af organeller mod immun synapse ved at tage XZ billeder af B-celler aktiveret på antigen-coated dæksedler og måling af organelle fluorescens på tværs af Z dimension (figur 4F). Fluorescens intensiteten af actin i Z-planet blev målt, da den er repræsenteret i XZ-planet i figur 4F, hvor der kan observeres en progressiv berigelse af actin ved den synaptiske grænseflade (fraktioner 1 og 2) (figur 4g).

Ud over B-celle billedbehandlings analysen udførte vi isoleringen af centrosome-berigede fraktioner for at kvantificere centrosome-associerede proteiner (figur 5a). Denne tilgang kan være vigtigt at supplere studiet af IS dannelse i B-celler, da centrosome polariserer til den synaptiske membran og har vist sig at koordinere lysosomet handel involveret i antigen udvinding og præsentation21. Denne metode blev tidligere beskrevet ved hjælp af store mængder af celler (1 x 109 celler)17,18 men vi har standardiseret en forenklet version, som bruger en reduceret mængde af celler og kan udføres ved hjælp af lavere volumen ultracentrifuge-rør (2-3 mL). Som vi viser i figur 5b, vi analyserede forskellige celle fraktioner ved blot og bestemmes, hvilke der svarer til centrosome-rige fraktioner, ved gamma Tubulin farvning. Her viser vi et eksempel på proteiner, der undergår ændringer i deres ophobning på centrosome, såsom actin og Arp2, som tidligere er blevet rapporteret5.

Figure 1
Figur 1 : Polarisering af organeller mod is. A) immunofluorescens farvning af Golgi-apparatet (Rab6a) og mikrotubuli (α-Tubulin) i IIa 1.6 B-celler inkuberet med BCR-ligand + (0, 30, 60 og 120 min) eller BCR-ligand-perler (120 min). Arrowheads angiver centrosome. BF = lyse felt. Scale bar = 3 μm. (B) ordning, der viser, hvordan man beregner polaritet index af organeller (centrosome eller Golgi apparater) mod is. a = afstanden mellem cellens midte (CC) og organellen. b = afstand fra CC og til vulst Center (BC). (C, D) Repræsentative prik-områder, der viser polaritet-indekser for organeller på forskellige tidspunkter for aktivering. Hver prik repræsenterer én celle. E) immunofluorescens farvning af lysosomer (Lamp1) i B-celler inkuberet med BCR-ligand + (0, 30, 60 og 120 min) eller BCR-ligand-perler (120 min). BF = lyse felt. Scale bar = 3 μm. F) ordning, der repræsenterer, hvordan polaritet indekset for lysosomer beregnes. a = afstanden mellem CC og Mass Center (MC). b = afstand fra CC til BC. G Repræsentative prik-plot, der viser polaritet indekser af lysosomer på forskellige tidspunkter af aktivering. Hver prik repræsenterer én celle. 2-vejs ANOVA med Sidaks post-test blev udført. Midler med SEM vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Ophobning af lysosomer på is. A) immunofluorescens farvning af lysosomer (Lamp1) i B-celler inkuberet med BCR-ligand + (0, 30, 60 og 120 min) eller BCR-ligand-perler (120 min). BF = lyse felt. Scale bar = 3 μm. (B) ordning, der viser, hvordan man beregner ophobning af organeller såsom lysosomer på vulsten og det synaptiske område. Fluorescens af hele cellen (WCF), vulst fluorescens (BF) og det synaptiske område fluorescens (SAF) er indiceret. (C, D) Repræsentative bjælke grafer for ophobning af lysosomer på vulsten og det synaptiske område. N = 1. 20 > celler. 2-vejs ANOVA med Sidaks post-test blev udført. Midler med SEM vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Kvantificering af actin i centrosome under dannelse. A) immunofluorescens farvning af actin (Phalloidin) og mikrotubuler (α-Tubulin) i B-celler inkuberet med BCR-ligand + (0 og 60 min) eller BCR-ligand-perler (0 og 60 min). Pilehoveder indikerer centrosome. Scale bar = 3 μm. (B) ordning, der viser, hvordan man beregner rekruttering eller udtømning af Centrosome tilknyttede komponenter. Centrosome-området beregnes ved hjælp af en radius (X μm), der bevarer mindst 70% af den maksimale fluorescens. C) repræsentative prik områder, der viser actin i centrosome under aktiveringen (BCR-ligand +) og ikke-aktiverende (BCR-ligand-) betingelser. N = 1. 15 > celler. 2-vejs ANOVA med Sidaks post-test blev udført. Midler med SEM vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Distribution af cellulære komponenter på den synaptiske grænseflade. A) immunofluorescens farvning af actin (Phalloidin), Endoplasmic reticulum (Sec61a), Golgi-apparatur (transfected med en KDELR-DN-Gfp en negativ dominerende af kdel-receptoren, som lokaliserer i Golgi). B-celler blev seedet på dæksedler belagt med en BCR-ligand + for 60 min. BF = lyse felt. Scale bar = 5 μm. (B) ordning, der skildrer, hvordan man afgør cellens spredningsområde og rekrutteringen af organeller i midten af is. I skemaet angiver CA det celleområde, som er afgrænset af kortikal actin, og CCA angiver det midterste celleområde. C) Golgi-apparater og endoplasmatiske reticulum-fordeling på is, repræsenteret ved et søjlediagram, hvor en værdi > 0 angiver en berigelse i midten af is, og < 0 angiver en perifer fordeling. N = 1. 20 > celler. Midler med SEM vises. D) repræsentative billeder af B-celler mærket for actin (Phalloidin) aktiveret på AG-belagte dæksedler på forskellige tidspunkter (0, 30 og 60 min), der viser XZ-og XY-planet. (E) graf, der viser sprednings arealet af B-celler i E. (F)-ordningen, der viser, hvordan fordelingen af signalet af interesse i Z-flyet bestemmes, og plottet pr. z-fraktion. Rektanglet angiver er-grænsefladen. G) fordeling af actin på tværs af z-planet repræsenteret ved et linje plot af procentdelen af fluorescens fordeling versus hver z-fraktion. Rektanglet repræsenterer er-grænsefladen. N = 1. 25 > celler. Midler med SEM vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Centrosome berigede fraktioner af B-celler. (A) arbejdsgang for, hvordan man får centrosome-berigede fraktioner ved saccharose gradient ultracentrifugering. B) immunoblot af fraktioner fremstillet af hvile-og aktiverede B-celler (60 min.). Centrosome-rige fraktioner detekteres ved mærkning med γ-Tubulin og er angivet i det stiplede rektangel (fraktion 6 til 8). Centrosome associerede proteiner (actin og Arp2) er vist i centrosome-rige fraktioner i aktivering og hvile betingelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en omfattende metode til at studere, hvordan B-lymfocytter re-organisere deres intracellulære arkitektur til at fremme dannelsen af en IS. Denne undersøgelse omfatter brugen af billeddiagnostiske teknikker til at kvantificere den intracellulære fordeling af organeller, såsom centrosome, Golgi apparater og lysosomer under B-celle aktivering, og hvordan de polariserer til IS. Derudover beskriver vi en biokemisk tilgang til at studere ændringer i centrosome sammensætning ved B-celle aktivering.

For at fremme dannelsen af en IS i B-celler brugte vi immobiliserede antigener (antigen belagte perler) i stedet for opløselige immunkomplekser, fordi førstnævnte udløser etablering af et diskret kontaktsted, hvor cytoskelet rearrangering og organelle polarisering kan let undersøgt. Et kritisk aspekt i billeddannelse B-celle aktivering er forberedelsen af prøverne. Alle billed anskaffelser bør ideelt set opnå en 1:1 celle: perle ratio, for at kvantificere polariseringen af organeller til et unikt sted for antigen kontakt. I nogle tilfælde kan B-celler dog fange to eller flere perler, hvilket gør det vanskeligt at vælge et enkelt sted for antigen møder. For at undgå dannelsen af perle aggregater, er det vigtigt at vortex antigen-konjugeret perler grundigt, før du tilføjer dem til cellerne. For immunofluorescens forsøg anbefales det desuden at udelukke fra kvantificerings celler, der fanger mere end én perle, for at undgå fejlfortolkninger under billedanalysen. Et andet kritisk skridt i forberedelsen af prøver er fiksering/permeabilization tilstand. For eksempel anbefaler vi at fastgøre celler med methanol for at optimere farvning af mikrotubulen og 4% PFA for phalloidin-farvning. Ved samtidig mærkning actin cytoskelet og microtubuli, et alternativ kan være at mærke actin pool ved transfficerende celler med en lifeact-gfp/RFP ekspression plasmid i kombination med mikrotubulus farvning. Billed erhvervelse bruges til at kvantificere polariseringen af Centrosome og andre intracellulære organeller kan udføres med et epifluorescens mikroskop. For at opnå en nøjagtig kvantificering på forskellige z-planer, for eksempel i sprednings analysen, kræves der Konfokal mikroskopi.

