Surveillance des interactions GPCR-MD-arrestin1/2 dans les systèmes de vie en temps réel pour accélérer la découverte de médicaments

Résumé

Les interactions GPCR-MD-arrestin sont un domaine émergent dans la découverte de médicaments par gpCR. Des méthodes précises, précises et faciles à mettre en place sont nécessaires pour surveiller de telles interactions dans les systèmes vivants. Nous montrons un test de complémentarité structurelle pour surveiller les interactions GPCR-MD-arrestin dans les cellules vivantes en temps réel, et il peut être étendu à n'importe quel GPCR.

Résumé

Les interactions entre les récepteurs couplés à la protéine G (GpCR) et les arrestins sont des processus vitaux ayant des implications physiologiques de grande importance. À l'heure actuelle, la caractérisation de nouveaux médicaments en vue de leurs interactions avec les arrestins et autres protéines cytosoliques est extrêmement précieuse dans le domaine de la découverte de médicaments par GPCR, en particulier lors de l'étude de l'agonisme biaisé du GPCR. Ici, nous montrons l'application d'un nouveau test de complémentarité structurelle pour surveiller avec précision les interactions récepteur-arrestin dans les systèmes vivants en temps réel. Cette méthode est simple, précise et peut être facilement étendue à n'importe quel GPCR d'intérêt et a également l'avantage qu'elle surmonte les interactions non spécifiques en raison de la présence d'un promoteur de faible expression présent dans chaque système vectoriel. Cet analyse de complémentarité structurelle fournit des caractéristiques clés qui permettent une surveillance précise et précise des interactions récepteur-arrestin, ce qui le rend approprié dans l'étude de l'agonisme biaisé de tout système GPCR ainsi que GPCR c-terminus 'phosphorylation codes écrits par différents GPCR-kinases (GRKs) et des modifications post-traductionnelle des arrestins qui stabilisent ou déstabilisent le complexe récepteur---arrestin.

Introduction

Les GPCR représentent la cible de près de 35 % des médicaments actuels sur le marché^1,2 et une compréhension claire de leur pharmacologie est cruciale dans le développement de nouveaux médicaments thérapeutiques³. L'un des aspects clés de la découverte de médicaments par le GPCR, en particulier pendant le développement d'agonistes biaisés, est la caractérisation de nouveaux ligands vers les interactions récepteur-arrestin⁴ et les interactions de l'arrestine avec d'autres protéines cytosoliques telles que comme clathrine⁵.

Protocole

1. Stratégie de conception d'apprêt

1. Concevoir des amorces pour introduire des gènes d'intérêt dans pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectors.
2. Sélectionnez au moins l'un de ces trois sites comme l'une des deux enzymes de restriction uniques nécessaires au clonage directionnel en raison de la présence d'un codon d'arrêt dans le cadre qui divise le site multicloing comme le montre la figure 1¹¹.
3. Incorporez la séquence de nucléotide dans les amorces, comme le montre le tableau 1, pour coder les résidus de liaison indiq....

Résultats

Utilisant la procédure présentée ici, les interactions entre un GPCR prototypique et deux isoformes de '-arrestin ont été surveillées. Des constructions de récepteurs de peptides (GLP-1r) ont été faites à l'aide d'amorces contenant des sites de restriction d'enzymes NheI et EcoRI et clonées dans les vecteurs pBiT1.1-C [TK/LgBiT] et pBiT2.1-C [TK/SmBiT] alors que dans le cas de l'arrêt ins, deux vecteurs supplémentaires ont été pBiT1.1-N [TK/LgBiT] et pBiT2.1-N [TK/SmBiT] utilisant les sites de restriction enzymatiques Bg.......

Discussion

En utilisant la méthode présentée ici, les interactions entre n'importe quel GPCR et '-arrestin1'2 peuvent être surveillées dans des systèmes de vie en temps réel en utilisant cet analyse de complémentation structurale GPCR---arrestin. À cet égard, nous avons pu observer un recrutement différentiel entre les deux isoformes de l'arrêt-arrêt par le GLP-1r (UN GPCR prototypique de classe B), nous avons également observé une dissociation du complexe récepteur--arrestin quelques minutes après avoir atteint le maximum signal l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Antibiotiques pénicilline streptomycine	Welgene	LS202-02	Pénicilline/Streptomycine
Incubateur bactérien	JEIO Tech	IB-05G	(Air-Jacket),
Base Milieu de culture cellulaire	Welgene	LM 001-05	DMEM Milieu de culture cellulaire
Milieu de transfection de culture cellulaire	Gibco	31985-070	Milieu
Incubateur CO2		NUAIRE NU5720	Incubateur CO2 à chaleur directe
Bain d’eau numérique	Lab Tech	LWB-122D	Bain d’eau numérique tech de laboratoire
ADN Lecture d’épreuve de polymérase	ELPIS Biotech	EBT-1011	polymérase
	Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Kit de purification Mini
ADN Taq Polymérase	Enzynomics	P750	nTaq ADN polymérase
Restriction enzymatique BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Tampon de restriction enzymatique	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X
Restriction enzymatique EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Restriction enzymatique NheI	New England Biolabs	R01315	NheI
Restriction enzymatique XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Sérum de veau fœtal	Gibco Canada	12483020	Gel de sérum de bovin fœtal
/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase ELPIS	Biotech	EBT-1025	T4 DNA Ligase
Microscope optique	Olympus	CKX53SF	CKX53 Microscope Olympus
réactif de transfection lipidique	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminomètre	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Lecteurs de microplaques multimodes
Système NanoBiT	Promega	N2014	NanoBiT PPI MCS Système de démarrage
Substrat nanoluciférase Promega		N2012	Nano-Glo Système de dosage de cellules vivantes
PCR Thermocycleur	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Solution de poly-L-lysine
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Trysin EDTA 10X
Culture de globules blancs 96 plaques de puits	Corning	3917	Plaque de dosage 96 plaques de puits

de culture cellulaire Optimem 1X PfU Kit de purification d’ADN