Summary
Dit artikel beschrijft de generatie van een orthotopic muismodel van menselijke pleura mesothelioom door implantatie van H2052/484 mesothelioom cellen in de pleuraholte van immuungecompromitteerde athymische muizen. De longitudinale monitoring van de ontwikkeling van intrapleurale tumoren werd beoordeeld door niet-invasieve multimodale [18F] -2-Fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emissie tomografie en computertomografie beeldvorming.
Abstract
Maligne mesothelioom van de pleura (MPM) is een zeldzame en agressieve tumor die zich voordoet in het mesothelium dat de longen, het hart en de thoracale holte bedekt. De ontwikkeling van MPM wordt voornamelijk geassocieerd met asbest. Behandelingen bieden slechts een bescheiden overleving, aangezien het mediane overlevings gemiddelde 9 – 18 maanden na het tijdstip van diagnose is. Daarom moeten effectievere behandelingen worden vastgesteld. De meeste gegevens die nieuwe therapeutische doelstellingen beschrijven, werden verkregen uit in vitro experimenten en moeten worden gevalideerd in betrouwbare in vivo preklinische modellen. Dit artikel beschrijft een dergelijke betrouwbare MPM orthotopic model verkregen na injectie van een humane MPM cellijn H2052/484 in de pleuraholte van immunodeficiënte athymische muizen. Transplantatie in de orthotopic site maakt het bestuderen van de progressie van tumor in de natuurlijke in vivo omgeving. Positron emissie tomografie/computertomografie (PET/CT) moleculaire beeldvorming met behulp van de klinische [18f] -2-Fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18f] FDG) radio Tracer is de diagnosemethode van keuze voor het onderzoeken van patiënten met mpm. Dienovereenkomstig werd [18F] FDG-PET/CT gebruikt om de progressie van de ziekte van de H2052/484 orthotopic model te monitoren. Deze techniek heeft een hoog 3R potentieel (reduce het aantal dieren, rgegevens om pijn en ongemak te verminderen, en rv ervangen door dier experimenten met alternatieven), omdat de ontwikkeling van de tumor niet-invasief kan worden gecontroleerd en het aantal benodigde dieren aanzienlijk kan worden verminderd.
Dit model toont een hoge ontwikkelingssnelheid, een snelle tumorgroei, is kostenefficiënt en zorgt voor een snelle klinische vertaling. Door dit orthotopic xenotransplantaatmodellen is mpm-model te gebruiken, kunnen onderzoekers de biologische reacties van een betrouwbaar mpm-model beoordelen na therapeutische ingrepen.
Introduction
Maligne mesothelioom van de pleura (mpm) is een kanker die meestal wordt geassocieerd met de blootstelling aan asbestvezels1,2,3. Hoewel asbest in de meeste westerse landen4,5,6verboden is, neemt de incidentie van mpm nog steeds toe met7,8. Onlangs suggereert blootstelling van muizen aan koolstofnanobuizen dat ze kunnen resulteren in een significant gezondheidsrisico bij de mens9,10. De gegevens suggereren dat blootstelling aan deze producten kan leiden tot chronische ontstekingen en moleculaire veranderingen (bijv. verlies van tumor suppressor trajecten) die de progressie ten grondslag liggen aan maligne mesothelioom. Op dit moment zijn multiwall carbon nanotubes een van de belangrijkste producten van nanotechnologie en worden steeds meer opgenomen in verschillende producten zoals composieten, energieopslag materialen, medicijnen, elektronica en milieuherstel materialen.
MPM is een kanker met een slechte prognose en de meeste patiënten sterven binnen twee jaar na de diagnose als gevolg van een beperkte werkzaamheid van de huidige behandelings modaliteiten11. De keuze van de behandeling voor MPM is afhankelijk van de kanker fase. Voor de meeste vroege fase MPM (fase 1 en eventueel enige fase 2 of 3 tumoren), de klinische aanpak is een multimodale therapie met inbegrip van de chirurgische resectie van de tumoren, geassocieerd met radiotherapie en chemotherapie12. Een gecombineerde chemotherapie met cisplatine en pemetrexed is geïndiceerd voor de behandeling van de meeste patiënten die gediagnosticeerd zijn met gevorderde lokaal invasieve ziekte, die niet vatbaar is voor chirurgische resectie, of die anders geen kandidaat zijn voor curatieve chirurgie13,14. Er is daarom een dringende behoefte om effectievere behandelingen voor MPM-patiënten te ontwikkelen. Er zijn echter weinig gevalideerde in vivo diermodellen die de klinische relevantie van MPM weerspiegelen. Verschillende Murine mpm modellen zijn ontwikkeld, maar de meeste van hen niet getrouw recapituleren de complexe aspecten van de mpm tumor micro omgeving15,16,17,18. Het gebruik van asbest-geïnduceerde MPM bij muizen, genetisch gemanipuleerde MPM-Muismodellen of modellen van syngene transplantatie van muriene MPM-cellijnen wordt beperkt door fundamentele fenotypische en functionele verschillen en vertaalt bijgevolg slecht nieuwe ontdekkingen naar de kliniek. Andere preklinische Murine mpm-modellen zijn meestal afhankelijk van subcutane of peritoneale xenograften van menselijke cellijnen in immunodeficiënte muizen. Hoewel deze modellen gemakkelijk te bewaken zijn en fundamentele gegevens leveren, is de micro-omgeving van deze xenotransplantaten niet zo vergelijkbaar met menselijke tumoren die de translatie kracht van de meeste van deze preklinische studies aantasten, die het meest van deze preklinische-onderzoeken uitmaken. Omgekeerd, orthotopic xenotransplantaten weerspiegelen het gedrag van de patiënt tumor en reactie op de behandeling als ze worden omringd door een soortgelijke micro-omgeving als die gevonden in de oorspronkelijke tumor site16.
Moleculaire beeldvorming door [18F] FDG-PET/CT is de methode van keuze om de progressie van de ziekte in de lengterichting te monitoren bij patiënten met mpm20,21. Daarom bevordert het toevlucht nemen tot deze niet-invasieve beeldvormings methode de vertaling van preklinisch onderzoek naar klinische proeven16,22aanzienlijk. Bovendien helpt het om het vereiste aantal dieren te verminderen, aangezien elk dier zijn eigen controle over de tijd vertegenwoordigt.
In dit artikel presenteren we een betrouwbaar orthotopic xenotransplantaatmodellen is mpm-model dat is verkregen na injectie van de humane mpm-cellijn H2052/484 in de pleuraholte van athymische-muizen. In combinatie met [18F] FDG-PET/CT-beeldvorming is dit model een waardevolle en reproduceerbare methode om functionele en mechanistische effecten van nieuwe diagnostische strategieën en behandelingen voor menselijke mpm te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hieronder beschreven procedures zijn goedgekeurd door het Comité voor dierenverzorging en-gebruik en door het Veterinair Bureau van Genève, Zwitserland (vergunning GE/106/16). De MPM cellijn H2052/484 werd opgericht en gekarakteriseerd in ons laboratorium zoals beschreven in het artikel van Colin DJ en et al.23. Kort, H2052/484 cellijn werd opgericht uit een thoracale tumor verkregen na een intrapleurale injectie van NCI-H2052 (ATCC) cellen in immunodeficiënte naakt muizen.
1. experimenteel ontwerp
- Bepaal hoeveel muizen nodig zijn volgens het experiment met behulp van statistische vermogens berekening (bijv. http://powerandsamplesize.com/Calculators/).
- Ten minste een week voorafgaand aan de implantatie, koop acht tot tien weken oude athymische vrouwelijk naakt muizen Foxn1nu nu/nu en huis ze gedurende ten minste een week in een specifiek-pathogeen-vrije (SPF) omgeving.
2. bereiding van cellen voor implantatie
- Bereken hoeveel H2052/484 cellen nodig zijn, aangezien elke muis wordt geïnjecteerd met 1 x 106 cellen (stap 1,1). Bereid een extra aantal cellen voor als injectie op muizen, waarbij de spuit monsters worden bemonsterd.
- Cultuur de MPM H2052/484 cellijn in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS), 100 eenheden/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine in een weefselkweek incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Kweekcellen voor implantatie tot ongeveer 80% samenvloeiing (~ 7 x 106 cellen per 15 cm Petri schaaltje).
- Over 1 h voor het enten, bereid de cellen voor.
- Gooi de media weg, was cellen met steriele PBS zonder calcium en magnesium (10 mL per 15 cm petrischaaltje) en maak cellen los door 5 minuten te brotten met 0,05% trypsine-2 mM EDTA (2 mL per 15 cm petrischaaltje).
- Verzamel de cellen in RPMI medium (10 mL per 15 cm Petri schaaltje) en Tel de cellen met een hemocytometer.
- Verzamel het juiste aantal cellen voor het aantal muizen dat moet worden geïnjecteerd, gezien zoals berekend volgens stap 1,2.
- Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten, was de celpellet in 10 ml rpmi-medium zonder FBS en Centrifugeer gedurende 3 minuten opnieuw bij 300 x g .
- De cellen in een passend volume van het RPMI-medium zonder FBS te hervatten tot een concentratie van 1 x 106 cellen per 50 μL, aangezien elke muis moet worden geïnjecteerd met een volume van 50 μL.
3. tumor cel implantatie
- Voorafgaand aan de implantatie, bereiden van de anesthesie systeem en chirurgische gebied in een laminaire stroom kap door het spuiten van alle oppervlakken met een ontsmettingsmiddel. Bereid steriele of gedesinfecteerde benodigdheden in de laminaire stroom afzuigkap, inclusief het anesthesie systeem, het verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van de muis te behouden, de polyvidon jodiumoplossing, een 30 G Hamilton spuit (bijv. 705RN spuit, 30 G naald-20 mm-punt stijl 4), steriel gaas en wattenstaafjes, steriele wegwerp scalpellen en chirurgische instrumenten en steriele micropipetten en tips.
- Bewaar en open de microgeïsoleerde SPF-kooien in de gedesinfecteerde stroom afzuigkap en verdovings de ene muis na de andere volgens de enten snelheid. De duur van het enten is ongeveer 5 – 10 min voor geëxperimenteerde technici.
- Muizen worden verdoofde door het eerst te induceren met 4 – 5% isoflurane. Vervolgens onder anesthesie op de verwarmingskussen te houden terwijl enten met 3% isoflurane. Bepaal de diepte van de anesthesie door het verlies van de rechtse reflex met de muis.
- Zodra een muis is verdoofd, Injecteer subcutaan 0,05 mg/kg buprenorfine als een pijnstillende/post-operatieve pijn-reliëf.
- Plaats de muis op de rechterkant (rechter laterale decubitus) op de verwarmingskussen.
- Reinig het chirurgische gebied met polyvidon jodiumoplossing en maak een 5 mm incisie van de huid en duidelijke omringende vet en spieren met stompe schaar om de ribben bloot.
- Homogeniseren de celsuspensie met een concentratie van 1 x 106 cellen per 50 ΜL rpmi-medium zonder FBS en laadt 50 μL van de suspensie met de Hamilton-spuit. Vermijd luchtbellen en veeg de naald met 70% alcohol om niet-orthotopic enten van cellen te voorkomen. Homogeniseer de celsuspensie vóór elke injectie.
- Injecteer de cellen langzaam in de pleuraholte tussen de 6 en 7th ribben met een hoek van 30° en een diepte van 2 – 3 mm net onder de intercostale spieren. Zorg ervoor dat u niet in de longen injecteert door de naald net onder de ribben te houden. De naald moet zichtbaar zijn door transparantie door de spieren (Figuur 1A).
- Sluit de wond met drie tot vier absorbabele hechtingen.
- Bewaar de muizen in een opgewarmde omgeving totdat ze wakker worden.
- De dag na, herhaal buprenorfine injectie. Monitor muizen volgens het experimentele ontwerp en de autorisatie.
4. [18F] FDG-PET/CT-beeldvorming
Opmerking: Alle hieronder beschreven procedures moeten worden goedgekeurd door lokale dieren huisvesting en imaging faciliteiten. Zorg ervoor dat radioactieve materialen worden geïmporteerd, opgeslagen en behandeld volgens de lokale regels voor stralingsveiligheid (bijv. activiteit van de voorraadoplossingen, afgeschermde capuchon afhandeling). SPF-condities kunnen worden gehandhaafd door dieren te manipuleren in een laminaire stroom afzuigkap en door ze te laden in een SPF-compatibel scanner bed (Figuur 1B, C).
- Monitor de tumor ontwikkeling uitvoeren van PET/CT Imaging, eenmaal per week, vanaf dag 7 na implantatie van de H2052/484 cellen. Elk dier vertegenwoordigt zijn eigen controle over de tijd.
- Vermijd nood van dieren voorafgaand aan beeldvorming door muizen naar Imaging Facility behuizing te vervoeren indien beschikbaar of houd ze dicht bij de faciliteit.
- Snelle muizen voor 12 – 16 h vóór [18F] FDG-PET/CT, wat achtergrond signalen vermindert. Zie Fueger24 , die de impact van dier hantering op [18F] FDG-PET/CT-scans beschreef.
- Verontreinigen en bewaren van het muizen bed volgens de lokale regels.
- Registreer alle tijden van metingen van de radioactiviteitsdoses, injecties en PET-scans om Suv's te kunnen berekenen.
- Pre-warme muizen bij 30 °C gedurende 30 minuten voorafgaand aan de injectie van [18F] FDG die het metabolisme van bruin vetweefsel (bat) vermindert. Bijvoorbeeld, pre-warm in verwarmings kamers, met behulp van verwarmings pads of met behulp van infraroodlampen.
- Bereid 3 – 4 MBq-doses van [18F] FDG uit de stamoplossing in 150-200 μL van de zoutpan in 1 ml insuline spuiten met behulp van een dosis kalibrator. Insuline spuiten hebben het voordeel dat ze bijna geen dode volume hebben en de meting van de resterende activiteit na injectie kunnen voorkomen.
- Anaesthetiseer muizen met Isofluraan zoals beschreven in stap 3,3. Weeg muizen en Injecteer vervolgens intraveneus 3 – 4 MBq [18F] FDG. Retro-orbitale injectie is een methode van keuze, omdat het snel, gemakkelijk en vermijdt staart ader injectie problemen of vertraagde opname van intraperitoneale injectie.
- Na de injectie, laat muizen wakker voor 45 min in hun kooien onder de warme omstandigheden gestart in stap 3,5. De duur van [18F] de opname van het FDG is 1 uur; 15 min zijn normaalgesproken voldoende om muizen op het bed te laden en CT voor huisdier uit te voeren.
- Anaesthetiseer muizen met Isofluraan zoals beschreven in stap 3,3 en laad ze op het scanner bed (Figuur 1B).
- Breng het bed over naar de scanner en onderwerp dieren naar een CT-scan gecentreerd op de longen. Verkrijg scans op 80 kVp, 160 μA, 1024 projecties tijdens een rotatie van 360 °, met een gezichtsveld van 74 mm (1,6 x vergroting, voorbeeld van Triumph acquisitie) (Figuur 1C).
- Verplaats het bed naar het huisdier subsysteem en start de overname 1 h na [18F] FDG injectie voor een duur van 15 min. Met de meeste PET/CT-systemen kan het bed automatisch van de CT naar het huisdier worden verplaatst om de FOV gecentreerd op hetzelfde gebied te houden.
- Verwijder de muizen uit de Imaging kamer en laat ze in hun kooi herstellen.
- Houd muizen in een gebied gewijd aan radioactief verval volgens lokale regels.
5. analyses van [18F] FDG-PET/CT-scans
- Reconstrueren CT scans uitgevoerd in de bovengenoemde omstandigheden met een matrix van 512 en een Voxel grootte van 0,144 mm (gefilterde terug projectie-FBP algoritme, ingebouwde software). Reconstrueren PET scans met behulp van een 20 iteraties van een geordende subset verwachting maximum-3 Dimension-OSEM3D algoritme. Kalibreer de beelden in BQ/mL door een Phantom cilinder te scannen. Registreer automatisch de CT-en PET-scans op basis van uw ingebouwde software oplossing.
- Analyseer longen volumes met behulp van de analyse software (tabel met materialen).
- Laad CT-gegevens als referentie (Ref) door op het pictogram Open Data te klikken. Laad vervolgens PET-gegevens als invoer (Inp1) door op het pictogram gegevens toevoegen te klikken.
- Pas de kleurschalen ("WL") van CT-en PET-naar-contrast beelden aan voor visuele inspectie.
- Selecteer 3D ROI Tool in het vervolgkeuzemenu, klik op ROI toevoegen en noem het bestand de longen. Klik op segmentatie algoritmes | Wijk Thresholding. Definieer invoer als achtergrond en afbeelding als Ref. Voer min en Max volgens de muis Long dichtheidswaarden, meestal-800 en-300 hu. Inspecteer 3D-gesmolten longen door op het vtk -pictogram te klikken en het volume in de gegenereerde tabel op te halen door op het pictogram tabel weergevente klikken.
- Analyseer [18F] FDG opname in tumoren door maximale standaard opname waarden (SUVmax) te extraheren.
- Converteer huisdier beelden gekalibreerd in BQ/mL naar SUV door het selecteren van rekenkunde uit de drop-down menu, vervolgens scalair vermenigvuldigen en gebruik Inp1 als geselecteerd en scalair is BQ/ml naar SUV-factor berekend als volgt: SUV = (Bq/ml)/(geïnjecteerde dosis (Bq)/lichaams gewicht (g)).
- Selecteer 3D ROI Tool in het vervolgkeuzemenu, klik op ROI toevoegen en noem het bestand tumoren. Klik op de 3D-verf modus | Sphere. Schakel alleen 2Duit. Pas de grootte van de vorm en omringen de tumoren. Zorg er bijvoorbeeld voor dat u geen storende signalen uit het hart opneemt. Haal de SUVmax-waarde op in de tabel die wordt gegenereerd door te klikken op het pictogram tabel weergeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het H2052/484 orthotopic model
Orthotopic MPM modellen door intra-Thoracic injectie van gekweekte kankercellen, vooral H2052/484 cellen zijn relatief eenvoudig te installeren. De verschillende hierboven beschreven stappen vereisen alleen bescheiden kennis van de celcultuur en de chirurgische stappen zijn toegankelijk voor matig opgeleide dieren onderzoekers. Naakt muizen en cellen moeten onder steriele omstandigheden worden gemanipuleerd om de uitkomst van de implantaties te maximaliseren. Door het zorgvuldig volgen van dit protocol, waarbij korte anesthesie en minimale chirurgie, we ondervonden slechts 1 dood onder 266 muizen geïnjecteerd met verschillende MPM cellijnen. Geen pneumothorax of intra-pulmonaire implantaties van tumorcellen werden waargenomen onder deze 266 muizen zorgvuldig geïnjecteerd zoals beschreven. Specifiek, de orthotopic tumor ontwikkelingssnelheid van de H2052/484 cellijn is hoog sinds 93,8% van geïnjecteerde muizen tumoren ontwikkeld (n = 118). H2052/484 tumoren kunnen worden gedetecteerd door PET/CT Imaging vanaf 14 dagen na de injectie en de mediane duur van het experiment volgens onze eindpunt criteria was 31 dagen in een representatief experiment21. Zoals we beschreven in deze andere studie21, de tumoren werden gelokaliseerd in de thoracische Holte, vrij verspreid of bevestigd op de longen, de thoracische spieren, de aortaboog of de inferieure vena cava. Metastasen werden niet gevonden.
MPM monitoring door [18F] FDG-PET/CT Imaging
Orthotopic MPM werden wekelijks gemonitord door gecombineerde PET/CT-beeldvorming met de veelgebruikte radio Tracer [18F] FDG die zich ophoveert in zeer metabole tumoren. Longitudinale anatomische CT-scans lieten de impact van de MPM-ontwikkeling op de morfologie van de longen visualiseren. Automatische segmentatie van sterk contrasteerd longen op CT-scans is eenvoudig vanwege hun lage dichtheid in vergelijking met de omringende weefsels. 3D-weergaven geven een overzicht van de lokalisatie van tumoren en longitudinale hoeveelheden longen kunnen worden geëxtraheerd (Figuur 2A). Longvolumes metingen door CT daalden significant na een tijdje na MPM injectie van muizen met intrapleurale (IPL) H2052/484 tumoren (Figuur 2B). Inderdaad, MPM tumoren groeien in de pleuraholte en het creëren van druk op de longen, het verminderen van hun volumes. De correlatieanalyse toonde aan dat longvolumes omgekeerd gecorreleerd waren met het tijdstip van controle met een determinatiecoëfficiënt R2 van 0,8 (Figuur 2C). In totaal tonen deze gegevens de betrouwbaarheid van CT-scan om de ontwikkeling van dit MPM-model te monitoren.
In combinatie met CT biedt een [18F] FDG-PET-scan extra en waardevolle informatie over de metabole status van mpm-tumoren. Hoewel het soms ingewikkeld kan zijn om beelden van CT-en PET-scans zelf te interpreteren, vooral op vroege tijdstippen, geeft een combinatie van beide modaliteiten een verdere robuustheid voor de diagnose. Inderdaad, representatieve longitudinale [18F] FDG-PET/CT-bewaking uitgevoerd tussen 10 dagen en 44 dagen van een muis met IPL H2052/484 tumoren toont aan dat tumoren beginnen te worden onderscheiden 2 weken na het enten (Figuur 3a). Dit voorbeeld benadrukt de groei en [18F] FDG avidity van tumoren gelegen aan de periferie van de thoracische Holte en langs het hart grote schepen (witte pijlen). [18F] FDG opname in tumoren werd gekwantificeerd door het extraheren van SUVMax in Rois getekend over tumoren, met behulp van CT-scans, en toont significante tijdafhankelijke verhogingen van hun glucose metabolisme (Figuur 3B). De correlatie analyses toonden aan dat de SUVMax positief gecorreleerd was met het tijdstip van monitoring met een determinatiecoëfficiënt R2 van 0,7 (Figuur 3C). Deze gegevens tonen de betrouwbaarheid van [18F] FDG-PET scans om het lot van H2052/484 orthotopic tumoren te monitoren. Tot slot, longvolumes en [18F] FDG avidity, respectievelijk GEANALYSEERD door CT en pet, correleren met elkaar met een R2 van 0,6 ter ondersteuning van de sterkte van deze metingen te bestuderen mpm orthotopic tumoren ontwikkeling (Figuur 4).
Figuur 1: naakt muis orthotopic xenotransplantaatmodellen is model. A) intrapleural (IPL) injectie van humane mpm-cellen in de linkerpleura Holte, zoals beschreven in het protocol gedeelte. (B, C) Muizen worden geanesthetiseerd en geladen in het PET/CT-bed in een laminaire stroom afzuigkap en vervolgens overgebracht naar de scanner. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: tumor groei van het orthotopic H2052/484 MPM model bewaakt door CT. (A) representatieve 3D-RECONSTRUCTIES van CT-scans met H2052/484 mpm IPL-tumoren en hun effect op het longvolume (VP) op verschillende tijden in dagen na de implantatie. Witte pijlpunten tonen de locatie van MPM IPL-tumoren. B) viool perceel met een representatief tijdsverloop van de longvolumes (VL), n = 6. One-way ANOVA-test met de meervoudige vergelijkingen statistieken van Tukey worden aangegeven. Letters duiden op significante verschillen tussen modellen met a, b, c, d, e, f die respectievelijk D10, D16, D23, D29, D36 en D44 aanduiden. Overeenkomstige p-waarden: x, p < 0,05; XX, p < 0,01; xxx, p < 0,001; XXXX, p < 0,0001. C) correlatie tussen de afname van het longvolume gerelateerd aan IPL mpm-ontwikkeling en tijd na de injectie. Lineaire regressie wordt uitgezet als een dikke gekleurde lijn en gerelateerde SD als onderbroken zwarte lijnen. Grafieken en statistische analyses werden uitgevoerd met software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: tumor metabolisme van het ipl MPM-model, gevolgd door [18F] FDG-micropet/CT. (A) representatieve PET/CT-scans die mpm IPL-tumoren vertonen. PET/CT-beelden Toon trans-axiale sneetjes van de borst gebied met de [18F] FDG-Avid tumoren, met CT (grijs schaal) verstrekken van anatomische informatie en huisdier (gekalibreerd pseudo-kleur schaal) tonen de locatie en de intensiteit van hoge tumor en orgaan glucose gebruik. Dagen na de injectie worden aangegeven. CT: CT mediastinaal venster; [18F] FDG-PET/CT: gesmolten beeld van PET-en CT-scans. Witte pijlpunten tonen MPM IPL-tumoren. L = Long, H = hart, BAT = bruin vetweefsel. B) viool perceel met een representatieve tijdsduur van SUVMax gekoppeld aan het mpm-metabolisme, n = 6. One-way ANOVA-test met de meervoudige vergelijkingen statistieken van Tukey worden aangegeven. Letters duiden op significante verschillen tussen modellen met a, b, c, d, e, f die respectievelijk D10, D16, D23, D29, D36 en D44 aanduiden. Overeenkomstige p-waarden: x, p < 0,05; XX, p < 0,01; xxx, p < 0,001; XXXX, p < 0,0001. C) correlatie tussen de toename van SUVMax in IPL mpm-tumoren en tijd na de injectie. Lineaire regressie wordt uitgezet als een dikke gekleurde lijn en gerelateerde SD als onderbroken zwarte lijnen. Grafieken en statistische analyses werden uitgevoerd met software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: correlatie tussen MPM-ontwikkeling gevolgd door longvolume en metabole tumor activiteit. Correlatie tussen SUVMax en longvolume (VL) weergegeven als een lineaire regressie uitgezet als een dikke gekleurde lijn en gerelateerde SD als onderbroken zwarte lijnen. Grafieken en statistische analyses werden uitgevoerd met software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een origineel orthotopic model van MPM H2052/484 cellen geïnjecteerd in de pleuraholte van athymische muizen en een methode van monitoring door kleine dierlijke PET/CT Imaging. Dit model kan worden geïmplementeerd met matige dier handling en chirurgie vaardigheden en geeft een zeer goede ontwikkelingssnelheid. Het maakt een groot experimenteel venster van ongeveer 10 weken in onbehandelde muizen en niet-invasieve longitudinale detectie van tumoren al in 2 weken na de injectie mogelijk.
Orthotopic modellen vertrouwen op de implantatie van levende cellen of weefsels rechtstreeks in de oorspronkelijke omgeving van de tumor. Het belangrijkste verschil tussen veelgebruikte subcutane of intraperitoneale MPM-modellen en intrapleurale-modellen ligt in hun micro-omgeving. Inderdaad, de micro-omgeving van tumoren bevat meerdere stromale celtypen (fibroblasten, leukocyten, macrofagen) naast kankercellen25. Deze stromale cellen afscheiden groeifactoren en cytokines die bijdragen aan de tumor micro omgeving die de groei van de tumor moduleren. De tumor micro varieert met de anatomische plaats suggereert dat een orthotopic xenotransplantaatmodellen is zal ontwikkelen en anders reageren op een behandeling dan een subcutane één25. Daarom, als orthotopic xenotransplantaten zijn omgeven met een vergelijkbare micro-omgeving aan degene die bij mpm-patiënten, hun gedrag en reactie op de behandeling moet beter weerspiegelen de klinische situatie17,19.
Veel preklinische modellen in kankeronderzoek impliceren immunodeficiënte muizen om te zorgen voor menselijke xenotransplantaatmodellen is succes. Naakt muizen bezitten geen rijpe thymus en missen een vitaal onderdeel van tumor micro Environment26. Hoewel naakt muizen niet volwassen Thymus bezitten en bijgevolg tekort aan T-cellen, ze presenteren volwassen lymfocyten B, neutrofielen, monocyten en macrofagen in hun pleurale micro-omgeving in tegenstelling tot meer permissieve en zeer gebrekkige SCID muizen26. In de vroege stadia van de MPM-ontwikkeling hebben regelgevende T-cellen een belangrijke onderdrukkende rol. Echter, in meer gevorderde stadia, myeloïde cellen met inbegrip van neutrofielen en macrofagen vervangen Treg cellen; in deze functie is de onderdrukkende rol van regelgevende T-cellen alleen belangrijk in de vroege stadia van de mpm-ontwikkeling23,27. Hoewel studies met een volledige immuunrespons (bijv. immunotherapieën waarbij een T-respons is betrokken) niet kunnen worden bestudeerd in het hier gepresenteerde model, stellen we dat dit orthotopic model al het belang behoudt om nieuwe behandelingen of nieuwe diagnostische hulpmiddelen van MPM te beoordelen.
In methodologisch oogpunt zijn er kritische stappen om in gedachten te houden om de ontwikkeling van intrapleurale mpm-tumoren te maximaliseren. Voorafgaand aan het vaststellen van muizen modellen, hebben toegang tot exponentieel groeiende cellen (minder dan 80% confluentie, afhankelijk van de cellijnen) en tot 8 tot 10 maanden geacclimeerde muizen. Inderdaad, het injecteren van jongere kleine muizen is moeilijk en kan resulteren in ectopische injecties en verandering van overleving. Tijdens de implantatie procedure, moeten standaard chirurgie voorzorgsmaatregelen worden genomen, en stompe schaar moet worden gebruikt, vooral bij het gebeuren om bloeden te voorkomen, wat kan leiden tot de dood van dieren. De keuze van de spuit (bijv. het hier beschreven model) en het protocol dat hier wordt gepresenteerd, maken een nauwkeurige en voorzichtige injectie mogelijk van een klein volume medium dat tumorcellen bevat om te zorgen voor intrapleurale injectie (30 ° hoek, 2 – 3 mm diepte).
De longitudinale monitoring van orthotopic MPM-modellen kan alleen niet-invasief worden uitgevoerd door Imaging Technics. PET/CT is de geadviseerde methode in de klinische praktijk om mpm te diagnosticeren en is daarom gebruikt in deze studie20,21. In vergelijking met veelgebruikte optische beeldvorming omvat PET/CT-beeldvorming het gebruik van radioactieve verbindingen en is daarom meer gevoelig voor installatie vanwege de veiligheid, de logistiek van radiotracers en de kosten28. Niettemin, PET/CT beeldvorming is niet afhankelijk van genetische modificatie van tumorcellen en biedt hoge resolutie tomografische, anatomische en moleculaire informatie. Optische beeldvorming is ook sneller dan PET/CT, maar het imaging systeem dat in dit artikel wordt gepresenteerd, omvat een 3-muizen bed en ongeveer 20 muizen kunnen per dag worden gescand, wat een redelijke doorvoer is gezien de verzamelde informatie. Het gebruik van de maximaal beschikbare klinische radio Tracer [18F] FDG rechtvaardigt een hoge translatie kracht voor onderzoek uitgevoerd met deze techniek29. Hoewel [18F] FDG-PET scan lezingen en analyses enige ervaring kunnen vereisen vanwege de hoge opname in het omringende hart en bruin vetweefsel, de combinatie met CT verfis de diagnose. Tijdens [18f] FDG PET/CT-experimenten, vasten en verwarmende muizen en het uitvoeren van een opnametijd van [18f] FDG van 1 uur kan de visualisatie van tumoren aanzienlijk verbeteren, aangezien scan omstandigheden een hoge impact hebben op Pet-contrasten zoals al beschreven24. Verdere studies over preklinische orthothematisch modellen met andere klinisch gebruikte radiotracers als [18f] Fluorothymidine (flt) of [18f] Fluoromisonidazol (fmiso), die respectievelijk de proliferatie en hypoxie controleert, kunnen meer informatie verschaffen over dergelijke betrouwbare orthotopic mpm-modellen29.
Tot slot is dit relevante translationeel model in combinatie met niet-invasieve beeldvorming perfect in lijn met het 3R-concept: reduce het aantal dieren, rgegevens om pijn en ongemak te verlichten en dierproeven met alternatieven22te verminderen. Binnen dezelfde reeks dieren kunnen therapeutische follow-up en respons niet-invasief worden gecontroleerd, waardoor longitudinale metingen gedurende de experimenten mogelijk worden, waardoor het aantal dieren dat per experiment nodig is, wordt verminderd. Bovendien, aangezien elk dier zijn eigen controle over de tijd vertegenwoordigt, verhoogt niet-invasieve beeldvorming ook een sterk statistisch vermogen om het aantal benodigde dieren te verminderen om betrouwbare gegevens16te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Ligue Genevoise contre le Cancer (naar V.S.-B.) en door het centrum voor biomedische beeldvorming (CIBM) van de universiteiten en ziekenhuizen van Genève en Lausanne (naar D.J.C., O.B. en S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mice bed | Minerve | bed for mice imaging | |
| Athymic Nude-Foxn1n nu/nu | Envigo, Huntingdon, UK | 6907F | immunodeficient mouse |
| Betadine | Mundipharma Medical Company, CH | 111131 | polyvidone iodine solution |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 14190094 | Buffer for cell culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Pasching, Austria | A15-101 | cell culture medium supplement |
| Insulin syringes | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 324826 | syringe for cell injection |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122 | antibiotics for cell culture medium |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 61870010 | basal cell culture medium |
| Temgesic (Buprenorphin 0.3 mg/mL) | Alloga SA, CH | 700320 | opioid analgesic product |
| Triumph PET/SPECT/CT | Trifoil, Chatsworth, CA, USA | imaging equipment | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 25050014 | enzymatic cell dissociation buffer |
| Virkon S 2% | Milian, Vernier, CH | 972472 | disinfectant |
| Vivoquant | Invicro, Boston, MA, USA |
References
- Grishman, E., Cohen, S., Salomon, M. I., Churg, J. Renal lesions in acute rheumatic fever. The American Journal of Pathology. 51 (6), 1045-1061 (1967).
- Mossman, B. T., Gee, J. B.
- Pass, H. I., et al. Asbestos exposure, pleural mesothelioma, and serum osteopontin levels. The New England Journal of Medicine. 353 (15), 1564-1573 (2005).
- Allen, L. P., Baez, J., Stern, M. E. C., Takahashi, K., George, F. Trends and the Economic Effect of Asbestos Bans and Decline in Asbestos Consumption and Production Worldwide. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (3), (2018).
- LaDou, J., et al. The case for a global ban on asbestos. Environmental Health Perspectives. 118 (7), 897-901 (2010).
- Soeberg, M., Vallance, D. A., Keena, V., Takahashi, K., Leigh, J. Australia's Ongoing Legacy of Asbestos: Significant Challenges Remain Even after the Complete Banning of Asbestos Almost Fifteen Years Ago. The Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (2), (2018).
- Glynn, M. E., Keeton, K. A., Gaffney, S. H., Sahmel, J. Ambient Asbestos Fiber Concentrations and Long-Term Trends in Pleural Mesothelioma Incidence between Urban and Rural Areas in the United States (1973-2012). Risk Analysis. 38 (3), 454-471 (2018).
- Zhao, J., et al. Epidemiology and trend analysis on malignant mesothelioma in China. The Chinese Journal of Cancer Research. 29 (4), 361-368 (2017).
- Chernova, T., et al. Long-Fiber Carbon Nanotubes Replicate Asbestos-Induced Mesothelioma with Disruption of the Tumor Suppressor Gene Cdkn2a (Ink4a/Arf). Current Biology. 27 (21), 3302-3314 (2017).
- Fukushima, S., et al. Carcinogenicity of multi-walled carbon nanotubes: challenging issue on hazard assessment. The Journal of Occupational Health. 60 (1), 10-30 (2018).
- Robinson, B. W., Musk, A. W., Lake, R. A.
- Ricciardi, S., et al. Surgery for malignant pleural mesothelioma: an international guidelines review. The Journal of Thoracic Diseases. 10, Suppl 2 285-292 (2018).
- Hiddinga, B. I., Rolfo, C., van Meerbeeck, J. P. Mesothelioma treatment: Are we on target? A review. The Journal of Advanced Research. 6 (3), 319-330 (2015).
- Kim, J., Bhagwandin, S., Labow, D. M. Malignant peritoneal mesothelioma: a review. Annals of Translational Medicine. 5 (11), 236 (2017).
- Ampollini, L., et al. Immuno-chemotherapy reduces recurrence of malignant pleural mesothelioma: an experimental setting. The European Journal of Cardiothoracic Surgery. 35 (3), 457-462 (2009).
- de Jong, M., Essers, J., van Weerden, W. M. Imaging preclinical tumour models: improving translational power. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 481-493 (2014).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. The American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8 (1), 2886 (2018).
- Gengenbacher, N., Singhal, M., Augustin, H. G. Preclinical mouse solid tumour models: status quo, challenges and perspectives. Nature Reviews Cancer. 17 (12), 751-765 (2017).
- Kanemura, S., et al. Metabolic response assessment with 18F-FDG-PET/CT is superior to modified RECIST for the evaluation of response to platinum-based doublet chemotherapy in malignant pleural mesothelioma. The European Journal of Radiology. 86, 92-98 (2017).
- Truong, M. T., Viswanathan, C., Godoy, M. B., Carter, B. W., Marom, E. M. Malignant pleural mesothelioma: role of CT, MRI, and PET/CT in staging evaluation and treatment considerations. Seminars in Roentgenology. 48 (4), 323-334 (2013).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: a contemporary approach to replacement, reduction and refinement. The British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Colin, D. J., et al. Experimental Model of Human Malignant Mesothelioma in Athymic Mice. The International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. The Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- Devaud, C., et al. Tissues in different anatomical sites can sculpt and vary the tumor microenvironment to affect responses to therapy. Molecular Therapy. 22 (1), 18-27 (2014).
- Belizário, J. E. Immunodeficient mouse models: An overview. The Open Immunology Journal. 2, 79-85 (2009).
- Jackaman, C., Yeoh, T. L., Acuil, M. L., Gardner, J. K., Nelson, D. J. Murine mesothelioma induces locally-proliferating IL-10(+)TNF-alpha(+)CD206(-)CX3CR1(+) M3 macrophages that can be selectively depleted by chemotherapy or immunotherapy. Oncoimmunology. 5 (6), 1173299 (2016).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A molecular imaging primer: modalities, imaging agents, and applications. Physiological Reviews. 92 (2), 897-965 (2012).
- Kenny, L. M., Aboagye, E. O. Clinical translation of molecular imaging agents used in PET studies of cancer. Advances in Cancer Research. 124, 329-374 (2014).
