Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/59744
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Molecular Neuro-oncology Laboratory, Brown University, Rhode Island Hospital, 2University of Minnesota, College of Veterinary Medicine, 3Department of Neurosurgery, Brown University

Summary

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Abstract

Glioblastom, yoğun hücresel heterojenlik ve hGC'lerin göç özellikleri nedeniyle en agresif insan kanserlerinden biridir. Glioma hücre göçünaltında yatan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için tümör mikroortamında hGC'ler ve aksonlar arasındaki etkileşimi inceleme yeteneği esastır. Bu hücresel etkileşimi modellemek için hGC'ler ve dorsal kök gangliyonu (DRG) akson-oligodendrocyte ortak kültürlerden oluşan karma bir kültür sistemi geliştirdik. DRG kültürleri, verimli bir şekilde izole edilebildikleri ve bu tür göç çalışmaları için ideal olan uzun ve kapsamlı projeksiyonları oluşturabildikleri için seçilmiştir. Saflaştırılmış sıçan oligodendrocytes sonra saflaştırılmış sıçan DRG aksonlar eklendi ve miyelin indüklenen. Kompakt miyelin oluşumunu doğruladıktan sonra, hGC'ler nihayet co-kültüre eklendi ve DRG akson ve oligodendrositler ile etkileşimleri zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlendi. Bu koşullar altında, HGC'ler GFAP ve Ki67'yi ifade eden tümör benzeri agrega yapıları oluştururlar, hem miyelinli hem de miyelinsiz aksonal izler boyunca göç eder ve psödopodi oluşumu yoluyla bu aksonlarla etkileşime girilir. Ex vivo co-kültür sistemimiz hGC göçünün yeni hücresel ve moleküler mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir ve potansiyel olarak in vitro ilaç etkinliği testi için kullanılabilir.

Introduction

Glioblastom insan beyninin en agresif ve ölümcül tümörlerinden biridir. Mevcut bakım standardı, tümörün cerrahi rezeksiyonu ve ardından radyasyon1 artı eşlik eden ve temozolomide2'ninadjuvan uygulamasıdır. Bu multi-terapötik yaklaşım la bile, tümör nüks kaçınılmazdır3. Bu kısmen tümör hücrelerinin geniş göç doğası nedeniyle, beyin parankim istila beyin içinde birden fazla parmak benzeri projeksiyonlar oluşturarak4 tam rezeksiyon olası hale.

Son yıllarda, bu glioblastoma saldırganlık nedeniyle olduğu ortaya çıkmıştır, kısmen, tümör kitle içinde kanser kök hücrelerinin bir popülasyonvarlığı nabağlı5,6, yüksek göç potansiyeli sergileyen7,8, kemoterapi ve radyasyona direnç9,10 ve ikincil tümörler oluşturmak için yeteneği11. GSC'ler çıplak farelere xenografted zaman orijinal poliklonal tümörler recapitulating yeteneğine sahiptir5.

Glioblastomların genetik geçmişi ile ilgili bilgi zenginliğine rağmen, glioma hücreli (GC) göçü üzerine yapılan çalışmalar şu anda etkin in vitro veya in vivo göç modellerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Özellikle, glioma hücre-aksonal etkileşimleri hücresel ve çevresel faktörler tarafından modüle glioma invazyonunun temel bileşeni olmakla birlikte, bizim bilgimize göre şu anda bu etkileşimleri modelleme yeteneği ile hiçbir deneysel sistem yoktur12,13,14. Bu eksikliği gidermek için, farklılaştırılmış tümör belirteçlerinin yüksek ekspresyonunun yanı sıra hGC'lerin miyelinatlı ve miyelinatlı olmayan liflerle etkileşiminin yanı sıra, saflaştırılmış DRG akson-oligodendrositlerle birlikte kültürlenen primer hGC'lerden oluşan bir ex vivo kültür sistemi geliştirdik. Bu ex vivo platformu, bölümlere ayrılmış düzeni nedeniyle, hGC göç desenleri üzerinde yeni terapötik etkilerini test etmek için uygundur.,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hasta kaynaklı insan glioma hücrelerinin toplanması, izole edilmesi ve yayılması na yönelik protokoller Rhode Island Hastanesi'nin IRB komitesi tarafından onaylandı. Tüm hayvanlar, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre muhafaza edilmiştir. Tüm hayvan kullanım protokolleri Rhode Island Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Medya ve tampon preparatları

  1. Prepare 50 mL of Neurosphere Media: 1x Neuronal basal medium w/o vitamin A, 1x serum free supplement w/o vitamin A, 2 mM L-glutamine, 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF), 20 ng/mL basic-fibroblast growth factor (FGF), 2 μg/mL heparin, and 1x antibiotic-antimycotic (anti-anti).
  2. Hazırlayın 50 mL takviye Nöronal Bazal Orta: 1x Nöronal bazal orta, 1x serum serbest takviyesi, 4 g /L D-glukoz, 2 mM L-glutamin, ve 50 ng / mL sinir büyüme faktörü (NGF).
  3. Hazırlamak 500 N2B2 Orta: 1:1 Dulbecco Modifiye Eagle Medium-Ham's F12 Besin Karışımı (DMEM-F12), 1x İnsülin-Transferrin-Selenyum (ITS-G), 66 mg/mL büyükbaş serum albumin (BSA), 0.1 mg/mL transferrin, 0.01 mg/mL biotin, 6.29 mg/mL progesteron, 5 g/mL N-Asetil-L-sisin (NAC) ve 1 mM putriscine. Aliquot ve -20 °C'de dondurun.
  4. 500 mL C-Medium hazırlayın: 1x Minimum Esansiyel Orta (MEM), D-glukoz (son 4 g/L), %10 fetal büyükbaş serum (FBS) ve 2 mM L-glutamin. Aliquot ve -20 °C'de dondurun. Kullanmadan önce sinir büyüme faktörü (NGF) taze ekleyin (50 ng/mL).
  5. Hazırlayın 200 papain tampon mL: 1x Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS), 100 mM Mg2SO4, 30% Glikoz, 0.25 M EGTA, ve 1 M NaHCO3.
  6. 10 mL DMEM-ITS-G Orta: 1x DMEM, %0.5 BSA ve 1x ITS-G hazırlayın.
  7. 200 mL PB Tampon hazırlayın: 1x Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) Ca2+ ve Mg2+ ve %0.5 BSA olmadan. Kullanmadan önce tampon degas ve buz üzerinde tutmak.

2. Glioma Kök Hücre Nörosferlerinin İzolasyon ve Kültürü

  1. Nörosferlerin İzolasyon
    1. Ameliyathaneden IRB onaylı ve hasta onaylı taze insan glioblastom (GBM) dokusunu toplayın. 2x anti-anti içeren DPBS'de buz üzerinde GBM numunelerini BL2 sertifikalı biyolojik güvenlik kabine aktarın.
    2. Minimal nekroz veya kırmızı kan hücresi kontaminasyonu ile bir 1 cm3 GBM numuneyi 60 mm'lik bir tabağa aktarın ve 1 mm3 parçaya bölünün; fazla DPBS'yi kaldırın.
    3. 37 °C'de 30 dakika boyunca 5 mL kollajenaz/dispas (1 mg/mL) ile dokuyu sindirin ve her 5-10 dakikada bir yavaşça çevirin.
    4. Sindirilmiş parçaları 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve dokuyu ayrıştırmak için 10 mL'lik pipetle birkaç kez pipetleme yaparak triturate.
    5. Neurosphere Media eşit hacimli ekleyin ve tekrar doku triturate; büyük parçaların yerleşmesine izin verir.
    6. Doku parçaları olmadan ortamı çıkarın ve taze bir 50 mL tüp üzerine yerleştirilen 70 μM hücreli süzgeçten yavaşça geçirin.
    7. Tüm doku ayrıştırılmış olana kadar 2.1.5-2.1.6 adımlarını tekrarlayın, gerektiğinde hücre süzgeci değiştirin.
    8. Hücre süspansiyonuna 10 dakika boyunca 110 x g'de döndürün.
    9. Süpernatant çıkarın ve kırmızı kan hücresi kontaminasyonu kaldırmak için ACK lysing tampon 10 mL pelet resuspend. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
    10. Hücre süspansiyonuna 110 x g'de 5 dk çevirin.
    11. Nörosfer Media'nın 10 mL'lik süpernatant ve resuspend hücrelerini çıkarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL trypan mavisi ile seyreltin. 100 mm süspansiyon kültür plakalarında 3 x 106 hücre yoğunluğunda Neurosphere Media'nın 10 mL'sinde otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre ve plaka kullanarak hücre süspansiyonunun 10 μL'sini sayın.
    12. Kültüre haftada 2-3 kez 2 mL taze Nörosfer Medya ekleyin.
      NOT: Nörosferler 3-4 hafta içinde süspansiyon içinde oluşacaktır. 2-4 kez subculturing sonra, daha önce açıklandığı gibi bağışıklık azlamış farelerde ksenografik transplantasyon yoluyla sınırlayıcı seyreltme tözve tümör recapitulation ile kök doğrulamak 22.
  2. Alt-culturing Nörosferler
    1. Küreler 200-500 μm arasında bir çapa ulaştığında, nörosferleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dk boyunca 110 x g'de döndürün.
    2. Önceden ısıtılmış hücre ayırma çözeltisinin 1 mL'sinde nörosferleri yeniden askıya alın.
    3. 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Bir P200 pipetini 150°L'ye ayarlayın ve nörosferleri ayrıştırmak için yukarı ve aşağı borular oluşturarak üçleme ayarlayın.
    5. Ayrık hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Nörosfer Medya 4 mL ekleyin ve 5 dakika için 300 x g spin.
    6. Nörosfer Medya 5 mL supernatant ve resuspend hücreleri çıkarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL trypan mavisi ile seyreltin. 4 mL son hacminde 1 x 106 hücre/60 mm çanak yoğunlukta otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre ve plaka kullanarak hücre süspansiyon 10 μL saymak.
    7. Medyayı haftada 2 kez ve gerektiğinde alt kültür hücrelerini yenileyin. Nöronal bazal ortamda istendiğinde tüm nörosferleri dondurun w /o vitamin A %10 DMSO ile desteklendi. Nörosferler P4'ten sonra deneyler için kullanılabilir.

3. Sıçan Dorsal Kök Ganglia (DRGs), Oligodendrositler (OPCs) ve hGCs bölmeli kültür

  1. Bölmeli kültür yemeklerinin hazırlanması
    NOT: DrG'lerin planlanan hasat gününden önceki günlerde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Bölmeli kültür yemeklerini bir araya getirin.
    2. Steril distile H2O 500 μg/mL kolajen stok çözeltisi seyreltin; iyice karıştırın.
    3. Steril transfer pipeti ile 35 mm'lik bir kültür kabını 2 mL kollajen çözeltisi ile doldurun; arkada kollajen ince bir film bırakarak, çözeltiyi çıkarın ve sonraki 35 mm çanak içine yerleştirin. Tüm yemekler kaplanana kadar gerektiğinde daha fazla kollajen çözeltisi ekleyerek bu işlemi tekrarlayın.
    4. Tüm plakalar kaplandıktan sonra, plakaları 245 mm x 245 mm kültür tepsisi içine yerleştirin ve tepsinin ortasına üç 1 mm x 1 mm gazlı bez ped yerleştirin.
    5. Kollajen polimerize etmek için, konsantre amonyum hidroksit 1 mL ile ıslak gazlı bez pedleri ve 15 dakika boyunca tepsileri kaplayın.
    6. Gazlı bez pedleri çıkarın ve 35 mm'lik yemeklerin laminar akış kaputunda kurumasını bekleyin.
    7. Yemekler kururken, şırınga gres aplikatörünün namlusu yüksek vakum yağı ile yükleyin. Bölmeli odaları distile su yla dolu büyük bir ağız lı ortam şişesine yerleştirin. Hem otoklavlama ile sterilize ve soğumasını bekleyin.
    8. Künt bir ipucu vermek için 18-G'lik bir ihtiyaç duyulduğu noktayı dosyala. %70 etanol ile sterilize edin. İğneyi yağ şırıngasına takın.
    9. % 70 etanol ıslatarak pin tırmık sterilize; laminar akış kaputunda hava-kurumasını bekleyin.
    10. Kapağı kuru, kollajen kaplı 35 mm'lik bir tabaktan çıkarın. Başparmağıve işaretparmağı arasında çanak tutun. Pimtırobunu diğer elinizle tutun. Yemeğin merkezinde 200 μM genişliğinde çizikler oluşturmak için sağlam bir basınç uygulayın.
    11. Bir mera pipet kullanarak, çiziklerin merkezine Takviye Nöronal bazal Orta iki damla yerleştirin.
    12. Tüm yemekler çizilene kadar 3.1.10-3.1.11 adımlarını tekrarlayın.
    13. Bölmeli odaları laminar akış başlığında kurulayın.
    14. Steril hemostatik forceps ile, merkezi bölücü tarafından bir bölmeli oda kavramak. Hemostatik forceps çevirin böylece odanın alt yukarı bakacak.
    15. Silikon gresi bölmeli hazneye, üstten başlayarak uygulayın. Gresin düzgün cerendildiğinden ve her köşeye çakışdığından emin olun.
    16. Kapağı 35 mm'lik bir tabaktan çıkarın. Çanak ters ve oda üzerinde çizikler yerleştirin. Bir çift forceps ile yavaşça plakanın altına dokunun.
    17. Hemostatik forceps kullanarak plakayı yavaşça ters çevirin. Forcep'leri serbest bırak.
    18. Orta bölmenin tabanına bir yağ yığını yerleştirin. Takviye Nöronal Bazal Orta (NB) ile her oda doldurun ve sızıntıları kontrol edin. Gerektiğinde silikon gres ile sızdırmazlık.
    19. Tüm kültür yemeklerini montajına devam edin ve bir gecede 37°, %5 CO2'desaklayın.
  2. Bölmeli Odada Fare DRG Nöronların ve Kültürünün İzolasyon
    1. Zamanlanmış hamile E16 Sprague-Dawley sıçanı CO2 boğulması veya kimyasal doz aşımı ile kurban edin.
    2. Temiz bir yüzeye supine pozisyonda hayvan yerleştirin; % 70 etanol ile karın dezenfekte.
    3. Forseps ile alt karın deri kavramak ve hafifçe kaldırın.
    4. Makas kullanarak, karın duvarının kaslarını delmemeye dikkat edin, hayvanın orta hattı boyunca bir "I" kesi yapın.
    5. Forceps temiz bir çift ile, kas duvarı kavramak ve rahim veya bağırsak delmek için dikkatli kullanarak makas temiz bir çift ile bir enine kesi yapmak.
    6. Künt forseps bir çift ile, rahim kavramak ve yavaşça periton boşluğundan düz yukarı kaldırın.
    7. Taze, steril makas kullanarak, her rahim boynuzu tabanında bağ dokusu klip.
    8. Steril bir 100 mm doku kültürü çanak tüm rahim yerleştirin.
    9. Diseksiyon için rahim bir laminar akış kaputuna taşıyın.
    10. Embriyoları birer birer amniyotik keseden geçirerek ve embriyoyu hafifçe dışarı çıkararak ve 5 mL L-15 içeren 60 mm'lik bir tabağa 1x kalem-strep ile çıkararak rahimden çıkarın.
    11. İnce büşreler ile 3-4 embriyoları 1x kalem strep ile 5 mL L-15 içeren 60 mm'lik bir tabağa yerleştirin.
    12. Bir diseksiyon mikroskobu altında ve her seferinde bir embriyo ile çalışmak, decapitation tarafından ötenazi.
    13. Yalan embriyo ventral tarafı yukarı ve bacaklar ve kuyruk kaldırın.
    14. İnce bütüller ile, hayvan bir orta hat kesi yapmak.
    15. Dorsal yapıları ortaya çıkarmak için iç organları ve doku çıkarın, tamamlandığında görünür olmalıdır özellikle omurilik.
    16. Vertebral kolon ve spinal kanal arasında mikro-diseksiyon makas bir bıçak yerleştirin ve dikkatle omurilik ortaya çıkarmak için vertebral sütun ile kesti. Omuriliği kesmemeye dikkat edin.
    17. İnce forsepsile, omuriliğin rostral ucunu hafifçe kavrayın ve yavaşça embriyodan kaldırın. DrG'ler omurilik ve omuriliğine bağlı olacak.
    18. Omurilik ve bağlı DRG'leri 1x kalem-strep ile 2 ml L-15 içeren 35 mm'lik bir tabağa aktarın. Buzun üzerine yerleştirin.
    19. Tüm omurilik izole edildikten sonra, tek tek omurilik DRGs koparmak için ince forceps kullanın. DrG'leri 35 mm'lik taze bir tabağa yerleştirin.
    20. DrG'lerde sinir kökleri varsa, onları kırpın.
    21. 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesinden hazırlanmış 35 mm tabakları çıkarın. Ortamı önceki günden kaldırın. Orta bölmeye 10 μM 5-Floro-2'-deoksiürin (FUDR) içeren 80 μL'lik Takviye Nöronal Bazal Medya (NBF) ve her dış bölmeye 250°L ortam yerleştirin.
    22. Her orta bölmeye 2 ganglia yerleştirin. Bulaşıkları 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine geri döndürün.
    23. Ertesi gün 2,5 mL NBF ekleyin.
    24. Tablo 1'dekiprogramı izleyen kültürleri besleyin , DRG hazırlığına başlamak için seçilen güne göre programı değiştirin.
    25. 21. günde (veya aksonlar distal bölmelerin sonuna ulaştığında), ya GBM nörosfere sahip tohum kültürleri (Adım 3.2.26'ya geçin) ve canlı görüntü veya oligodendrosit kültürleri ile kültürleri yenilince (Adım 3.3'e geçin) ve gbm nörosferli tohum miyelinasyondan sonra.
    26. %10 FBS içeren Tamamlayıcı NB Medium ile bir GBM nörosfer ile tohumlanacak her distal bölmeli haznede Takviye NB Orta değiştirin.
    27. P20 pipet10 μL'ye ayarlanmış bir ile kültür çanamından bir GBM nörosferi çıkarın. GBM nörosfer boyutu yaklaşık 200 mikron ölçmek gerekir.
    28. Pipetin ucunu distal hazneye yerleştirin ve GBM nörosferini yavaşça dışarı at, böylece orta hazneye en yakın distal odanın orta haznesine en yakın kısmındaki aksonların üzerine, merkez hazneye yakın aksonların üzerine yavaşça düşer. Pipet ucunun aksonları bozmasına dikkat edin.
    29. GBM nörosferin intremiiçin izin vermek için oda sıcaklığında 1 saat için biyogüvenlik kabininde kültür bırakın.
    30. Nörosfer bağlandıktan sonra, distal bölmedeki ortamı takviye li NB Medium ile çok dikkatli bir şekilde değiştirin.
    31. 3-7 gün boyunca canlı görüntü kültürleri, gerektiğinde medya ekleyerek. Bu durumda, brightfield kullanarak hücre geçişini 7 gün boyunca sürekli olarak izlemek için mikroskoba bağlı kontrollü bir CO2 canlı hücre muhafazası (örneğin, Zeiss Axiovert) kullanılmıştır. Görüntüler ilişkili yazılım kullanılarak her 10 dakikada bir elde edildi. GFP'yi ifade etmek için uygun şekilde transfeced olan hGC'ler kullanılarak aynı protokolü tekrarlayın ve görüntüler brightfield ve 488 nm lazer kombinasyonu kullanılarak yakalandı.
      NOT: Nörosferler lentivirüs ile transdükmedilebilir veya plazmidler veya siRNA'larla transfekte olabilir. Bölmeler de göç çalışma için istenen küçük molekül inhibitörleri ile tedavi edilebilir.
  3. Oligodendrocytes ile DRG Akson Miyelinasyonu
    1. Oligodendrocyte izolasyonundan bir gün önce, DRG'lerde NB Medium'u C-Medium ile değiştirin.
    2. Diseksiyondan önce, 10 mL'lik Papain Tampon'u kuvözdeki 60 mm'lik bir tabağa yerleştirin.
    3. Laminar akış kaputunda, bir adet 100 mm çanak ve bir adet 60 mm'lik çanak ile buz gibi HBSS doldurun. Buzun üzerine yerleştirin.
    4. Bir P2 fare yavrusunun kafasını keserek kurban edin. Bir makas kullanarak deriyi çıkarın. Deri çıkarıldıktan sonra, ince makas bir çift ile orta hat boyunca kafatası kesti.
    5. Kafatasını ince ponplarla hafifçe çıkarın. Bir spatula kullanarak, yavaşça kafatasının altından beyin kepçe ve ters doku kültürü plaka kapağına transfer.
    6. Beyincik çıkarın ve iki serebral hemisfer içine serebrum bölün. Koku ampulleri kaldırın, hipokampus, ve bazal ganglia her yarımkürenin serebral korteks altında. Serebral korteksini HBSS içeren 100 mm'lik tabağa yerleştirin. Kalan hayvanlar için 3.3.4-3.3.6 adımlarını tekrarlayın.
    7. Bir seferde bir korteks ile çalışma, ince Dumont forceps ile menenjler çıkarın. Tüm menenjitsiz korteksleri HBSS ile 60 mm'lik taze yemeklere yerleştirin.
    8. Kortikal dokuyu 1 mm3 parçaya bölün. Buzun üzerine yerleştirin.
    9. 15 mL tüp içine dengede Papain Tampon yerleştirin. Papain 200 adet ve 2 mg L-sistein ekleyin. Filtre sterilize ve steril DNase I 200 μL ekleyin.
    10. Doğranmış beyin dokusundan HBSS çıkarın ve Papain Tampon ile değiştirin 3.3.2. Çanak 37 °C, % 5 CO2 kuluçka 80 dakika, yavaşça her 15 dakika sallayarak yerleştirin.
    11. Sindirilen dokuyu 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 2 mL C-medium ekleyin.
    12. Dokuyu ayrıştırmak için 5 mL serolojik pipet ile trituat; daha büyük doku parçalarının yerleşmesine izin verir. Supernatant'ı çıkarın ve steril 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    13. 2 mL C-Medium ekleyin ve 5 mL serolojik pipet ile bir kez daha triturasyonu tekrarlayın. 1 mL pipet ucuna geçin ve doku tamamen ayrışına kadar triturate. 15 mL tüpe aktarın.
    14. Triturated dokuyu 15 dk için 300 x g'da döndürün.
    15. Önceden ıslak steril 30 μM hücreli süzgeç ile 2 mL PB Tampon. Hücre süzgecini 50 mL'lik bir tüpün üzerine yerleştirin ve hücre süspansiyonuna bir seferde 1 mL filtre uygulayın. Filtreyi 5 mL PB Arabellek ile durula.
    16. Hücre süspansiyonunun 100 mm bakteriyolojik plakaya aktarılması; mikroglia eklemek için izin vermek için 37 °C,% 5 CO2 kuluçka için 15 dakika kuluçka.
    17. Ortamı çıkarın ve 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Plakayı 2 mL DMEM-ITS-G orta sıyla hafifçe durulayın ve 15 mL'lik tüpe aktarın.
    18. Hücre süspansiyonuna nazikçe geri alın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μl trypan mavisi ile seyreltin. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre süspansiyonunun 10 μl'ını sayın.
    19. Hücre süspansiyonuna 300 x g'de 10 dakika döndürün.
    20. Her 1 x 107 hücre için 70 μL PB Tampon'da hücreleri tamamen aspire edin ve yeniden askıya alın. İyice karıştırın ve 4 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
    21. Her 1 x 107 hücre için 20 μl anti-A2B5 mikroboncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    22. Her 1 x 107 hücre için 1-2 mL PB Tampon ve 4 °C santrifüjde 10 dk için 300 x g'de santrifüj ekleyin.
    23. Aspire süpernatant tamamen. 500 μL PB Tampon'da toplam 108 hücreye kadar yeniden askıya alın. Buzda kal.
    24. Bir ayırıcının manyetik alanına manyetik boncuk sütunu yerleştirin.
    25. 500 μL PB Arabellek ile durulayarak sütunu hazırlayın. Hücre süspansiyonu sütuna uygulayın. Akış akışını bir atık kabına atın (bu etiketlenmemiş hücreler içerir).
    26. Kolonu 500 μL PB Arabellek ile 3 kez yıkayın. Akış tan atın.
    27. Sütunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve toplama tüpüne yerleştirin.
    28. Sütunüzerine PB Tampon Pipet 1 mL. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri, pistonu sütuna sıkıca iterek temizle.
    29. Hücre fraksiyonuna 4 mL C-Medium ekleyin ve 10 dk için 300 x g'de döndürün.
    30. 5 mL N2B2 Medium'da süpernatant'ı çıkarın ve yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL trypan mavisi ile seyreltin. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre süspansiyonunun 10 μL'sini sayın.
    31. Plaka oligodendrocytes 150.000 hücre konsantrasyonu tam genişletilmiş akson ile bir DRG içeren bölmeli oda başına.
    32. Ertesi gün bölme odasındaki ortamı n2B2 olarak değiştirilerek miyelinasyona izin verin. Her 2-3 günde bir ortamı değiştirin. Miyelin14 gün içinde tamamlanacak.
    33. Gün 14, 3.2.26-3.2.32 gibi bir GBM nörosfer ile tohum kültürü. Herhangi bir deney süresince N2B2 Medium'da miyelinlenmiş kültürleri koruyun.
      NOT: Protokol Şekil 1'deakış şeması şeması olarak sunulmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aksonlarla hGC'lerin etkileşimini incelemek için, daha önce açıklandığı gibi saflaştırılmış DRG aksonları üretti15,16,17,18. Bu saflaştırılmış DRG aksonlar daha sonra aksonal ağ içinde entegre GFAP +/Ki67+ tümör benzeri yapılar oluşturan hGC'ler ile tohumlanırken, tek tek hGC'ler aksonlar arasında birlikte veya arasında göç ettiler (Şekil 2). HGC'lerin miyelinli aksonlarla nasıl etkileştiğini belirlemek için, DRG akson kültürlerini saflaştırılmış sıçan oligodendrositlerle tohumladık ve daha önce açıklandığı gibi miyelinasyonu indükledik19,20,21. Miyeline DRG-oligodendrocyte co-kültürlerde hGC'lerin eklenmesi, hGC'lerin miyelinli aksonlarla birlikte ve son yazımızda gösterildiği gibi psödopodi oluşumu yoluyla tümör kitlesinden uzak olarak göç ettiğini göstermiştir (Şekil 3)22. Oligodendrosit miyelinasyonu kültürlerin Miyelin Bazik Protein (MBP) boyaması kullanılarak belirlenebilir. Bu kültürlerdeki hGC'lerin geçişini ölçmek için, Image J yazılımı22kullanarak göç eden hGC'lerin işgal ettiği kültürün toplam alanını ölçtük.

Pazartesi Çarşamba Cuma
GÜN 1 NBF
HAFTA 1 Nb NBF Nb
2. HAFTA NBF Nb Nb
HAFTA 3 Nb Nb

Tablo 1: DRG kültürlerinin beslenme programı.

Figure 1
Şekil 1: Protokolün şematik özeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: hGC'ler DRG aksonlarla birlikte tümör benzeri yapılar oluştururlar. Kültür, gfap (kırmızı) ve Ki67 (yeşil) tümör belirteçleri için sabit ve lekeli yken, aksonlar Nörofilament (mavi) ile boyandı. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakam bizim son yayınlanan kağıt22değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: hGC'ler miyelinatlı aksonal izler boyunca göç eder. hGC-DRG-oligodendrocyte kültür sisteminde MBP için kırmızı lekeli miyelinli aksonal izler boyunca göç yeşil floresan protein (GFP) ifade hGCs. Ölçek çubuğu: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HGC'ler için göç çalışmaları Boyden oda sistemleri veya çizik tahlilleri kullanılarak yapılabilir. Ancak, bu deneyler diğer çevre dokuları ile tümör hücrelerinin etkileşimleri ile ilgili herhangi bir bilgi vermek için başarısız olsa da, mevcut sistem miyelinatlı ve non-miyelinated lifleri ile GC etkileşimleri özetleyebilir. Ayrıca, tümör oluşumu ve son nokta göç çalışma, kemirgen beyin veya kemirgen beyin veya kanadı içine glioma hücrelerinin in vivo implantasyon organotipik dilim kültürleri daha önce kullanılmıştır23,24,25. Glioma hücrelerinin üç boyutlu modelleme üzerinde daha yeni çabalar kollajen katmanları26gibi sistemleri kullandık26 ,27,28, astrosit tabanlı iskeleler29,30, hücre dışı matris katmanları31, electrospun nanofibers32, ve hidrojeller33. Bu deneyler göçle ilgili tatmin edici bir son nokta sonuçları üretirken, yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile gerçek zamanlı olarak incelenme yeteneğinden yoksundurlar.

Burada, bölmeli bir odada bir DRG co-kültür hazırlayarak hGC'lerin göç çalışma için yeni bir yaklaşım göstermiştir. Taze GBM dokusuna erişim varsa, hGC'ler izole edilebilir ve güvenilir bir şekilde kültürlenebilir. HGC'lerin başlangıçta nörosferleri oluşturması uzun zaman alsa da, küreler oluştuğunda kültürlerin bakımı ve alt kültürleri kolaydır. hGC kültürünün başarısını sağlamak için, doku mümkün olduğunca çabuk işlenmelidir. Rezeksiyon ve işleme arasındaki süre mümkün olduğunca en aza indirilmeli ve numuneler her zaman buz üzerinde taşınmalıdır.

DRG de izole etmek kolaydır, kortikal nöronlar daha uzun aksonları genişletir ve kolayca oligodendrocytes ile kültürde miyelinated olabilir. hGC nörosferler veya ayrıştırılmış hGC'ler odaların distal bölmelerinde eş kültürlüdür, canlı hücre görüntülemeve aksonlar ve miyelinli lifler ile hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı sayısallaştırılması için izin. Ayrıca, kortikal nöronlar da izole edilebilir ve bu protokoliçin birkaç değişiklik ile miyelinated olarak, bu protokol sadece DRG kültürleri ile sınırlı değildir. Bu model aynı zamanda beyin kanserinin diğer formları incelemek için kullanılabilir.

DRG izole etmek ve korumak için nispeten basit olsa da, bölmeli oda nın eklenmesi zaman alıcı ve başarılı olmak için eğitim ve uygulama gerektiren teknik sınırlamalar çok sayıda oluşturur. Bu protokolün başarısı için kritik düzensiz veya aşırı kalın kollajen soyma eğilimindedir çünkü üniforma kollajen kaplama ve kültür yemekleri çizilme olduğunu. Bölmeli bölmeodalarına silikon gres yerleştirirken de aşırı özen gerekir. Silikon gresi dağıtırken bile basınç kullanılmazsa, bölmeli haznenin alt kısmında ortam sızıntısını önlemek için fazla gresle sızdırmazlık gerektiren boşluklar olacaktır. Ayrıca, bölmeli odaları kültür çanağı zeminine yapıştırırken minimum basınç kullanılmalıdır. Aksonlar birinci haftadan sonra orta bölmeden dışarı çıkamazsa ve DRG başka türlü sağlıklı görünüyorsa, bölmeli hazneyi yerleştirirken çok fazla basınç uygulanması veya fazla miktarda gres kullanılması olasıdır.

beyinde miyelinatlı ve miyelinatlı olmayan aksonal yollar boyunca hGC göç iyi verimli ve tekrarlanabilir ex vivo modellerin eksikliği nedeniyle tarif edilmemiştir. Glioma hücrelerinin akson ve miyelin boyunca nasıl göç ettiğini incelemek için yenilikçi bir ex vivo kültür sisteminin gelişimini burada açıklıyoruz, özellikle tümör hücresi göçlerini hedefleyen yeni tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir bileşen. Bölmeler arasında akışkan izolasyon olduğundan kültür sistemimiz çok yönlüdür, bu da çeşitli yeni tedavileri veya glioma hücre göçlerini etkileyen farklı madde konsantrasyonlarını inceleme yeteneğini kolaylaştırır. Ortak kültür sistemimizin bir diğer avantajı da hGC göçünü ve çeşitli tedavilerin etkilerini gerçek zamanlı olarak izleyebilme yeteneğidir. Burada açıklanan protokol şu anda toksikoloji ve yeni ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilecek sadece insan hücresel bileşenleri kullanarak daha sofistike biyomimetik 3 boyutlu ex vivo sistemlerin geliştirilmesi için temel olarak kullanılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, Brown Üniversitesi'nden N.T.'ye nöroşirürji bölümü dahili fonları tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
  3. Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
  4. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  5. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  6. Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
  7. Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
  8. Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
  9. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  10. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  11. Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
  12. Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
  13. Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
  14. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
  15. Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
  16. Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
  17. Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
  18. Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
  19. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  20. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  21. Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
  22. Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
  23. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
  24. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  26. Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
  27. Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
  28. Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
  29. Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
  30. Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  31. Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
  32. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
  33. Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).

Tags

Kanser Araştırma Sayı 154 Glioma kök hücreleri göç ex vivo modeli co-kültür DRG akson miyelin
Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zepecki, J. P., Snyder, K. M.,… More

Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Tapinos, N. Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures. J. Vis. Exp. (154), e59744, doi:10.3791/59744 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter