Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisering av membran transportører av Heterologous uttrykk i E. coli og produksjon av membran blemmer

Published: December 31, 2019 doi: 10.3791/60009
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

Summary

Vi beskriver en metode for karakterisering av Proton-drevet membran transportører i membran vesicle preparater produsert av heterologous uttrykk i E. coli og lyse av celler ved hjelp av en fransk trykk.

Abstract

Flere metoder har blitt utviklet for å funksjonelt karakterisere romanen membran transportører. Polyaminer er allestedsnærværende i alle organismer, men polyamin vekslere i planter har ikke blitt identifisert. Her skisserer vi en metode for å karakterisere polyamin antiporters ved hjelp av membran blemmer generert fra lyse av Escherichia coli celler heterologously uttrykker en plante antiporter. Først, vi heterologously uttrykt AtBAT1 i en E. coli stamme mangelfull i polyamin og arginin utveksling transportører. Blemmer ble produsert ved hjelp av en fransk trykk, renset ved ultracentrifugation og benyttes i en membran filtrering analysen av merket underlag for å demonstrere underlaget spesifisitet av transportøren. Disse analysene viste at AtBAT1 er et proton-mediert transportør av arginine, γ-aminobutyric acid (GABA), putresin og spermidin. Den muterte belastningen som ble utviklet for analysen av AtBAT1 kan være nyttig for funksjonell analyse av andre familier av planter og dyr polyamin vekslere. Vi hypothesize også at denne tilnærmingen kan brukes til å karakterisere mange andre typer antiporters, så lenge disse proteinene kan uttrykkes i bakterie cellemembranen. E. coli er et godt system for karakterisering av romanen transportører, siden det er flere metoder som kan anvendes for å mutagenize innfødte transportører.

Introduction

Proteiner som er involvert i smugling av metabolitter utgjør et viktig nivå av fysiologisk regulering, men det store flertallet av plante membran transportører har ennå ikke vært funksjonelt karakterisert. Flere strategier har blitt iverksatt for å karakterisere romanen transport proteiner. Heterologous uttrykk i modell organismer som E. coli og eukaryote celler som gjær, Xenopus oocytter, pattedyrceller, insekt celler og planteceller har alle blitt brukt til å bestemme deres transport aktivitet1. Eukaryote celler er foretrukket for uttrykk for eukaryote proteiner, fordi den grunnleggende cellulære sammensetning, signal transducing trasé, transkripsjon og oversettelse machineries er kompatible med de innfødte forhold.

Gjær har vært en viktig modell organisme for karakterisering av romanen transport proteiner i planter. Den første planten transport protein som var vellykket uttrykt i gjær (Saccharomyces pombe) var HEXOSE transporter HUP1 fra chlorella2. Siden da har mange plante transport proteiner vært funksjonelt karakterisert ved hjelp av en gjær uttrykks system. Disse inkluderer, plante sukker transportører (SUC1 og SUC23, VfSUT1 og VfSTP14) og auxin TRANSPORTØRER (AUX1 og PIN5). Ulemper ved å utnytte gjær å uttrykke planteproteiner kan inkludere nedsatt aktivitet av plastid-lokaliserte proteiner fordi gjær mangler denne organelle, mistargeting6, og dannelse av misfolded aggregater og aktivering av stressresponser i gjær på grunn av overuttrykte av membran proteiner7,8,9.

Heterologous uttrykk for transport proteiner i Xenopus oocytter har vært mye brukt for elektrofysiologisk karakterisering av transportører10. Den første planten transport proteiner karakterisert ved hjelp heterologous uttrykk i Xenopus oocytter var Arabidopsis KALIUM kanalen KAT110 og Arabidopsis hexose transporter STP111. Siden da har Xenopus oocytter vært ansatt for å karakterisere mange plante transport proteiner som plasma membran transportører12, vacuolar sukrose transporter SUT413 og vacuolar Malate transporter ALMT914. En viktig begrensning av Xenopus oocytter for transport analyser er at konsentrasjonen av intracellulære metabolitter ikke kan manipuleres1. Videre er faglig kunnskap som kreves for å forberede Xenopus oocytter og variasjonen av oocyte partier er vanskelig å kontrollere.

Heterologous uttrykk i modellen organisme E. coli er et ideelt system i form av karakterisering av romanen plante transport proteiner. Med en fullt sekvensert Genova15, de molekylære og fysiologiske egenskapene til E. coli er godt kjent. Molekylær verktøy og teknikker er godt etablert16. I tillegg er ulike uttrykk vektorer, ikke-patogene stammer og mutanter tilgjengelig17,18,19. Videre har E. coli en høy vekst og kan lett dyrkes under laboratorieforhold. Mange proteiner kan lett uttrykkes og renses ved høye beløp i E. coli9. Når proteiner ikke kan analyseres direkte i cellulære systemer, har rekonstituering av proteiner til liposomer også vært en suksess, om enn utfordrende innovasjon for karakterisering av renset membran proteiner. Funksjonell karakterisering av anlegget mitokondrie transport proteiner inkludert stoff transportører som fosfat transportører i soyabønner, mais, ris og Arabidopsis, dicarboxylate-tricarboxylate carrier in Arabidopsis har blitt gjort ved hjelp av denne modellen systemet20,21. Men rekombinant proteiner av tomat protein SICAT9 ble funnet å være fungerende i rekonstituering eksperimenter, og andre medlemmer av CAT transporter familien ble funnet å være fungerende i Xenopus oocyte analyser22. Dermed er flere molekylære verktøy er nødvendig for karakterisering av membran transportører.

Fem polyamin transportsystemer finnes i E. coli23. De omfatter to ABC transportører formidling opptaket av spermidin og putresin, en putresin/Ornithine veksler, en kadaverin/lysin veksler, en spermidin eksportør og en putresin importør. Den putresin veksler PotE ble opprinnelig karakterisert ved hjelp av en vesicle analysen, der innsiden ut blemmer ble utarbeidet av lysering celler med en fransk Trykk og måle opptaket av radiolabeled putresin inn i blemmer i bytte for Ornithine24. Vesicle analyser ble også brukt til å karakterisere en kalsium transportør, som mediert transport av kalsium som svar på et proton gradient25. Disse eksperimentene bedt oss om å utvikle en strategi for karakterisering av andre polyamin vekslere. Vi først opprettet en stamme av E. coli mangelfull i PotE og CadB vekslere. Her viser vi funksjonell karakterisering av en plante polyamin antiporter ved heterlogous uttrykk i den modifiserte E. coli stamme, generering av membran blemmer ved hjelp av en fransk trykk, og radiolabeled analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. generering av E. coli Double Knock Out mutant med P1 Transduction

  1. Få E. coli single-knockout mutant stammer ΔPotE og ΔCadB fra E. coli genetiske Stock Center (http://cgsc.Biology.Yale.edu).
    Merk: Den ΔPotE stammen er kanamycin motstandsdyktig26 og ΔCadB belastningen er Tetracycline motstandsdyktig27.
  2. Konstruere PotE/CadB Double KNOCKOUT (DKO)-belastningen ved hjelp av P1 Transduction protokoll28.
    1. Lysat forberedelse
      1. Fortynne en overnight kulturen av ΔPotE inne frisk LB (1:100) supplert med 10-25 mm MgCl2, 5 mm CaCl2, og 0.1-0.2% glukose.
      2. Vokse ved 37 ° c for 1-2 h.
      3. Tilsett 40 μL av P1 phage lysat til kulturen, og fortsette å vokse ved 37 ° c. Monitor for 1-3 h til kulturen har lysert
        Merk: når kulturen er lysert, cellulære rusk vil være synlig i røret og kulturen vil ha et betydelig tap av turbiditet.
      4. Tilsett flere dråper kloroform (50-100 μL) til lysat og Vortex. Sentrifuger på 12 000 x g for 2 min for å fjerne cellulære rusk og overføre supernatanten til et friskt rør.
    2. Transduction
      1. Grow ΔCadB stamme over natten i lb medium.
      2. Høste cellene ved sentrifugering på 4 000 x g for 2 min og resuspend i 1/5-1/3 høstes kultur volumet i fersk lb supplert med 100 mm MgSO4 og 5 mm CaCl2.
      3. Tilsett ΔCadB Cell suspensjon til røret med phage fra trinn 1.2.1.4 og bland raskt.
      4. Tilsett 200 μL av 1 M na-citrate (pH 5.5), legg deretter til 1 mL LB. ruge ved 37 ° c i 1 time for å tillate uttrykk for den antibiotika resistente markøren.
      5. Spin celler på 4000 x g i 5 min.
      6. Resuspend i 100 μL LB supplemeted med 100 mM na-citrate (pH 5,5) og Vortex godt til å spre celler.
      7. Velg rekombinant stammer på lb agar plater med 50 μg/ml kanamycin og 10 μg/ml Tetracycline og deretter bekrefte ved polymerase kjedere reaksjon (PCR) med passende primer26,27.
      8. Kontroller PCR-fragmenter etter sekvensering.

2. uttrykk for Target Gene (AtBAT1) i E. coli mutant

  1. Forsterke full lengde sekvensen av målet genet av PCR og sett inn i gateway oppføring vektor pENTR/D-TOPO29.
    Merk: I dette tilfellet ATBAT 1.1 ble forsterket ved hjelp av Forward primer 5 ' CGGCGATCAATCCTTTGTT og omvendt primer 5 ' GCTAAGAATGTTGGAGATGG, en innledende denaturering ved 98 ° c i 2 min og deretter 30 sykluser med denaturering ved 98 ° c i 0,1 min, annealing ved 59 ° c for 0,3 min, forlengelse ved 72 ° c for 0,40 min og endelige forlengelsen ved 72 ° c i 10 min. PCR-produktet ble renset ved hjelp av en PCR opprydding Kit, kvantifisert ved hjelp av en spektrometer. Innsetting av PCR-produktet i gateway vektoren ble gjort etter manufactrurers retninger.
    1. Forvandle oppføringen vektor i kompetente top10 E. coli celler ved heatshock og velg for vellykket RECOMBINANTS på lb media med 50 μg/ml kanamycin følgende standard molekylær kloning protokoller30.
    2. Pakk plasmider DNA ved hjelp av en plasmider Extraction Kit, følge produsentens anvisninger, og sekvensen for å bekrefte riktig innsetting.
  2. Overfør målet genet inn i E. coli Destination vektor, PBAD-DEST49 av gateway LR kloning å skape et uttrykk vektor29.
    1. Forvandle uttrykket vektor til kompetent top10 E. coli celler ved heatshock for 30 s og velg vellykket RECOMBINANTS på lb media med 100 μg/ml Ampicillin30.
    2. Pakk plasmider DNA30 og sekvens for å bekrefte riktig innsetting.
  3. Transformer uttrykk vektor til E. coli ΔpotE740 (del):: kan, ΔcadB2231:: Tn10 og velg på lb plater med Ampicillin, kanamycin, og Tetracycline30.
  4. For å bestemme den optimale konsentrasjonen av arabinose for induksjon, uttrykke målet genet under kontroll av araBAD promoter i lb medier med gradient konsentrasjoner av arabinose som beskrevet29.
  5. Samle celle pellets og vurdere protein uttrykk ved SDS-side og visualisering av protein band som beskrevet i produktmanualen29.
    Merk: E. coli ΔpotE740 (del):: kan, ΔcadB2231:: Tn10 ble brukt som kontroll prøve uten BAT1 uttrykk. E. coli Double Knock Out mutant celler med den tomme PBAD-DEST49 vektoren ble ikke brukt som en kontroll på grunn av tilstedeværelsen av ccdB genet i vektoren.

3. generering av Inside-Out membran blemmer

  1. Kultur E. coli mutant cellene uttrykker målet protein ved å vokse en enkelt koloni over natten i 5 ml av polyamin medier (2% glyserol, 6 g K2HPO4, 3 g av KH2PO4, 0,5 g NaCl, NH4CL, 50 mg Tiamin, 0,79 g gjær komplett syntetiske medier adenine hemisulfate (10 mg/L), l-Arginine (50 mg/l), l-aspartic yre (80 mg/L), L-histidin hydroklorid monohydrat (20 mg/l), l-leucine (100 mg/l), l-lysin hydrochloride (50 mg/l), l-metionin (20 mg/l), L-fenylalanin (50 mg/L), L-threonin (100 mg/l), L-tryptofan (50 mg/L), L-Tyrosin (50 mg/L), L-Valin (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Overfør denne kulturen til 500 mL av polyamin-frie medier supplert med 0,0002% arabinose og vokse til cellen kulturen når en OD600 på 0,6-0.8 (vanligvis ~ 5 h).
  2. Samle cellen pellet ved sentrifugering ved 2 000 x g i 15 min ved 4 ° c. Resuspend pellet og vask tre ganger med 0,1 M kalium fosfat buffer, pH 6,6, som inneholder 10 mM EDTA (buffer 1). Det endelige volumet av celler i buffer 1 etter det tredje spinn bør være 10 mL.
  3. Generer innsiden ut membran blemmer av franske Press behandling (10 000 psi) av intakt celler ved hjelp av en 35 mL fransk Trykk Cell.
  4. Før lasting av prøven inn i standard fransk Trykk celle, smøre stempelet og O-ringene for å gjøre det lettere å sette inn i cellen.
    Merk:Disse instruksjonene er spesifikke for bruk av standard trykk celle31.
    1. Skru lukke pluggen forsiktig inn i den nedre enden av cellen. Kontroller at cellen er riktig side opp basert på bokstavene på siden av cellen. Sett stempelet inn i cellen og flytte den inn i cellen, til den maksimale fyll linjen på stempelet når toppen av stempelet. Vend enheten over og plasser den med følgende stativet mellom de tre stolpene.
    2. Hell celle fjæringen inn i kroppen av cellen.
      Merk: Vi har brukt bare 10 mL, så det vil være rikelig med plass igjen i den franske trykket celle kammer, som har en kapasitet på 35 mL.
    3. Monter standard trykk cellen på den franske Trykk cellen heten.
      1. Kontroller først at strømmen er slått av. På venstre side av panelet er forholds velgeren bryteren. Den har tre posisjoner: ned på slutten av kjøringen, lav for å bruke en mindre trykk celle, og høy for bruk med standard fransk Trykk celle. Hvis den franske pressen tidligere ble brukt med mindre celle stempelet ikke kan trekkes helt tilbake. Sett denne bryteren til ned.
    4. Slå på maskinen med bryteren på RHS på baksiden av enheten og vri pause-Run- bryteren til Kjør -posisjonen. Dette vil føre til at stempelet trekkes helt tilbake. Flytt bryteren tilbake til pause, og slå av maskinen.
    5. Løsne tommelskruene og Flytt sikkerhets klemmen som strekker seg til to kolonner i rustfritt stål til siden. Det vil svinge ut til høyre. Med en hånd som holder bunnen av lukke pluggen på plass, plukke den franske Trykk cellen opp med begge hender, og roter den 180 °, slik at stempelet er nå i oppreist stilling. Sett den på plattformen, og flytte sikkerhets klemmen tilbake på plass slik at denne klemmen holder den franske trykket cellen i posisjon.
    6. Legg merke til at strømnings ventilen heten på lukke pluggen må være tilgjengelig for operater og posisjonert slik at ventilen kan dreies fritt. Åpne strømnings ventil monteringen med noen få mot urviseren. Plasser armene på stempelet slik at de er orientert i to klokken og åtte posisjon. Stram tommelskruene slik at standard trykk cellen holdes på plass.
    7. Sett prøve utløpsrøret inn i lukke pluggen, og koble til et kort stykke fleksibel slange slik at den ødelagte celle rusk kan samles i en Falk tube. Vi bruker vanligvis en 300 mL is fylt beger for å holde falken røret oppreist, og for å holde cellen rusk kjølt.
    8. Kontroller at pause-Run- bryteren er satt til pause, og at ventil enheten er i åpen stilling. Snu maskinen tilbake til på, adust -bryteren til høy, og drei Trykk øknings ventilen på frontpanelet til høyre om en halv omdreining.
    9. Stempelet vil begynne å stige fra basen for å fortrenge luften i kammeret. Direkte luften som kommer ut av Tygon slangen festet til prøven utløpsrøret til røret i begeret.
    10. Når den første dråper væske kommer ut, lukker du strømnings ventilen forsamlingen ved å vri den med urviseren. Dette skaper en metall til metall segl, med trykk cellen, så ikke stram.
    11. Fronten av den franske pressen har et diagram på frontpanelet for å generere riktig trykk på de biologiske cellene inne i trykk cellen. I dette tilfellet, øke trykket ved å dreie trykket Øk ventilen med klokken, til måleren når 640 PSI. Dette vil skape et internt Trykk på 10 000 psi.
    12. Når cellen har nådd mål trykket, åpne strømnings ventilen forsamlingen litt ved å vri den mot urviseren. Juster åpningen av ventilen for å tillate en strømningshastighet på bare ca 10 dråper per min.
    13. Når stopp linjen på stempel legemet når toppen av strømningscellen. Slå pause-Run-bryteren til pause. Dette er viktig fordi å ha stempelet inn lenger inn i cellen vil skade enheten. Åpne flyt ventil sammenstillingen og samle de resterende dråpene.
    14. Drei forholds velgeren til ned, og sett deretter pause løpe bryte ren for å kjøre. Når den nederste platen er fullstendig tilbaketrukket, setter du Run -bryteren til pause, og slår av maskinen.
    15. Fjern den franske Trykk cellen fra den franske pressen, og Demonter for rengjøring. Oppbevar alle deler tørt med et lys belegg av glyserol. Fjern og Bytt ut eventuelle pakninger eller tetninger med tegn på slitasje.
  5. Fjern ubrutt celler og celle rusk av den franske Trykk eluent ved sentrifugering ved 10 000 x g i 15 min ved 4 ° c. Kast pellet, og overføre supernatanten til ultracentrifuge rør.
  6. Pellet membran blemmer fra den resulterende supernatanten ved ultracentrifugationat 150 000 g for 1 t ved 4 ° c.
  7. Vask membranen blemmer en gang, uten blanding, i 1 mM Tris-maleate, pH 5,2 inneholder 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoethanol og 10% glyserol og resuspend i samme buffer (buffer 2)23 ved hjelp av en Dounce vev jeksel. Vanligvis membranen brøkdel fra 500 mL av kulturen vil bli suspendert i 5 mL buffer, og en konsentrasjon av 5-10 mg av membran protein/mL ved hjelp av Biochinic acid analysen32.
  8. Oppbevar 100 μL alikvoter av membran preparater ved-80 ° c i 1,5 mL mikrosentrifugen rør.

4. Western Blot og orientering av transporter analysen

  1. Vask og resuspend blemmer fra trinn 3,7 i 30 mM Tris pH 7,8 + 0,1 mM CoCl2.
  2. Til 100 μL prøver, tilsett 1 μL av 2 mg/mL carboxypeptidase A i 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.
  3. Inculate for 20 min ved 20 ° c. Stopp fordøyelsen ved å legge 5 μL av 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-mercaptoethanol pH 7,5.
  4. For å deaktivere enzymet fullstendig, ruge løsningen for 1 time ved romtemperatur.
    Merk: Blemmer uten catboxypeptidase en behandling ble brukt som en kontroll.
  5. Analyser prøver ved elektroforese i nærvær av litium natriumdodecylsulfat sulfat. Tilsett 5-10 μL av 150 mg/mL litium-natriumdodecylsulfat sulfat, 450 mg/mL glyserol, 0,1 mg/mL bromophenol blå, 0,4 M Tris pH 7,5 til 100 μL av prøve.
  6. Utfør proteinimmunoblotting ved å legge et nitrocellulose filter fuktet med 25 mM natrium-hydrogen fosfat pH 7,5 på polyakrylamid gel. Plasser disse mellom to fuktet cellulose filtre og til slutt mellom to fuktet plast skure pads. Plasser denne samling mellom elektrodene i et kammer som inneholder 25 mM natrium hydrogen fosfat pH 7,5 ved 2-4 ° c.
  7. La electrotransfer av proteiner fortsette i 3 timer ved 20 V og 2-3 A.
  8. Blokker nitrocellulose membranen over natten ved 2 ° c i en blokkerings buffer på 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 og 0,5 mg/mL mellom 2033.
  9. Ruge den nitrocellulose filter for 2 h med en 1:5000 fortynning av anti-hans (C terminal)-HRP antistoff i blokkering buffer (20 mL) og vask to ganger med 50 mL buffer for totalt 60 min.
  10. For å visualisere immunoblot, oppløse 6 mg 4-klor-1-naphthol i 20 mL denaturert alkohol og tilsett 80 mL 15 mM Tris pH 7,5 og 50 μL av 30% H2O2. Bad filteret papir i underlaget løsning i 20 min. Reagens vil reagere med antistoff å danne en blå utfelling på nitrocellulose membranen. Når tilstrekkelig farge har utviklet seg, skyll membranen med vann og la den tørke.

5. transport analysen

  1. Ruge 100 μL alikvoter med membran blemmer ved 12 ° c i 5 min.
  2. Initiere transport ved å legge radiolabeled polyaminer til membranen blemmer ved en endelig konsentrasjon av 50 μM (med mindre annet er angitt). Lag 3H-substrat (spermidin eller putresin) løsninger i en analysebuffer bestående av 10 mm Tris-HCL, 10 mm kalium fosfat, pH 8,0 og 0,14 M KCl23 (buffer 3) med modifikasjoner avhengig av analysen.
  3. Gjennomfør transport analyser i 1 min ved 12 ° c i 1,5 mL microfuge rør.
  4. Etter 1 min, overføre reaksjonsblandinger til filtrering manifold og filter gjennom en 0,45 μm nitrocellulose membran filter.
    1. Tilsett 3 mL iskald analysen buffer som inneholder en 10 ganger høyere konsentrasjon av umerkede polyaminer etterfulgt av 3 mL analysen buffer uten polyaminer å redusere uspesifisert binding.
    2. Overfør de vasket filtrene til 20 mL en gangs scintillation hetteglass som inneholder 10 mL scintillation væske og Bestem radioaktivitet ved hjelp av en flytende scintillation teller. Scintillation telleren måler radioaktiviteten i prøven og rapporterer den som disintegrations per min (DPM).
  5. Beregn netto polyamin opptaket som differansen mellom opptaket ved 1 min ved blemmer inkubert ved 12 ° c og opptak ved 0 min ved blemmer inkubert på is.
    Merk: Massen av underlaget importert til blemmer er beregnet som følger. Hvis prøvevolumet i microfuge røret er 0,2 μL og start konsentrasjonen av underlaget er 100 μM, da er den totale massen av underlaget i microfuge røret 20 x 10-12 M. På grunn av den svært høye spesifikke aktiviteten av kommersielt merkede underlag (ofte 2,22 x 109 DPM/mm) kan massen til isotop som legges til, ignoreres i beregningen. Så hvis den totale mengden av isotop som ble lagt til microfuge røret var 100 x 106 DPM og blemmer hadde en netto opptak av 1 000 DPM, deretter den totale massen av underlaget tatt opp av blemmer var 1% av det totale antall føflekker av substrat eller 2 x 10-13 M.
    1. Bestem Km for underlaget ved å måle opptaket av 10, 25, 50, 250 og 500 μM radiolabeled substrat til blemmer som uttrykker mål proteinet. Beregn Michaelis-Menten Kinetics ved hjelp av en ikke-lineær regression metode ved å bruke Michaelis Menton-modellen til den statistiske programvarepakken34.
  6. For konkurranse eksperimentene legger du til 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM eller 2 mM nonlabelled konkurrerende substrat i analyse bufferen til det 1,5 mL mikrosentrifugen røret som inneholder 100 μL av blemmer ved 12 ° c.
    1. Legg radiolabeled polyamin (50 μM) til mikrosentrifugen røret samtidig.
    2. Mål radioaktivitet som er fanget inne i blemmer som nevnt ovenfor, ved å gjenta trinn 5 til 5.4.2.
    3. Bestem tydelig Km (km, app) for konkurrerende underlag ved å måle opptaket av 10, 25, 50, 250 og 500 μM radiolabeled polyaminer i nærvær av 100 μM eller høyere nonlabelled substrat og ved hjelp av en ikke-lineær regresjon metode for å plotte kurven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De viktigste trinnene i denne protokollen er oppsummert pictorially i figur 1. Kort, E. coli celler mangelfull i alle polyamin vekslere og uttrykker AtBAT1 er kultivert, sentrifugert, vasket med en buffer og utsatt for cellelyse med en fransk trykk. Lyse har en tendens til å produsere blemmer som er stort sett inne-ut og felle buffer utenfor cellene. Celle rusk er fjernet av sentrifugering, og en andre ultracentifugation trinn brukes til å samle en membran pellet. Membran pellet er resuspendert i Tris-maleate buffer pH 5,2 og oppbevares ved-80 ° c. Transport analysene er gjort ved 12 ° c, som ble funnet å være optimalt for å opprettholde membran stabilitet. Analysene er initiert av tilsetning av radiolabeled substrat og et skifte i pH i buffer suspensjonen av blemmer til pH 8,0. Etter 1 min, is-kulde analysen buffer med umerkede underlag er lagt for å stoppe opptaket av radiolabel inn i blemmer. Radiomerket blemmer er fanget ved filtrering gjennom nitrocellulose membraner. Membraner overføres til scintillation hetteglass og radiolabel på membraner bestemmes av flytende scintillation telling.

En Western Blot brukes til å verifisere at AtBAT1 er translocated til blemmer (figur 2). Undersøker blot med et anti-His C-terminal antistoff avdekket en fusjon konstruere protein på ca 72,3 kDa (figur 2, Lane 2). Fordøyelsen av blemmer før SDS-side resulterte i en dimunition, men ikke et fullstendig tap av sonden signal (figur 2, Lane 3). Nedgangen i sonde signalet som en konsekvens av carboxypeptidase A antyder at de fleste av C-terminal rester er på utsiden av blemmer.

I denne analysen systemet, blemmer er suspendert i en buffer ved pH 5,2 slik at pH inne i blemmer equilibrates med buffer. Transport av radiolabeled substrat inn i blemmer på pH 5,2 initieres ved å suspendere blemmer i en pH 8,0 buffer, og dermed skape en pH-gradering av pH 2,8 over membranen. Ved 12 ° c ble opptaket av radiolabeled spermidin av blemmer høyest på 1 min, og forble lineær over 3 min (Figur 3A). Derfor inkubasjonstid for transport-analysen ble fast på 1 min. For å gjøre rede for ikke-spesifikk binding av radiolabel ble blemmer inkubert ved 0 ° c i nærvær av radiolabeled substrat i ett minutt, og disse antallene ble trukket fra opptak av ladiolabel ved høyere temperaturer.

Figur 3B viser opptaket av radiolabeled spermidin inn i blemmer etter ett minutt. Det var ingen netto opptak av isotop ved membran blemmer som var forberedt og lagret på pH 8,0, da det ikke var Proton gradient over vesicle membranen. For å demonstrere effekten av spredning av den kunstige Proton gradient, membranen blemmer ble inkubert i pH 8,0 buffer i 10 min før tilsetning av merket substrat25. Under disse forholdene, et minimalt opptak av radiolabeled substrat ble vist. Opptak av radiolabeled spermidin var også minimal i blemmer utarbeidet med E. coli celler mangelfull i polyamin vekslere CadB og PotE. Til sammen viser disse resultatene at Proton drevet opptak av spermidin skyldtes BAT1-proteinet (Figur 3A, B).

For å bestemme underlaget spesifisitet av proteinet, ble Km verdier beregnet ved å måle opptaket av radiolabeled substrat ved 10, 25, 50, 100, 250 og 500 μM konsentrasjoner. Km for spermidin, putresin og Arginine var 55 ± 12 μM, 85 ± 20 μM og 1,4 ± 0,5 mm, henholdsvis indikerer at dette proteinet er en høy affinitet polyamin og arginin veksler (Figur 4).

Affinitet av transportøren for et bestemt substrat kan også fastslås indirekte ved hjelp av konkurranse analyser. Her har vi benyttet to metoder for å evaluere konkurransen mellom to underlag. I den første metoden ble opptaket av 50 μM radiolabeled spermidin målt i nærvær av økende konsentrasjoner av nonlabelled konkurrerende substrat (figur 5A). I den andre metoden, den tilsynelatende Km for spermidin ble beregnet ved å måle opptaket av økende konsentrasjoner av radiolabeled spermidin i nærvær av 100 μM Nonlabelled konkurrerende substrat (figur 5B). Konkurranse analyser avslørte at GABA er en konkurransedyktig hemmer av spermidin med en Km, app på 164 ± 15 μM (figur 5a, B). Videre måler opptaket av 50 μM radiolabeled spermidin i nærvær av varierende konsentrasjoner av ulike aminosyrer avdekket at AtBAT1 er også i stand til å transportere glutamat og alanin ved mM konsentrasjoner (figur 6).

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av metoden. (A) skjematisk representasjon som beskriver viktige trinn i utarbeidelsen og rensing av membran blemmer fra E. coli. (B) skjematisk representasjon som beskriver viktige trinn i transport analysen av membran vesicle preparater ved hjelp av radiolabeled underlag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Western Blot viser uttrykk for AtBAt1 i renset blemmer. Band ble visualisere ved hjelp av pepperrot peroksidase bøyd anti-hans (C-term)-HRP antistoff. Lane 1, Prestained protein stigen. Lane 2, renset blemmer uttrykke atbat 1.1 viser et band av den forventede størrelsen på Fusion protein. Lane 3, renset blemmer uttrykker atbat 1.1 ble forbehandlet med carboxypeptidase A før SDS elektroforese og vestlige blotting. Tilsvarende mengder blemmer (protein) ble lagt til hvert felt. Redusert farging indikerer at C-terminalen av proteinet i de fleste blemmer er degradert av ved protease fordøyelsen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: transport aktivitet av blemmer som viser effekten av BAT1 protein uttrykk og betydningen av en pH-gradient. (A) tid avhengig opptak av 3H merket SPERMIDIN i blemmer uttrykker BAT1 med en intern pH på 5,2 og introdusert til en buffer ved pH 8,0. I kontrollen analysen, ble blemmer lagt til analysen buffer ved pH 8,0, 10 min før tilsetning av 3H merket spermidin å muliggjøre spredning av Proton gradient. Da opptaket av radiolabel inn i blemmer ble vurdert over en 1 min intervall. (B) opptak av 3H merket spermidin i nærvær av et proton gradient (intern pH på 5,2), i fravær av et proton gradient (intern pH på 8), i blemmer lagt til analysen løsning 10 min før tillegg av radiolabeled spermidin og i blemmer laget av E. COLI mutant celler ikke uttrykker BAT1. Opptak til blemmer ble overvåket i 1 min. Alle verdier presenteres som gjennomsnittet ± SE av fem replikerer. Data analysen ble utført ved hjelp av en student t-test og * indikerer en betydelig forskjell fra kontroll (p verdi < 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: in vitro analyser av polyamin og Arginine transport aktivitet av BAT1. (A) Km -verdiene for spermidin og putresin opptak er henholdsvis 55 ± 12 μM og 85 ± 32 μM. (B) Km for arginine-opptak er 1,4 ± 0,5 mm. Alle verdier presenteres som gjennomsnittet ± SE av fem replikerer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: GABA er en konkurransedyktig hemmer av spermidin transport av BAT1. (A) opptak av 3H merket Spermidin ved blemmer uttrykke atbat 1.1 ble betydelig redusert i nærvær av 100 ΜM eller 500 μM GABA. (B) tilsynelatende Km for spermidin opptak av bat 1.1 ble økt til 164 ± 20 μM i nærvær av 100 μM GABA. Alle verdier presenteres som gjennomsnittet ± SE av fem replikerer. Data analysen ble utført ved hjelp av en student t-test og * indikerer en betydelig forskjell fra kontroll (p verdi < 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: glutamat og alanin er konkurrerende hemmere av spermidin TRANSPORTBY BAT1. Spermidin opptak ble signifikant redusert i nærvær av 1 mM ikke-merket glutamat og 1,5 mM ikke-merket alanin. Alle verdier presenteres som gjennomsnittet ± SE av fem replikerer. Data analysen ble utført ved hjelp av en student t-test og * indikerer en betydelig forskjell fra kontroll (p verdi < 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien skisserer vi en metode for karakterisering av en antiporter ved først å uttrykke proteinet i E. coli og deretter generere membran blemmer, slik at heterologously-uttrykt protein kan analyseres i en celle-fri system. I tillegg til utstyr som finnes i de fleste molekylære biologi laboratorier, krever denne strategien bruk av en fransk presse, en ultracentrifuge, og tilgang til et anlegg for å gjennomføre radioisotop analyser.

En grunnleggende forutsetning for denne teknikken er at heterologous protein er riktig rettet mot plasma membranen av E. coli. Denne strategien kan også være nyttig for funksjonell analyse av organellar transportører siden plastid ADP glukose transporter var vellykket lokalisert til E. coli Cell membran og funksjonelt karakterisert35. Vektoren (pBAD-DEST49) som brukes i disse eksperimentene inneholder en N-Terminal thioredoxin protein for å øke løselighet av det oversatte produktet. N-Terminal fusjoner av en liten B. subtilus protein mystisk, har blitt funnet å muliggjøre mer effektiv målretting av membran transportører til cytoplasmatiske membranen36. Men misfolding hendelser, og svikt i proteiner for å være riktig integrert i cytoplasmatiske membranen er potensielle problemer som utelukker bruk av bakterielle uttrykks systemer for mange typer transportører1.

Membran blemmer har også blitt brukt til å karakterisere anlegget transportører37,38. Som blemmer mangler de essensielle energikilder som ATP og enzymer, interferens fra aktive transportører og annen metabolsk aktivitet er minimal. Dermed er dette systemet ideelt for analyse av passive translokasjoner som metabolitten vekslere. Den vrenges ut membranen blemmer, i særdeleshet, kan brukes til karakterisering av eksportører og antiporters siden sammensetningen av den interne løsningen kan manipuleres ved å endre sammensetningen av buffer 1. Videre bruker fransk trykk eller ultralyd sonikering er ganske effektiv i å generere innsiden ut membran blemmer fra intakt E. coli celler. 95% av blemmer generert av ultralyd sonikering eller fransk Trykk har vrenges ut membraner39,40. PotE, E. coli antiporter av putresin og Ornithine, var den første polyamin antiporter som ble karakterisert ved hjelp innsiden ut membran blemmer23. Vi brukte P1 Transduction å lage en bestemt mutert stamme for karakterisering av en polyamin antiporter, og denne belastningen kan være nyttig for karakterisering av andre dyr, sopp eller plante polyamin vekslere. Vi har også envision at andre E. coli stammer med to eller flere gen slettinger kan være nyttig for karakterisering av andre planter og dyr utveksle transportører med membran blemmer.

Det mest kritiske trinnet i denne protokollen er uttrykket av proteinet i E. coli mutant systemet. En E. coli Expression vektor med en induserbart promoter benyttes for å fremme stram, dose avhengig regulering av heterologous genuttrykk. Tilstedeværelsen av N terminal og C terminal koder som hans-patch Thioredoxin, v5 epitope eller 6xHis i vektoren er nyttig for påvisning og rensing av proteinet. I tillegg er tilstedeværelsen av en thioredoxin Fusion protein som er en del av pBAD49 vektor, kan øke oversettelsen effektivitet og, i noen tilfeller, løselighet av eukaryote proteiner uttrykt i E. coli41. De ulike Codon valgene i Arabidopsis og e. coli kunne utfordre protein uttrykk i e. coli. Det er kjent at Codon optimalisering kan imponerende øke heterozygot proteiner uttrykk i E. coli42. I vesicle analysen, Codon optimalisert AtBAT 1.2 viste en høyere utveksling aktivitet enn ikke-Codon optimalisert AtBAT 1.1 i E. coli celler (data ikke vist), viser at Codon optimalisering var nyttig å forbedre uttrykk og funksjon av heterologously uttrykt proteiner i bakterielle celler. Produksjonen av membran blemmer ved forsiktig justering av ventilen for å opprettholde en langsom selv drypp av lysert celler er også et viktig skritt i prosedyren. Etter ultracentrifugation har vi funnet at blanding av membran blemmer i en Dounce homogenisator minimerer prøven for å prøve variasjon mellom alikvoter av membran blemmer som er forberedt og deretter lagret ved-80 ° c.

En begrensning av E. coli Expression systemer er at de ikke er i stand til post-translational modifikasjoner som N-glykosylering eller acetylering. Fravær av disse protein modifikasjoner kan påvirke protein aktivitet1. Men mutanter i stand til å utføre disse endringene er identifisert og kan brukes som et verktøy for å uttrykke proteiner som krever slike modifikasjoner43. Generering av tilstrekkelige mengder av den uttrykte protein kan være en utfordring på grunn av utfolder seg og aggregering som inkludering organer, svikt i proteinet til å være riktig integrert i cytoplasmatiske membran, mistargeting og MIS-regulering på grunn av mangel på innlegg translational modifikasjoner.

En mindre begrensning av denne teknikken er at den ikke gir bevis for den naturlige orienteringen av transportøren. Dette kan oppnås ved å dra nytte av N eller C terminal koder og immunologiske metoder. Tilgjengeligheten av en bestemt endestasjon av proteinet i blemmer kan oppnås ved fordøyelsen av alle tilgjengelige, og derfor antagelig eksterne Termini av transportøren, elektroforese av proteinet i nærvær av natrium natriumdodecylsulfat sulfat, overføring til nitrocellulose filtre og påvisning av de resterende, interne Termini med antistoffer40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Støtte for dette prosjektet kom fra BGSU Graduate College, og BGSU Office of sponsede programmer og forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191 (2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).
  29. Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory Manual. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  31. GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).
  32. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  33. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  34. PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).
  35. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  36. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  37. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  38. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  39. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  40. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  41. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  42. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  43. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

Tags

Biokjemi membran transporter antiporter polyamin transport polyamin veksler membran blemmer fransk trykk kinetisk analyse radioisotop transport analyser GABA
Karakterisering av membran transportører av Heterologous uttrykk i <em>E. coli</em> og produksjon av membran blemmer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P.… More

Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P. F. Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles. J. Vis. Exp. (154), e60009, doi:10.3791/60009 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter