Summary
El ensayo de invasión celular in vitro se utiliza para medir el potencial de la metástasis del cáncer mediante la cuantificación del potencial celular de invasión y migración utilizando inserciones de cultivo celular que contienen matriz proteica. Las células tienen el desafío de migrar a través de la matriz proteica y una membrana porosa, hacia un quimioatractor, y luego cuantificadas por microscopía ligera.
Abstract
El ensayo de invasión in vitro utiliza una matriz rica en proteínas en una cámara Boyden para medir la capacidad de las células cultivadas para pasar a través de la matriz y una membrana porosa en un proceso análogo a los pasos iniciales de la metástasis celular cancerosa. Las células probadas pueden ser alteradas para la expresión génica o tratadas con inhibidores para detectar cambios en el potencial de invasión. Este experimento prueba el fenotipo agresivo de las células tumorales mamarias del ratón para descubrir y caracterizar los potenciales oncogenes que promueven la invasión celular. Esta técnica, sin embargo, puede ser versátil y adaptada a muchas aplicaciones diferentes. El experimento en sí se puede hacer en un día y los resultados son adquiridos por microscopía de luz en menos de un día. Los resultados incluyen recuentos del número de células invasoras para la comparación y el análisis. El ensayo de invasión in vitro es un método rápido, económico y claro para determinar el comportamiento celular en un cultivo que se puede utilizar como evaluación inicial antes de involucrarse más en ensayos vivos.
Introduction
El ensayo de invasión in vitro puede ser una herramienta útil al medir la capacidad de una célula para migrar a través de una membrana recubierta de proteínas, análoga a los primeros pasos en metástasis. Una característica clave de las células cancerosas malignas es su capacidad para migrar e invadir los tejidos cercanos. El cáncer que se ha diseminado o hecho metástasis plantea más desafíos para el tratamiento y tiene tasas más bajas de supervivencia a largo plazo, mientras que los tumores localizados son más fáciles de tratar y tienen tasas más altas de supervivencia a largo plazo. Para hacer metástasis, las células cancerosas deben abandonar el tumor primario y migrar al sistema circulatorio o linfático, un proceso que requiere pasar a través de la matriz extracelular y la membrana del sótano1. En el proceso llamado transición mesenquimal epitelial (EMT), las células tumorales deben romper los contactos de las células celulares, migrar direccionalmente e invadir la sangre o los vasos linfáticos cercanos. Los pasos iniciales de esta cascada de metástasis son de gran interés ya que estos pasos son lo que puede hacer que el cáncer sea más mortal. Los factores genéticos y epigenéticos involucrados en los primeros pasos de la metástasis son el foco de una gran cantidad de investigación, pero se necesitan herramientas experimentales precisas y confiables para probar estos primeros pasos tanto in vivo como in vitro.
Las herramientas para medir los cambios en la migración celular, como los ensayos de cicatrización de heridas (rasguños) o el crecimiento en entornos 3D, como los ensayos de agar blandos, pueden abordar parcialmente la necesidad de métodos experimentales para medir los primeros pasos de metástasis, pero un ensayo para medir la invasión es más desafiante ya que el proceso ocurre en el cuerpo dentro de un microambiente tumoral complejo. A los efectos del cribado de fármacos o alteraciones genéticas para determinar factores importantes en la invasión y metástasis, un sistema que puede ser utilizado in vitro con células cultivadas e imitar los desafíos a los que se enfrentan las células metastásicas in vivo es el ensayo de invasión2, 3. El cáncer de mama es el tipo de cáncer diagnosticado con mayor frecuencia en las mujeres y la segunda causa de muerte por cáncer en las mujeres, por lo que comprender los genes responsables de la invasión de células de cáncer de mama y la metástasis es de vital importancia para la salud pública. Además, las células de ratón son un sistema modelo útil para el estudio del cáncer de mama y su progresión.
El ensayo de invasión in vitro se basa en el conjunto de la CámaraBoyden, donde dos cámaras de medios de crecimiento están separadas por una membrana porosa 3. Para imitar el microambiente tumoral, también se incluye un gel rico en proteínas para separar las células en una cámara de un quimioatractor en la otra y actuar como una barrera de membrana del sótano. Con el fin de migrar hacia la quimioattractant, las células primero deben pasar a través de la barrera rica en proteínas y luego pasar a través de la membrana porosa - un proceso análogo a cómo las células metastásicas migran a través del estroma. El gel rico en proteínas puede ser alterado en función de las necesidades del experimento, pero por lo general consiste en colágeno, o extracto de membrana de sótano (por ejemplo, Matrigel)4. Es una mezcla compleja de proteínas, proteoglicanos y factores de crecimiento, pero sobre todo consiste en laminins y colágeno IV 4,5. Las células deben pasar a través de una membrana porosa típicamente hecha de policarbonato, poliéster o politetrafluoroetileno (PTFE). Las membranas se pueden comprar comercialmente con o sin un gel de proteína (normalmente colágenos), o el gel se puede comprar por separado y añadir. El tamaño del poro se puede ajustar en función del tamaño de celda. Mientras que los tamaños de los poros están disponibles de 0,4 a 8,0 m, solo los poros de 3,0 a 8,0 m son lo suficientemente grandes para la migración celular. El ensayo de invasión se ha utilizado para determinar la eficacia de los inhibidores sobre la capacidad de las células para migrar e invadir. Aunque carece del microambiente tumoral exacto que está presente in vivo, el ensayo de invasión in vitro es beneficioso para examinar muchas condiciones en poco tiempo, al tiempo que minimiza la necesidad de modelos animales. El objetivo de estos experimentos es comparar la expresión génica de los oncogenes sospechosos y determinar los efectos sobre el comportamiento de las células cancerosas y la agresividad de las enfermedades utilizando el ensayo de invasión in vitro y otras pruebas. En general, el ensayo de invasión proporciona resultados consistentes, cuantitativos y rápidos para determinar el potencial metastásico, al mismo tiempo que es un método relativamente barato, sencillo y adaptable.
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Protocol
Todos los experimentos y métodos fueron realizados según lo autorizado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Villanova (IACUC).
1. Expresión génica en células tumorales mamarias de ratón cultivado
- Primero, prepare las líneas celulares para ser probadas.
-
Utilice una colonia reproductora de ratones BALB/cV. Estos ratones llevan la cepa BALB/cV del virus tumoral mamario de ratón, transmitida a cachorros en leche6,7. El cincuenta por ciento de las hembras reproductoras desarrollan tumores mamarios a los 10 meses de edad.
- Para establecer una línea celular tumoral, sacrifique una presa portadora de tumores utilizando un protocolo aprobado por la IACUC. Remoje la piel abdominal en 70% EtOH y retire el tumor en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Los tumores son subcutáneos, así que ten cuidado de no puntuar el peritoneo.
- Coloque los fragmentos tumorales de áreas no necróticas en una placa de petri con una pequeña cantidad de solución salina equilibrada de Hanks estéril (HBSS) y pique muy finamente con una cuchilla de afeitar estéril.
- Transfiera los grumos de células dispersas a un matraz de cultivo celular T25 que contenga 5 ml de medio de águila modificada o DMEM de 5 ml de Dulbecco (4,5 g/L de glucosa, rojo fenol y l glutamina) complementados con 50% de suero bovino fetal o FBS y 1% de solución antibiótica/antimicótica. Cultivar células en matraces de cultivo celular tratado en una incubadora con 5% de CO2 y 100% de humedad a 37oC.
- Lavar las células no adherentes después de 24-48 h y reemplazar el DMEM con 50% DE FBS y 1% de solución antibiótica/antimicótica. Devuelva las células a la incubadora.
- Reemplace los medios de cultivo líquidos cada 3 días.
- Divida o atraviese las celdas cuando sean confluentes al 90%. Retire los medios de cultivo y lave las células adherentes con HBSS (sin calcio ni magnesio). Incubar células con 0.25% de solución trypsin-EDTA durante 1-5 min a 37 oC hasta que las células se redondeen y se desparan. Diluir las células 1:10 en medios de cultivo frescos y añadir a un nuevo matraz. Un matraz de cultivo celular T-25 requiere medios de cultivo de 5-8 ml, 5 ml de HBSS para lavar, y 1 ml de tripina-EDTA para el paso. Devuelva el matraz a la incubadora.
- Reducir la concentración de FBS a 40% después del primer pasaje, luego 30% después del segundo pasaje, luego 20% después del tercer pasaje, y finalmente 10% para todos los pasajes posteriores. El proceso de establecer el crecimiento en el medio DMEM estándar con 10% FBS requiere cuatro pasajes y 2 - 8 meses.
-
Una vez establecidas las líneas celulares, altere la expresión de sospechas de oncogenes mediante la transfección de ARNS de shRNA dirigido a ARNm o CRISPR para genes no esenciales.
- Establecer líneas celulares estables resistentes a los antibióticos con clones individuales que son verificados por western blot y/o RT-qPCR para obtener resultados consistentes, sin embargo, las transfecciones transitorias también pueden funcionar ya que el ensayo sólo requiere 22 h. Líneas celulares de control con también se requieren secuencias de destino no específicas.
2. Ensayo in Vitro Invasion
- Crecer células tumorales mamarias de ratón adherentes en un matraz T25 hasta que 70-90% confluente para el día 1 del experimento.
NOTA: Otras líneas celulares o condiciones experimentales pueden requerir diferentes medios de cultivo celular. Por ejemplo, si se están probando células de cáncer de mama que responden a las hormonas, puede ser necesario suero filtrado de carbón para eliminar compuestos que activan estrógeno u otros receptores hormonales. - Prepare los insertos de la cámara Boyden calentándolos a temperatura ambiente (desde un almacenamiento de -20 oC) durante unos 20 minutos en una campana de cultivo celular. Evite los ciclos de congelación-descongelación para plaquitas no utilizadas. Utilice tres inserciones (réplicas) para generar datos estadísticamente válidos para cada línea de celda para cada experimento.
- Agregue los medios DMEM precalentados de 37 oC sin suero al pozo y, a continuación, la plaquita. Para plaquitas diseñadas para platos de 24 pozos, agregue 500 ml de DMEM sin suero al pozo y luego 500 l de DMEM libre de suero a la plaquita para que la membrana porosa y el gel se hidraten en ambos lados.
NOTA: Para plaquitas más grandes diseñadas para un plato de 6 pozos, utilice 2 ml de DMEM sin suero en ambos lados.
- Agregue los medios DMEM precalentados de 37 oC sin suero al pozo y, a continuación, la plaquita. Para plaquitas diseñadas para platos de 24 pozos, agregue 500 ml de DMEM sin suero al pozo y luego 500 l de DMEM libre de suero a la plaquita para que la membrana porosa y el gel se hidraten en ambos lados.
- Colocar el plato con inserciones en una incubadora de cultivo celular de 37oC con 5% de CO2 y 100% de humedad durante al menos 2 h para hidratar y aclimatar se aclimata a fondo.
- Prepare las células extrayendo los medios de crecimiento y encerrando las células con 5 ml de HBSS.
- Retire el HBSS y agregue 1 mL 0.25% de solución trypsin-EDTA durante 1 - 5 min a 37 oC o hasta que las células aparezcan redondeadas o muestren signos de desprendimiento del matraz.
- Toque suavemente el matraz para separar todas las células. Resuspender las células en 5 ml de DMEM + 10% FBS y transferirlas a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml.
- Centrifugar las células a 1.000 x g durante 5 min para peletizar suavemente las células. Retire el medio y sustitúyalo por Un DMEM libre de suero de 5 ml para resuspender las células.
- Repita la centrifugación y la suspensión en medios libres de suero dos veces más para un total de 3 lavados.
- Resuspenda completamente las células en los 5 ml finales de DMEM sin suero y asegúrese de que no haya grumos de células.
- Determinar la concentración celular utilizando un hemocitómetro. Cuente sólo células viables. Diluir la suspensión celular a 5 x 104 células/ml en 5 ml de DMEM libre de suero.
NOTA: Esta concentración produce 2.500 células por plaquita en un plato de 24 pozos. Este número de células es suficiente para células cancerosas agresivas con altas tasas de migración e invasión. Las líneas celulares menos agresivas pueden requerir más células, hasta 10.000 células por plaquita para células invasoras observables. Si se espera una invasión celular reducida, considere maximizar las células invasoras aumentando el número de células. Si se espera un aumento de la invasión celular, comience con menos células. - Retire el plato de cultivo celular de la incubadora y aspire suavemente el medio de la plaquita. Levante la plaquita y aspire el soporte del pozo. Trabajando rápidamente, agregue el quimioattractante a la cámara inferior. Para un plato de 24 pozos, agregue 750 s de DMEM con 5% DE FBS.
- Coloque la plaquita en el pozo y agregue las celdas a la plaquita. Para un plato de 24 pozos, utilice 500 s de suspensión celular. Para un inserto de plato de 6 pozos, utilice 2,5 ml de quimioattract y 2 ml de células. Asegúrese de que no haya burbujas de aire a ambos lados de la membrana.
- Devolver el plato a la incubadora de cultivo celular durante 22 h.
- Después de 22 h, fijar y manchar las células. Prepare una solución de 1% de paraformaldehído en 1x solución salina tamponada de fosfato (PBS) para la fijación.
- En un plato limpio de cultivo celular de 24 pozos, agregue 1 ml de fijación a los pozos individuales para que haya un pozo para cada plaquita.
- Preparar la solución de tinción (recién hecha) de 0,1% de cristal violeta (p/v) en una solución de PBS con 10% de etanol (v/v). Del mismo modo, agregue 1 ml de solución de tinción a un pozo limpio en un plato de cultivo de 24 pozos para cada plaquita.
- Retire cada plaquita de uno en uno con fórceps y coloque un hisopo de algodón estéril dentro de la plaquita y frote el lado superior de la membrana para eliminar las células no migradas.
- Repita con un segundo hisopo de algodón. La membrana es bastante fuerte, por lo que la presión suave mientras que el swabbing no compromete la integridad de la membrana.
- Retire los medios restantes del interior de la plaquita y agregue 750 ml de PBS para lavar las células separadas.
- Retire el PBS y repita el lavado. Coloque el inserto en un pozo que contenga un fijador para fijar las células migradas en la parte inferior de la membrana. Repita el proceso para todas las inserciones.
- Fije las plaquitas durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Después de la fijación, retire la plaquita. Lave el inserto de nuevo con 750 s PBS.
- Coloque la plaquita en el pozo con la solución de tinción para manchar todas las celdas migradas y fijas. Mancha las células durante 15 min a temperatura ambiente.
NOTA: Para plaquitas de plato de 6 pozos, utilice 2 ml de solución fijativa, solución de tinción de 2 ml y 2 ml de lavado PBS.
- Utilice un vaso de precipitados con agua destilada para desestarinar las plaquitas. Retire las plaquitas y sumerja en el agua destilada hasta que el agua que sale de la plaquita esté clara.
- Retire el exceso de gotas de agua y coloque las plaquitas en un papel de filtro en paralelo para secar al aire (normalmente durante la noche).
- Prepare la membrana para la toma de imágenes etiquetando un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio para cada inserto y coloque una pequeña gota de aceite de inmersión del microscopio en el centro de la diapositiva.
- Separe la membrana de la plaquita utilizando un bisturí para cortar alrededor del perímetro de la membrana en el interior de la plaquita de plástico.
- Retire la membrana con fórceps y colóquela en la parte superior de la gota de aceite en la corredera para mantenerla en su lugar.
NOTA: Las membranas son muy delgadas y muy ligeras, por lo que se pueden perder fácilmente por un flujo de aire suave.
3. Imágenes y análisis
- Dado que las membranas porosas son claras y las células de tinción con cristal violeta les dan contraste, utilice un microscopio de luz compuesto para ver las células. Utilice una cámara y/o software para cuantificar muchas muestras, pero no es necesario. Vea las celdas con un aumento de 5x, 10x o 20x. Para la cuantificación, utilice varias imágenes no superpuestas con un aumento de 10x. Alternativamente, cuente todas las células migradas en la membrana con aumento de 10x.
- Determine el número total de células o celdas invasoras por área para todas las muestras. Para cada experimento, realice cada condición del ensayo con tres inserciones de réplica y repita varias veces para obtener resultados estadísticamente útiles.
- Al comparar diferentes líneas celulares con diferentes tasas de crecimiento y tasas de migración, realice un experimento paralelo para comparar las células que invaden a través de una matriz proteica y se comparen con un ensamblaje de Boyden Chamber sin matriz proteica (solo células migradas). Calcular el porcentaje de invasión para cada línea celular (Número de celdas invadidas/número de celdas migradas x 100%).
NOTA: Este enfoque puede ayudar a comparar la tasa de invasión con las tasas de migración. Si se comparan condiciones diferentes aplicadas a la misma línea de celda, el cálculo de la invasión por sí solo es cálculos más relevantes. El borde exterior de la membrana a veces tiene un mayor número de células que las áreas centrales y, por lo tanto, es menos preciso. Si esto ocurre, excluya esas células de la cuantificación y asegúrese de que todas las células se eliminan mediante un hisopo de algodón en un experimento repetido.
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Representative Results
Este método de invasión in vitro a través de una matriz proteica se utilizó para evaluar los fenotipos agresivos y los comportamientos celulares oncogénicos de las células tumorales mamarias de ratón con expresión alterada de la proteína de dedo de zinc ZC3H88. Junto con otros enfoques que también examinan la migración celular y el crecimiento en entornos 3D, se encontró que niveles más altos de expresión de Zc3h8 en las líneas celulares tumorales, o por expresión mediada por el promotor de un plásmido, dio lugar a tasas rápidas de la proliferación, la migración rápida, el crecimiento en entornos 3D y el aumento de la invasión en el ensayo de invasión in vitro8. Por el contrario, la disminución de la expresión por construcciones deARNs Shr dio lugar a una proliferación, migración e invasión menos agresivas 8. Estos resultados se confirmaron in vivo donde una mayor expresión de Zc3h8 produjo tumores más grandes que aparecieron rápidamente, mientras que la disminución de la expresión produjo menos tumores que eran más pequeños y menos frecuentes8.
Para expandir ese trabajo, los plásmidos de expresión que pueden rescatar el derribo mediado de shRNA de la expresión Zc3h8 fueron piscados de forma estable en las células mamarias del ratón para evaluar si el crecimiento y el comportamiento celular agresivo podrían restablecerse en estas células. Todos los derribos y rescates de expresiones fueron verificados por western blot o RT-qPCR8. Se utilizó un ensayo de invasión con 5.000 células por cámara en un plato de 24 pozos y se documentó con fotografías como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. La Figura 3 muestra los resultados del ensayo de invasión que demuestran cómo la invasión celular disminuyó al desalojar shRNA de la expresión Zc3h8, pero esa invasión se rescata cuando se rescata la expresión. Estos datos muestran que el ensayo de invasión puede proporcionar un método rápido para probar líneas celulares in vitro antes de embarcarse en enfoques más costosos y largos.
Figura 1: Componentes de ensayo de invasión. (A) Inserto de cámara Boyden para un plato de cultivo de tejido de 24 pozos. (B) Un plato de cultivo de tejido de 24 polos utilizado para la fijación, tinción y lavado después de 22 h de incubación con células. Los números 1, 2 y 3 son réplicas de una sola línea de celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo de ensayo de invasión con la escala de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados del ensayo de invasión de muestras de células tumorales mamarias de ratón alteradas para la expresión de Zc3h8, que cambia el fenotipo oncogénico. (A, B) Las células aisladas de los tumores mamarios del ratón se transtornudaron de forma estable con ShRNA apuntando a una secuencia de control de ARNm o apuntando al ARNm Zc3h8. (C) La línea celular posterior fue rescatada expresando Zc3h8 recombinante diseñado para no verse afectado por el ARNS. Las células se tiñen con violeta cristalino y se capturan a un aumento de 10x utilizando un microscopio de luz. Barra de escala de 500 m. (D) Cuantificación que muestra que la expresión reducida de Zc3h8 disminuyó el número de células invasoras y el potencial de metástasis. El rescate de la expresión génica rescata mayores tasas de invasión celular. Los valores representan el número total de celdas invasoras de una inserción de ensayo de invasión de 24 pozos. Para cada réplica en el experimento, se calculó el número medio de células invasoras. Esto se repitió durante tres experimentos. Las barras de error indican un error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El ensayo de invasión in vitro es un método económico, rápido, cuantitativo y sencillo para estudiar los factores que promueven la invasión de células cancerosas. El cáncer de mama es el cáncer diagnosticado con mayor frecuencia entre las mujeres. De los tres principales subtipos de cáncer de mama, triple negativo, (o ER-, PR-, HER2/neu-), es el más agresivo, más propenso a metástasis, y más mortal9. Por lo tanto, comprender los genes y la expresión que resultan en metástasis puede ayudar a encontrar nuevas dianas terapéuticas y marcadores genéticos para la enfermedad. Si bien muchos de los genes importantes para la invasión y metástasis de las células cancerosas han sido identificados y caracterizados, los niveles de expresión y la actividad de los conductores de metástasis frente a los supresores de metástasis pueden ser un aspecto crítico de la progresión de la enfermedad9, 10.
Más allá de la expresión génica, el ensayo de invasión in vitro también se ha utilizado para estudiar el papel del microARN y otros reguladores en la promoción o prevención de la invasión de células cancerosas11,12. El método de configuración de invasión in vitro se puede utilizar para el estudio de inhibidores, entornos tumorales de tipo multicélula, células editadas por CRISPR o cambios a corto plazo en entornos de crecimiento celular. La versatilidad y adaptabilidad hacen que este ensayo sea muy ventajoso.
El ensayo de invasión se puede utilizar en un primer paso en el análisis de genes y factores que contribuyen o previenen la progresión del tumor. Por ejemplo, Yan y otros (2010) utilizaron los ensayos de invasión in vitro para definir el papel de GATA-3 en la supresión de la EMT por la línea celular de cáncer de mama altamente agresiva MDA-MB 23113. Luego fueron capaces de mostrar que esta supresión se correlacionó con una disminución de la capacidad de formar metástasis en un ensayo in vivo13. Las posibles estrategias terapéuticas se pueden caracterizar inicialmente por la capacidad de los inhibidores de la vía para limitar la invasión a través de Matrigel, también correlacionando con el efecto de estos inhibidores en la formación de tumores en modelos animales. El ensayo de invasión in vitro se puede utilizar para un análisis más detallado de oncogenes conocidos y potenciales y socios que interactúan. Por ejemplo, la disección molecular de motivos funcionales conocidos de una oncoproteína o el análisis rápido de mutaciones se puede hacer con el ensayo de invasión in vitro como una pantalla inicial o una evaluación de la importancia. Esto puede proporcionar información valiosa sobre los dominios críticos, así como una comprensión funcional de los fenotipos celulares a nivel molecular.
Si bien el ensayo de invasión de la Cámara Boyden tiene muchas ventajas, hay limitaciones. Por ejemplo, el ensayo de invasión sólo examina la intravasión, uno de los pasos iniciales de la metástasis, pero no los pasos posteriores cuando las células cancerosas colonizan ubicaciones secundarias. Por lo tanto, sólo se puede concluir una vista parcial del potencial de metástasis. La longitud de 22 h del ensayo, aunque flexible, no puede excluir alguna división celular que podría sesgar cambios sutiles en la medición de la invasión de poblaciones celulares asíncronas. Inhibidores como la mitomicina C se pueden utilizar para prevenir la división celular en el caso de las células de buceo rápido. Por último, el uso de una solución FBS al 5% para quimiotaxis se difundirá lentamente con el tiempo y se equilibrará entre las cámaras superior e inferior. La densidad del gel proteico ralentiza esta difusión y presenta a las células la opción de migrar lateralmente a través del gel y la membrana (haplotaxis) o a través de la matriz proteica y a través de los poros hacia las mayores concentraciones de FBS (quimiotaxis). Los agentes quimiotaxis alternativos pueden ser sustituidos o se pueden utilizar asignaciones de tiempo más cortas para la invasión para medir sólo las células que invadieron antes del equilibrio. Es la flexibilidad, no la rigidez, del ensayo de invasión in vitro lo que permite la personalización lo que hace que este ensayo sea tan útil. Las adaptaciones futuras de este ensayo incluyen un cribado a gran escala de compuestos, cambios en la expresión génica y evaluación de la eficacia de los fármacos específicos del alelo. Además, un sistema de doble cámara con medios circulantes podría desafiar a las células a invadir a través de una matriz proteica, atravesar un entorno líquido y restablecer una segunda matriz proteica en una ubicación secundaria. Por último, se puede utilizar una membrana más desafiante con el sistema de ensayo de invasión in vitro, como una monocapa de células no invasivas que sería más difícil de cruzar para las células cancerosas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención R15CA169978 de los Institutos Nacionales de Salud. La financiación adicional provino de la Universidad de Villanova.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
References
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