For den centrosome isolations protokol, der er beskrevet her, er et kritisk skridt at opnå en passende mængde prøver for at kunne kvantificere proteiner ved immunoblot. Da B-celler har en stor kerne, og deres cytoplasma er mindre end 30% af deres samlede celle volumen, kan opnåelse af højere udbytter af cytoplasmiske proteiner være udfordrende. Derfor anbefaler vi at bruge ca. 20 x 106 B-celler til hvert aktiveringstidspunkt for centrosome isolation.

En væsentlig begrænsning af disse metoder er, at aktivering med antigen konjugerede perler ikke omfatter kompleksiteten af det miljø, hvor overflade bundet antigener præsenteres for B-celler in vivo. Denne begrænsning kan afhjælpes ved at supplere kulturen eller perler med andre Co-stimulerende faktorer, såsom cytokiner og komponenter i den ekstracellulære matrix. Det er imidlertid afgørende at anvende de relevante kontroller i disse tilfælde for at kunne fortolke resultaterne korrekt.

Betydningen af de metoder, der præsenteres i dette arbejde er afhængig af den integrerede tilgang anvendes til at studere B-celle immun synapse: (1) polariseringen af organeller og deres fordeling og (2) ændringer i protein sammensætning på centrosome. På grund af det store antal celler, der kræves for at udføre en betydelig analyse og den store mængde data genereret i denne proces, de forskellige kvantificering algoritmer præsenteret i dette arbejde letter analysen af celle scanning. Desuden er de algoritmer, der anvendes til celle polarisering nemme at automatisere ved MAKROER funktioner i ImageJ, hvilket er et nyttigt værktøj til at reducere gentagne opgaver og spare tid.

Disse eksperimentelle procedurer kan ekstrapoleres til andre typer af celler, der etablerer polariserede fænotyper for at opnå en bestemt cellulær funktion. Desuden kan disse protokoller optimeres ved at medtage andre analyser, for eksempel aktiviteten af de associerede proteiner såsom kinaser eller proteaser i Centrosome-berigede fraktioner. Samlet set kan disse undersøgelser give mekanistisk indsigt i celle signalering og molekylære veje, der regulerer etableringen af celle polaritet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

M.-I.Y. understøttes af et forskningsstipendium fra FONDECYT #1180900. J.I., D.F. og J.L. blev støttet af stipendiater fra Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología. Vi takker David Osorio fra Pontificia Universidad Católica de Chile for videooptagelse og redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanol Fisher Scientific A412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular Marienfield-Superior 111500
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG  LifeTech  A21206 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgG Thermo Fisher Scientific  A-11071 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific  A21238 1:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Amino- Dynabeads ThermoFisher 14307D
Anti-pericentrin  Abcam ab4448  1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6 Abcam ab95954 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61 Abcam ab15575 1:200 dilution recomended but should be optimized
BSA  Winkler  BM-0150
CaCl2 Winkler CA-0520
Culture plate T25 BD 353014
Fiji Software Fiji col.
Fluoromount G Electron Microscopy Science 17984-25
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050061
Glutaraldehyde Sigma  G7651 
Glycine Winkler  BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 315-005-003 IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific 31186 IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific SH30071.03 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KCl Winkler PO-1260
Leica SP8 TCS microscope Leica
NaCl Winkler SO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope  Nikon
Parafilm M P1150-2
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μm Polyscience 17145-5
Poly-L-Lysine Sigma P8920 Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibody Abcam ab6160 1:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibody Cell signaling 3243 1:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55  Abcam ab170414 1:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody  Abcam ab16504  1:1000 for Western Blot
RPMI-1640 Biological Industries 01-104-1A
Saponin  Merck 558255
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Sucrose Winkler  SA-1390 
Triton X-100  Merck 9036-19-5
Tube 50 ml Corning 353043

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
  2. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  5. Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
  6. Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  7. Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
  8. Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
  10. Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
  11. Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
  12. Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
  13. Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
  14. Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
  15. Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
  16. Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
  17. Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
  18. Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, Elsevier (2015).
  19. Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
  20. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
  21. Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).

Tags

Immunologi og infektion celle polaritet lysosomer cytoskelet centrosome immun synapse B-lymfocytter billedanalyse
Undersøgelse af organelle dynamik i B-celler under dannelse af immun synapse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ibañez-Vega, J., Fuentes, D.,… More

Ibañez-Vega, J., Fuentes, D., Lagos, J., Cancino, J., Yuseff, M. I. Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation. J. Vis. Exp. (148), e59621, doi:10.3791/59621 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter