Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מהירה בעלות נמוכה לוציפרראז בחני בתפוקה בינונית באמצעות העברת אינסולין מקושרת של גאוסיה לוציפראז כפרוקסי עבור הפרשת אינסולין מתאי בטא. ניתן לבצע את האפשרות עם מרבית קוראי הצלחות והפיפטות רב ערוצית.
Abstract
ביצוע נוגדנים מבוססי נוגדן עבור אוסף המופרש לאחר הדגימה לאחר מכן דורש בדרך כלל כמה שעות עד יום של זמן הצורך והוא יכול להיות יקר, בהתאם לצורך הספציפי. לוציפראז מופרש מזרז את התוצאות ולהקטין את עלות הכדאיות לכל מדגם באופן משמעותי. כאן אנו מציגים גישה בשימוש מועט יחסית כדי לאמוד פעילות הפרשה אינסולין מתאי β הלבלב באמצעות Gaussia לוציפראז מוכנס גנטית בתוך C-פפטיד. במהלך העיבוד האנטי-נגד-חרדה של הפרואינסולין, הג-פפטיד משחרר את הלוציפראז בתוך הפרשת האינסולין ושלפוחית האנרגיה שבה הוא מופרש עם אינסולין. תוצאות ניתן לקבל בתוך דקות לאחר איסוף המדגם בגלל המהירות של לוציפראאז assays. הגבלה של התשובה היא שזהו מדידה יחסית של הפרשת אינסולין ולא כימות מוחלטת. עם זאת, פרוטוקול זה הוא חסכוני, מדרגי, וניתן לבצע באמצעות מרבית קוראי לוחיות האור הרגילות. פיפטות אנלוגי ודיגיטלי רב ערוצי להקל על מספר שלבים של השיטת. ניתן לבדוק במקביל וריאציות נסיוניות רבות. לאחר מערכת ממוקדת של תנאים הם החליטו על, ריכוזי אינסולין צריך להיות נמדד ישירות באמצעות נוגדן מבוסס בחני עם עקומות סטנדרטיות כדי לאשר את תוצאות שיטת ללוציפראז.
Introduction
השיטה המוצגת כאן מאפשרת הפרשת אינסולין מקו בטא שונה גנטית להיות מוכן במהירות ובאופן בלתי נשכח בפורמט 96-היטב-צלחת. המפתח לפרוטוקול זה הוא גרסה משתנה של אינסולין עם הגאוסיה המופרש באופן טבעי (gluc, ~ 18 kda) הוכנס ( ראה איור 1) לתוך ה-C פפטיד כדי ליצור אינסולין-גאוסייה (insgluc)1,2. חלבונים גדולים אחרים, כגון gfp (~ 25 kda), הוכנסו בהצלחה לתוך C-פפטיד של אינסולין והציגו את העיבוד לאחר הניתוח הצפוי מתוך proinsulin-gfp לאינסולין ו gfp-C-פפטיד3,4. עבור הצורך בפרוטוקול זה, gluc כבר ממוטב codon עבור ביטוי היונקים ושני מוטציות הוצגו כדי לשפר זוהר כמו הקינטיקה5,6. ניתן לבדוק בקלות צירופים מרובים ושכפול של תנאי טיפול בתבנית 96-היטב, וניתן לקבל את תוצאות ההפרשה מיד לאחר הניסוי.
יתרון מרכזי, כפי שצוין בעבר2, הוא העלות הנמוכה של מדידה זו הפרשה מבוסס לluciferase (< $0.01/טוב) אשר מבדיל אותו מן העלויות הגבוהות יחסית והיבטים טכניים של חיסוני מקושרים אנזים בחני (אליאס) ( > $2/ובכן) ו-פלואורסצנטית הומוגנית בזמן (HTRF) או אחרים Förster העברת אנרגיה (מבוסס) נוגדן (> $1/ובכן) assays. בהשוואה לאלה המבוססים על נוגדנים, אשר למדוד את הריכוז של האינסולין על ידי התייחסות עיקול סטנדרטי, שיטת InsGLuc מודד פעילות הפרשה כהשוואה יחסית לשלוט בארות על הצלחת. מסיבה זו, כל ניסוי דורש הכללה של שליטה נאותה. הבחנה זו היא עסקת חליפין כדי לאפשר מדידות מהירות וזולה. עם זאת, הפרשת insgluc הוכח להיות מתואם מאוד עם הפרשת אינסולין כפי שנמדד על ידי אליסה1,2. טכנולוגיה זו הפכה להיות מדורגים עבור הקרנת תפוקה גבוהה1,2,7 והובילה לזיהוי של מודולים הרומן של הפרשת אינסולין כולל מעכבי מגודרת מתח תעלת אשלגן7 כמו גם מעכב מוצר טבעי של β cell פונקציה, Chromomycin a28. השימוש ב-InsGLuc הוא המתאים ביותר עבור חוקרים המתכננים לבחון ללא הרף תנאי טיפול שונים להשפעה שלהם על הפרשת אינסולין. בניסויים מעקב יש צורך לחזור על ממצאים מרכזיים בתוך קו β הורים, ובצורה אופטימלית באיים מוריים או בני אדם, ולמדוד הפרשת אינסולין באמצעות שיטת נוגדן מבוססת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים, מדיה ומאגרים (שולחן 1)
- הכנת MIN6 מדיה מלאה ב 500 mL של גלוקוז גבוה (4.5 g/L) בינונית שונה של הנשר של Dulbecco (Dמאמ) עם התוספים הבאים: 15% סרום של העובר (FBS), 100 יחידות/מml 100, מסטרפטומיצין μg/mL, 292 μg/מ"ל L-גלוטמין, ו 50 μM . β-מרקפטואתנול
הערה: קו התאים היציבים במקרה זה מתוחזק ב250 μg/mL של אנטיביוטיקה G418. - הכינו את ביקרבונט מאגר Krebs-צלצול (KRBH) על-ידי ביצוע פתרון המכיל 5 מ"מ KCl, 120 מ"מ הייגל, 15 מ"מ HEPES (pH 7.4), 24 mM נחקו3, 1 מ"מ MgCl2, 2 מ"מ cacl2, ו 1 מ"ג/mL-מבצע רדיוחיסוני כיתה בכיתה סרום אלבומין. גלוקוז יש להוסיף היכן שצוין מ 2 מניות M.
הערה: KRBH משמש לדגירה את התאים עם וללא גירוי כדי להעריך אינסולין ו/או הפרשה של גאוסייה לוציפראז. - הכינו את התמיסה של קומרכאזין (CTZ) כדלקמן. הכן acidified מתנול על-ידי הוספת 106 μL של HCl מרוכזת ל-10 mL של מתנול. לאחר מכן, התמוססות CTZ ב-acidified מתנול ב 1 מ"ג/mL ולאחסן ב-80 ° c ב-בורג צינורות כובע.
הערה: מניות אלה לשמור על פעילות מספקת לוציפראז שגרתי, גם לאחר 1 שנה של אחסון נאות. - הכינו את גאוסיה לוציפראז (GLuc) מאגר הנתונים המבוסס על ספרות9 , כמו גם פטנט מידע10 כדי לסייע במחצית החיים של שיטת Gauferase של גאוסייה ב 96 בפורמט צלחת לוחית. השתמש בנוסחה: 25 מ"מ מסנן טריס pH 8, 1 מ"מ EDTA, 5% גליצרול, 1 מ"ג/mL Na2פו4, 300 מ ל נתרן Ascorbate, 200 mm na2כל כך3 במים. הקפאת מניות ב-20 ° c. לאחר הפשרה, לאחסן את המאגר ב 4 ° c.
- כדי להכין את הפתרון העבודה של Gauferase, להוסיף 4.2 μL/mL של 1 מ"ג/mL (2.36 מ"מ) מניות CTZ פתרון מאגר שיטת GLuc. זה התוצאות בפתרון עבודה 2x של 10 μM CTZ אשר יהיה הריכוז הסופי של 5 μM בבחינה.
2. תרבות של InsGLuc MIN6 תאים וזריעה לפרשת הפרשה
- לתרבות MIN6 תאים, טריזיסיזציה וזרע התאים פעם בשבוע באמצעות טכניקות רגילות של תרבות התא. שינוי מדיה בתאים כל 2-3 ימים. כלול אנטיביוטי בחירה מתאים, כגון 250 μg/mL של G418 במדיה.
- כדי לספק מספר מספיק של תאים שבועי לניסויים, לשמור על התאים ב T75 צלוחיות. זריעת 6 x 106 תאים לכל T75 ב 10 מ ל של המדיה תניב בדרך כלל 30 x 106 כדי 40 x 106 תאים סך לכל T75 לאחר 7 ימים של תרבות.
- כדי להכין תאים לציפוי לתוך 96-טוב צלחות, לשטוף confluent T75 של InsGLuc MIN6 תאים פעמיים עם PBS ולהוסיף 2 מ ל טריפסין. מודקון ב 37 ° צ' עבור ~ 5 דקות או עד התאים הנתק מן הבקבוקון. קבע את ריכוז התא למילי-ליטר.
- לדלל את התאים במדיה המלאה 1 x 106 תאים/mL כדי לגרום 1 x 105 תאים ב 100 μl לכל טוב ב-96-באר צלחת. התאים צריכים להיות מאוד מספקת לצורך שיטת החיבור לאחר 3 – 4 ימים.
הערה: כדי להאריך את תקופת התרבות, ניתן לציפוי מחצית מריכוז התא. שינויי מדיה אינם נדרשים לפני יום הטיפול, אלא אם כן התאים חשופים לטיפולים ניסיוניים.
- לדלל את התאים במדיה המלאה 1 x 106 תאים/mL כדי לגרום 1 x 105 תאים ב 100 μl לכל טוב ב-96-באר צלחת. התאים צריכים להיות מאוד מספקת לצורך שיטת החיבור לאחר 3 – 4 ימים.
3. גלוקוז-גירוי הפרשת גאוסיה לוציפראז
- ביום המנה מכינים מספיק KRBH לניסוי (שלב 1.2). מינימום של 50 mL של KRBH per 96-ובכן הצלחת נדרש, ולכן להכין לפחות 75 mL כדי להבטיח מספיק מאגר עבור הניסוי. הכינו מאגר נוסף, אם צירופים שונים של תנאי טיפול בסמים ידרשו KRBH לדילול.
- הכינו מאגר מים ללא גלוקוז. Decant המדיום מ 96-ובכן צלחת (s) על ידי היפוך במהירות את הצלחת מעל כיור מעבדה ולאחר מכן למחוק בחוזקה על ערימת מגבות נייר כדי להסיר עודף בינוני.
- באמצעות צינורות אלקטרוניים או ידני של 8 ערוצים, פיפטה 100 μL/ובכן KRBH מן המאגר על פני הצלחת 96-באר (s). חזור על הסכום הכולל של שתי שטיפות.
- (צעד אופציונלי של טיפולים בתרכובת חריפה) אם לא ביצוע טיפולים בסמים, המשך בשלבים 3.5 ו-3.6 ללא שינוי. כדי לבחון את ההשפעות של מולקולות קטנות על הפרשת אינסולין, ניתן להוסיף תרכובות לתאים במהלך תקופת הדגירה המוקדמת, תקופת הגירוי, או שניהם.
- טכניקה אחת היא להוסיף תרכובות אצווה כדי KRBH ב 1.5 mL ולהשתמש בצינורות הניתנים להתאמה דיגיטלית 8 ערוצים כדי להעביר את התרופה-KRBH מן הצינורות לתאים ב 96-באר צלחות.
הערה: אם הצינור הניתן לכוונון אינו זמין, עותק משוכפל 96-ובכן צלחת של סמים-KRBH ניתן לעשות ומתקן שמונה ערוצים סטנדרטי ניתן להשתמש כדי להעביר את המאגר. שינויים נוספים בפרדיגמת הטיפול ניתן לטפל בתאים במשך 24 שעות במדיה לפני התיתינה, כפי שמתואר בעבר1,8.
- טכניקה אחת היא להוסיף תרכובות אצווה כדי KRBH ב 1.5 mL ולהשתמש בצינורות הניתנים להתאמה דיגיטלית 8 ערוצים כדי להעביר את התרופה-KRBH מן הצינורות לתאים ב 96-באר צלחות.
- הוסף 100 μL של KRBH המכיל את הריכוז הרצוי של גלוקוז או תרכובות ומניחים את המנה בחממה 37 ° c עבור 1 h.
הערה: בהתאם לפריסה הניסיונית, היא מועילה מאוד לקבל מעבר של צינור רב ערוצי אלקטרוני המאפשר מעבר מיגדרי של הערוץ מטור של שמונה 1.5-mL לשמונה שורות של צלחת 96-באר. - לאחר השעה 1 של הדגירה המוקדמת, לחזק את המאגר לתוך הכיור ולמחוק בחוזקה על מגבת נייר. הוסף 100 μL של גלוקוז חינם KRBH לכל טוב לשטוף את הרקע שנצבר של הלופראז גאוסייה. Decant הצלחת שוב ולהוסיף שליטה ומגירוי תנאים לצלחת ב 100 μL לכל טוב. מניחים את הצלחת באינקובטור 37 ° c עבור 1 h.
- לאסוף בקפידה 50 μL של supernatant באמצעות מצפטה רב-ערוצי, שינוי טיפים בין תנאי טיפול לפי הצורך, ולהעביר את supernatant לנקות אטום לבן אטומה ל96 בנת היטב.
הערה: לוחיות השפל של הקירות הלבנים ברורים ניתן להשתמש אם יש צורך, למרות כמות משמעותית של אות לוציפראז יאבדו. - לאחר איסוף של 50 μL של KRBH supernatant, המדגם יכול להיות מיידי. במקרה הצורך, לחתום ולאחסן דגימות ב -4 ° c לכמה ימים (פעילות gluc מחצית חיים ~ 6 ימים) או-20 ° c עד חודש אחד11,12.
4. הסדר הלוציסייה המופרש
- כדי להכין את הפתרון העובד העבודה GLuc, פיפטה את הכמות הנדרשת של פתרון מלאי CTZ (4.2 μL/mL) לתוך מאגר שיטת GLuc. כדי למנוע התחממות CTZ, הצינורות במהירות ב-80 ° c מקפיא או לשמור את הצינור על קרח יבש.
- באמצעות הצנרת האלקטרונית רב-ערוצי, להוסיף במהירות 50 μL של הפתרון העבודה GLuc לעבוד גם על פני הצלחת 96-באר המכילה את KRBH supernatants שנאספו. אם יש טיפות על הצדדים של בארות כלשהן, לקצר לסובב את הצלחת בצנטריפוגה הנדנדה השולחן הראש התנופה.
- קרא את האור בקורא צלחת מתאים בתוך כמה דקות ולקרוא כל טוב עם זמן אינטגרציה 0.1 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי למדוד את הביצועים של הקבוע תחת תנאי בקרה, מינון פשוט של התגובה הגלוקוז במינון או גירוי באמצעות הפרדיגמה diazoxide ניתן להשלים. במקרה של לשעבר, מראש לקדם את התאים עבור 1 h בתנאים ללא גלוקוז ואחריו טיפול עבור 1 h עם ריכוזי גלוקוז הגוברת צריך לגרום לפעילות הפרשה מעט מאוד ב-5 מ"מ, בעוד הפרשה מוגברת נצפתה מעל 8 מ"מ גלוקוז (איור 2). גירוי עם 35 mM KCl גם משמש כשליטה חיובית על הפרשה מגורה. הכללת הפרשה-תרופות מאופפות במהלך תקופת הגירוי צריכה לתת את העיכוב הצפוי או הפוטנציאל של פעילות GLuc מופרש (איור 3). לדוגמה, diazoxide מאגד את ערוץ KATP ומונע ממנו להיסגר ביחס מוגבר של [ATP/ADP], חסימת ממברנה דפולריזציה ומניעת הפרשה13. פורבול אסטרים כגון פרה-מתיונין (PMA) הפעל חלבון קינאז C (PKC) והם ידועים מגברים של הפרשת אינסולין14. לבסוף, גירוי עם 1 μM אדרנלין מפעיל α2A-אדרררגיות קולטנים אשר בתורו להפעיל את heterotrimeric G-חלבון מורכב Gi, מעכב depolarization קרום הפרשה אינסולין15. חשוב להכיר כי בעוד תאים MIN6 הם קו התאים בן אלמוות, הם מתחילים לאבד גלוקוז המושרה הפרשות אינסולין תגובות (כגון שמאל הסטה של עקומת התגובה) לאחר מורחב passaging16. מסיבה זו, זה אימון טוב באופן שגרתי תרבות כל MIN6 קווי התאים של עד שמונה שבועות (פיצול פעם בשבוע) לפני תחילת מניות חנקן נוזלי.
איור 1: תיאור של כתב האינסגק. (א) הראשון, קו תא β יציב (במקרה זה MIN6 תאים) נוצר להביע את הביטוי אינסולין-gaussia הגנטי של מקדם אינסולין החולדה. (ב) החלבון המלא מסונתז ונארז בגרגרי אינסולין יחד עם אינסולין אנדוגני. הורמון protases קליב את פפטיד, המצוין על ידי כוכביות. (ג) האינסולין המעובד והגאוסיה מופרשים והפעילות הלוציפרראז מזוהה על-ידי תוספת של ctz בתגובה של ATP עצמאית ותלוית חמצן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: העיתונאי InsGLuc הוא פרוקסי נאמן של הפרשת אינסולין מתאי בטא MIN6. (א) תגובה של תאים MIN6 InsGLuc להגדלת ריכוזי הגלוקוז ו kcl (35 מ"מ) עם הפרשה של גאוסיה לוציפרז. נתונים הם פעילות לוציפראז מקפלים הממוצע ± SE בהשוואה לתנאי גלוקוז 0 mM עבור שלושה ניסויים עצמאיים. *, P < 0.05. הדמות השתנתה עם הרשאה מקאלואט ואח ' מחיישנים 20161. © 2016 האגודה האמריקנית לכימיה. (ב) הכתב InsGLuc בתאי MIN6 מציג את תגובת הסוד הצפויה Diazoxide (דז) הפרדיגמה שבה 250 μm הטיפול מחזיק את הערוץ KATP פתוח, חסימת depolarization קרום אלא אם כן החילוץ Kcl (35 mM) מסופק כדי לגרום לזרם הסידן המפעיל. נוסף תוספת של גלוקוז (20 מ"מ) תחת Dz + KCl המצב חושף את הגברה המטבולית של הפרשה המתרחשת ללא עליות נוספות של הסידן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הכללת הפרשה-תרכובות מודולים במהלך הגלוקוז-מעוררת הפרשת InsGLuc. InsGLuc MIN6 תאים מצופה ב-96-ובכן פורמט כפי שמתואר היו preמודב גלוקוז חינם KRBH עבור 1 h. תאים טופלו אז עם או בלי סוכר 20 מ"מ בנוכחות diמתיל סולפוקסיד (DMSO) (0.1%), KCl (35 mM), diazoxide (250 μM), PMA (100 nM), או אדרנלין (1 μM) עבור 1 h. גרף עמודות מייצג את הממוצע ± SE של לפחות 3 ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| קרבס-רינגר ביקרבונט מאגר (KRBH) | |||
| פתרון מניות או אבקה | לאי | ריכוז סופי | 100 מ ל |
| אשלגן כלורי | 0.25 מ ' | 5 ממ ' | 2 מ ל |
| מיכל שלמה | 4 מ ' | 120 ממ ' | 3 מ ל |
| הפסי, pH 7.4 | 1 מדיום | 15 ממ ' | 1.5 מ ל |
| נחקו3 | 0.5 מ ' | 24 ממ ' | 4.8 מ ל |
| מיכלהשני | 1 מדיום | 1 ממ ' | 0.1 מ ל |
| מיכל2 | 1 מדיום | 2 ממ ' | 0.2 מ ל |
| מים | H2O | 88.4 מ ל | |
| ריה-דרגה BSA | אבקת | 1 מ"ג/mL | 100 מ ג |
| . הפוך לטרי ביום הניסוי | |||
| מאגר השיטת הגאוסיה * | |||
| פתרון מניות או אבקה | לאי | ריכוז סופי | 50 מ ל |
| דינתרן פוספט | אבקת | 0.1% (1 מ"ג/mL) | 50 מ ג |
| גליצרול | 40% | 5% | 6.25 מ ל |
| נתרן ברומיד | אבקת | 150 ממ ' | 772 מ ג |
| EDTA pH 8 | 0.5 m | 1 ממ ' | 100 מיקרומטר |
| טריס-HCl pH 8 | 1M | 25 ממ ' | 1.25 מ ל |
| חומצה אסקורבית | אבקת | 300 ממ ' | 2.64 גרם |
| Na2SO3** | אבקת | 200 ממ ' | 1.26 גרם |
| מים | עד 50mL | ||
| חנות בתוך-20 ° c, להפשיר אחד בכל פעם ולשמור ב 4 ° c. | |||
| * מתכון משתנה מ Luft ואח '. BMC ביוכימיה 2014, 15:14. | |||
| Acidified מייהו | |||
| פתרון מניות או אבקה | לאי | ריכוז סופי | 10 מ ל |
| מתנול | 100% | 10 מ ל | |
| HCl | 11.65 מ ' | 1.06% | 0.106 מ ל |
| תמיסת קומרכאזין | |||
| פתרון מניות או אבקה | לאי | ריכוז סופי | 1 מ ל |
| קומרכאזין | אבקת | 1 מ"ג/mL (2.36 mM) | 1 מ ג |
| Acidified מתנול | 1 מ ל | ||
| 4.2 μL של מלאי ל 1 מ ל של התוצאות של מאגר שיטת Gaussia בשנת 10 μM CTZ כדי לשמש כפתרון עבודה של 2x. | |||
| לדוגמה, הוסף 50 μL של פתרון עבודה של 2x ל 50 μL של מדגם KRBH המכיל את גאוסיה המופרש. | |||
טבלה 1: מתכוני מאגר ופתרונות מניות המשמשים לביצוע הצגת הספר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה להעריך במהירות גלוקוז מגורה הפרשות אינסולין תגובות מתאי MIN6 β. לקבלת התגובות הטובות ביותר בסדר זה חשוב לזרוע את התאים MIN6 בצפיפות הנכונה ולאפשר להם להפוך 85-95% confluent. זה משפר את התגובות β cell לגלוקוז בגלל שיפור תא הקשר וסינכרון התאים, אשר מתרחשת הן באיים הראשיים17,18,19,20,21 , כמו גם MIN6 תאים16,18. כדי למנוע הפסדים תגובת הפרשה לגירוי גלוקוז, חשוב לשמור על התאים במצב נמוך ככל האפשר ואת התרבות התאים רק 6-8 שבועות לפני הפשרה בקבוקון חדש ממניות חנקן נוזלי. ניתן לערוך שינויים באסטרטגיית הציפוי בפרוטוקול סעיף 2 כדי להסתגל לציוד הזמין לפי הצורך. ציפוי מMIN6 תאים לתוך 96-טוב צלחות לפרשת הפרשה מעניקה מספר רב של בארות למניפולציות נסיוניות (כולל משכפל), כמו גם שמירה על דיוק של ציפוי בהגדרת מעבדה נורמלית, כציפוי לתוך מנות עם היטב גבוהה יותר מספרים לעתים קרובות דורש ציוד מיוחד זמין בדרך כלל ליבות סינון תפוקה גבוהה.
מספר הפרשות הנוכחי עבור הפרשת אינסולין, מלבד האפשרות לוציפראז עקיף המתואר כאן, כוללים: אליאס המשתמשים בקריאות הצביעה (שיטה ישירה), מאמר רדיוחיסוני (שיטת התחרות) אשר משתמשים בקריאות רדיואקטיביות, נוגדן מבוסס-סריג התחרות שיטת22 ו-HTRF23 המשתמשת בסריג בין נוגדנים מקושרים צבען כדי למדוד אינסולין ישירות, ו-DNA aptamers24. לכל אחת מהשיטות הללו יש יתרונות משלה, אך באופן כללי הם יקרים יותר ו/או לגזול זמן מאשר מעשה לוציפראז. הגבלת מפתח אחת של השיטת InsGLuc היא העובדה כי הפעילות הזורח של לוציפראז מופרש הוא רק פרוקסי עבור הפרשה אינסולין ממשית. בנוסף, אין הבדל צפוי בפעילות לוציפראז בין גאוסייה עם שברים של C-פפטיד על N-ו-C-termini או גאוסיה בתוך חלבון פרואינסולין, כמו gauferase בהצלחה בשימוש כתגית כדי למדוד את הפרשה של חלבונים אחרים25. זה מדגיש את הדרישה של לימודי אישור באמצעות בחני אומר כי מדידה מעובד אינסולין באופן ספציפי. חלופות למדידות ישירות ועקיפות של הפרשת אינסולין יכולה לשמש גם להערכת β cell. מגוון של כתבים אופטיים קיימים עבור מספר הקריאות כולל ATP: יחס ADP, הזרמת סידן, היחס NAD+/Nadh, הפעלת האות מוסדרות (טיפשה) הפעלה, או אדנוזין מחזורי monophosphate (מחנה) רמות26.
היישומים העתידיים של InsGLuc בפרט מופיעים בהקרנה בתפוקה גבוהה. שיטת שימוש זו כבר שימש בקומץ מסכים קטנים שפורסמו1,2 ומסכי גדולות שלא פורסמו הושלמו7 או בעיצומן. פיתוח של חזרות אחרות של טכנולוגיה זו עשוי לכלול תיוג של הורמונים איון אחרים המופרשים עם לוציטיות כדי להקל על מדידות מהירות, כגון עבור גלוקגון או סומטוסטטין. ניתן לעשות שינויים בכל מקרה שבו הקו הנייד נוצר מחדש באמצעות גישות חלופיות כולל CRISPR/Cas9, הוספת וירוס, או טרנספסדאז-תיווך ההכנסה בכל קו מתאים בטא תא. שינויים אפשריים נוספים בכתב המקורי עשויים לכלול החלפת לוציטיות חלופיים עבור גאוסיה או שילוב של מספר לוציטיות שונות המקושר להורמונים שונים לצורך שיטת מפרש מרובב. מעבר לתרבות התא, CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מציג את האפשרות של יצירת מודל העכבר שבו הלוציפראז מתאים הפיל את אזור הקידוד C-פפטיד של Ins2 בגנום. עכבר כזה יהיה אפשרי בהינתן כי עכברים טרנסגניים נוצרו עם gfp הכניס לתוך האתר C-פפטיד אותו27 ויאפשר מדידה של פונקציה β תאים אנדוגניים עם שיטת ללוציפראז ב vivo או לשעבר vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים לכל החברים הנוכחיים והקודמים במעבדת קוב לעבודה ולדיונים יקרי ערך, ולדיון וואר לסיוע מינהלי. מיכאל קאלוואט נתמך על ידי קרן המחקר לסוכרת קטינים סרה-2019-702-Q-R. עבודה זו נעשתה אפשרית דרך NIH R37 DK34128 ו וולש קרן גרנט I1243 למלאני קוב. חלקים מוקדמים של עבודה זו היו נתמכים גם על ידי NIH F32 DK100113 למייקל קאלוואט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| rIns-GLuc stable MIN6 cells | Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418 | ||
| DMEM | Sigma | D6429 | 4.5 g/L glucose media |
| fetal bovine serum, heat-inactivated | Sigma | F4135 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher Scientific | SV30010 | |
| beta-mercaptoethanol | Thermo-Fisher Scientific | BP 176-100 | |
| glutamine | Thermo-Fisher Scientific | BP379-100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-500 | |
| G418 | Gold Biotechnology | G418-10 | Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C. |
| T75 tissue culture flasks | Fisher Scientific | 07-202-000 | |
| 96 well tissue culture plates | Celltreat | 229196 | |
| Reagent reservoirs (50 mL) | Corning | 4870 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secretion assay reagents | |||
| BSA (RIA grade) | Thermo-Fisher Scientific | 50-146-952 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| KCl | Thermo-Fisher Scientific | P217-500 | |
| NaCl | Thermo-Fisher Scientific | S271-3 | |
| Hepes, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 50-213-365 | |
| NaHCO3 | Thermo-Fisher Scientific | 15568414 | |
| MgCl2 | Thermo-Fisher Scientific | M9272-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional drugs for stimulation experiments | |||
| Diazoxide | Sigma | D9035 | Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added. |
| epinephrine (bitartrate salt) | Sigma | E4375 | Stock solution: 5 mM in water |
| PMA (phorbol 12-myristate) | Sigma | P1585 | Stock solution: 100 µM in DMSO |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guassia assay materials | |||
| Disodium phosphate (Na2HPO4) | Thermo-Fisher Scientific | S374-500 | |
| Glycerol | Thermo-Fisher Scientific | G334 | |
| Sodium Bromide | Thermo-Fisher Scientific | AC44680-1000 | |
| EDTA | Thermo-Fisher Scientific | AC44608-5000 | Stock solution: 0.5 M pH 8 |
| Tris base | RPI | T60040-1000.0 | Stock solution: 1 M pH 8 |
| Ascorbic Acid | Fisher Scientific | AAA1775922 | US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability. |
| Na2SO3 | Sigma | S0505-250G | US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA |
| Coelenterazine (native) | Nanolight / Prolume | 3035MG | Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM) |
| OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 6005290 | Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent | BioTek | 8041000 | A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required. |
| 8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 µL) | Integra | 4724 | An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format |
| 8-channel 200 µL pipette | Transferpette S 20-200 µL | 2703710 |
References
- Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
- Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
- Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
- Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
- Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
- Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
- Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. , WO2018175324A1 (2018).
- Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).
- Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
- Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
- Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
- Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
- Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
- Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).
- Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
- Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
- Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
- Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
- Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
- Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).
- Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
- Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
