Summary
פרוטוקול זה נועד לתאר צעד אחר צעד את הטכניקה של מיצוי והערכה של תפקוד הלב באמצעות cardiomyocytes עור. מתודולוגיה זו מאפשרת מדידה ואימודולציה חריפה של תפקוד myofilament באמצעות ביופסיות קפואות קטנות שניתן לאסוף ממקומות לב שונים, מעכברים לגברים.
Abstract
במאמר זה, אנו מתארים את הצעדים הנדרשים כדי לבודד קרדיומיוציט מחלחל יחיד ("עור") ולצרף אותו למנגן מדידת כוח ומנוע לבצע מחקרים פונקציונליים. מחקרים אלה יאפשרו מדידה של נוקשות קרדיומיוציט (כוח פסיבי) והפעלתו עם פתרונות שונים המכילים סידן (Ca2+) המכילים פתרונות כדי לקבוע, בין היתר: פיתוח כוח מקסימלי, myofilament Ca2 +רגישות (pCa50),שיתוף פעולה (nHill) ואת קצב פיתוח כוח (ktr). שיטה זו מאפשרת גם קביעת ההשפעות של תרופות הפועלות ישירות על myofilaments ועל הביטוי של חלבונים רקומביננטי אקסוגניים על תכונות אקטיביות ופסיביות של קרדיומיוציטים. קלינית, מחקרים קרדיומיוציטיים עור להדגיש את הפתופיזיולוגיה של מחלות שריר הלב רבות ולאפשר הערכה במבחנה של ההשפעה של התערבויות טיפוליות מיקוד myofilaments. בסך הכל, טכניקה זו מאפשרת בירור של פתופיזיולוגיה לבבית על ידי חקירת מתאמים בין פרמטרים במבחנה ו- in vivo במודלים של בעלי חיים ורקמות אנושיות המתקבלות במהלך ניתוח לב פתוח או השתלה.
Introduction
באופן מסורתי, הערכה של תכונות מכניות שריר הלב נוסתה בעיקר בהכנות רב תאיות, כגון שרירי papillary ו trabeculae1,2. רצועות שרירי לב רב תאיים כוללות אוכלוסייה הטרוגנית של תאים, כולל קרדיומיוציטים מתכווצים עם דפוס לא ידוע של אוריינטציה ודור כוח, פעילות חשמלית והפצת מתח / זן, כמו גם מטריצת רקמת חיבורמקיפה 3,4. הכנה ללא קולגן ומכילה קרדיומיוציט יחיד תאפשר מדידה של אורך סרקומר ומאפיינים מתכווץ חוצה גשר בצורה מדויקת ומבוקרתמאוד 5,6. לכן, במהלך ארבעת העשורים האחרונים, פותחו מספר מתודולוגיות המאפשרות לחקור את המאפיינים המכניים, מתכווצים והרפיה של קרדיומיוציטיחיד 6,7. הפונקציה מתכווצה של תאים אלה תלויה מאוד באורך סרקומר וקינטיקה רכיבה על אופניים חוצהגשרים 3. לכן, רצוי לחקור את תפקוד השריר ישירות בתאי לב בודדים בודדים, בהתחשב בכך שהוא מאפשר הערכת אורך וביצועים sarcomere, כמו גם תפקוד חוצה גשר ומאפיינים מתכווץ. עם זאת, בידוד והצמדת cardiomyocytes פונקציונלי עם רזולוציה sarcomere אופטי סביר תוך הקלטת מדידת כוח ברמת μN הוא עדיין מאתגרומתפתח 3,6. אתגרים נוספים הם הלוגיסטיקה שיש להתקין כדי לבודד קרדיומיוציטים מהביופסיות שנאספו לאחרונה. הבלתי צפוי של איסוף ביופסיות אנושיות, למשל, עלול לסכן את ההיתכנות של הניסויים.
יתר על כן, חששות אתיים לגבי החלפה, הפחתה ועידון של ניסויים בבעלי חיים עבור הליכים מדעיים (עקרונות של 3Rs) קידמו שינויים במחקר ברמה התאית והרקמות, רצוי בביופסיות אנושיות, או בדגימות קטנות יותר של בעלי חיים. אכן עידון פרוגרסיבי של מתודולוגיות להערכת תפקוד הלב במבחנה ברמה קטנה יותר של מורכבות מאפשר אינטגרציה נכונה של התוצאות לגוף כולו ולתרגם אותן לתרחיש הקליני7. בסך הכל, באמצעות דגימות המאוחסנות ב -80 °C (69 °F) כדי לחלץ קרדיומיוציטים עשוי להיות חלופה מושכת.
רקמת שריר הלב נחתכת לחתיכות קטנות והומוגנית עם מרגמה ועלי. התוצאה של הומוגניזציה זו היא השעיה של תאים ארוזים ומבודדים עור בדרגות שונות של נזק סרקולם, שבו קוצר ראייה חשוף למדיום הרחצה וכל הרכיבים התאיים נשטפים החוצה. מבנים כגון myofibrils כי הם רחוקים יותר מן הסרקולמה נשמרים. לכן, סרקומר קיצור ומאפיינים פונקציונליים הקשורים מנגנון myofibrillar נשמרים שלמים ניתןתועד 8,9.
מערכת מדידת הכוח הקרדיומיוציטים מורכבת ממונע אלקטרומגנטי, המשמש להתאמת אורך קרדיומיוציטים, ומתמר כוח, המודד התכווצות אירוביומיוציטים איזומטרית. קרדיומיוציט מחלחל, או עור, ממוקם בתא ניסיוני המכיל פתרון מרגיע ([Ca2+] < 10 nM) וסיליקון מודבק ל 2 מחטים דקות: אחד מחובר למנוע והשני מתמר הכוח. מערכת אופטית משמשת לקביעת מורפולוגיה קרדיומיוציט ואורך סרקומר. הפרוטוקול הניסיוני מורכב לעתים קרובות מסדרה של הקלטות כוח על פתרונותחיץ המכילים ריכוזים שונים של Ca 2+ , קביעת קינטיקה חוצת גשרים של Actin-myosin ומדידת המתח הפסיבי של הקרדיומיוציטים המותקנים באורכים מוגדרים מראש של סרקומר (איור 1). בידוד של קרדיומיוציטים מחלחלים מדגימות שריר הלב המוקפאות בחנקן נוזלי (ולאחר מכן מאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס) היא טכניקה המנצלת מכניקה תאית וביוכימיה שלחלבונים למדידת כוח קה 2+-מופעל (פעיל) לכל אזור חתך (Tפעיל, kN∙m-2 ), Ca2+-עצמאי (פסיבי) מתח (Tפסיבי,kN∙m-2),myofilaments Ca2 +רגישות (pCa50),שיתוף פעולה myofilaments (nHill), שיעור פיתוח כוח מחדש (ktr) כמו גם תלות באורך sarcomere של Tפעיל,Tפסיבי , pCa50, nHill ו ktr.
מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש ולסכם את הפוטנציאל של מערכת מדידת כוח cardiomyocyte כהליך אמין כדי להעריך את המאפיינים המכניים הפונקציונליים של קרדיומיוציטים עור יחיד מבודד מדגימות קפואות ממינים שונים.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים תואמים את המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה (NIH פרסום מס ' 85-23, תוקן 2011) ואת החוק הפורטוגלי לרווחת בעלי חיים (DL 129/92, DL 197/96; עמ' 1131/97). הרשויות המקומיות המוסמכות אישרו פרוטוקול ניסיוני זה (018833).
1. הכנת פתרון מלאי (טבלה 1)
- הכינו 1,000 מ"ל של פתרון מרגיע לבידוד קרדיומיוציטים (RELAX-ISO) על ידי ביצוע ההוראות בטבלה 2. ממיסים את הריאה לעיל ב-≈500 מ"ל ומתאימה את ה-pH ל-7.0 עם KOH. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 1000 מ"ל.
- יש להפיץ את RELAX-ISO בצינורות של 50 מ"ל. יש לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.
- הכן 250 מ"ל של פתרון הפעלה על ידי ביצוע ההוראות בטבלה 3. ממיסים את הראוגנטים לעיל ≈100 מ"ל של מים טהורים במיוחד. כוונן את ה- pH ל- 7.1 עם 5 M KOH ב- 15 °C (60 °F).
הערה: בדרך כלל, יש צורך להוסיף כמות משמעותית של KOH כדי להגיע pH הרצוי. שים את הבלון נפחי בתיבה עם קרח כדי לקרר את הפתרון ל 15 °C (60 °F).- כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 250 מ"ל. להתסיס את הפתרון הזה ברציפות עם מערבל מגנטי עד לרגע של ערבוב זה עם הפתרון מרגיע.
- הכן 100 מ"ל של פתרון מרגיע על ידי ביצוע ההוראות בטבלה 4. ממיסים את הראוגנטים לעיל ≈50 מ"ל של מים טהורים במיוחד. כוונן את ה-pH ל-7.1 עם KOH 5 M ב-15°C.
הערה: בדרך כלל, יש צורך להוסיף כמות משמעותית של KOH כדי להגיע pH של 7.1. מניחים את הבלון הנפחי בקופסה מלאה בקרח כדי לקרר את הפתרון ל-15 מעלות צלזיוס. החוזק היוני של הפתרונות ששימשו במהלך המדידות הסתכם ב-180 מ"מ.- כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 100 מ"ל. להתסיס פתרון זה ברציפות עם מערבל מגנטי עד לרגע של ערבוב אותו עם פתרון הפעלה.
- ערבבו פתרונות הפעלה ומרגיעה בפרופורציות המוצגות בטבלה 5 כדי להשיג פתרונות pCa בין 5.0 ל-6.0.
- תמיד לשמור על מנוחה והפעלה של פתרונות נסער תוך ערבוב שניהם.
- Aliquot כל תערובת ל 2 mL microtubes. אחסן את כל המיקרו-צינורות ב-20 מעלות צלזיוס.
- הכן אצווה שונה של פתרון pCa (4.5 עד 6.0) עבור כל פרוטוקול.
2. כיול מתמר הכוח
הערה: הכיול של מתמר הכוח הוא הליך שגרתי שיש לבצע כל כמה חודשים או בכל פעם שהוא חשוד להיות בלתי מכויל. מתמר הכוח רגיש מאוד ונשבר בקלות. זה צריך להיות מטופל בעדינות בכל שלב של השימוש בו, כולל כיול, הדבקה של cardiomyocyte וניקוי.
- נתק את מתמר הכוח משאר המנגנון.
- בעזרת מהדק, מניחים את מתמר הכוח אופקית באופן כזה המחט מצביעה כלפי מטה באותו כיוון כי cardiomyocyte יפתח כוח. זה יקל על תליית סדרה של גושים עם משקולות ידועות (רצועה אלסטית, תפר או סיכה).
הערה: בדוק את המאפיינים של מתמר הכוח לפני שתמשיך לשלב זה כדי לבדוק את גורם קנה המידה [מ"ג / וולט] ולהימנע ממשקל עודף על מתמר. עבור מודל מתמר כוח, גורם קנה המידה הוא 50 (50 מ"ג מתאים 1 וולט) ואנחנו משתמשים 5 משקולות בין 12.5 ל 250 מ"ג. - הפעל את מתמר הכוח ולתת לו להתחמם במשך 30 דקות.
- התחל בתליית המסה הקלה יותר על מתמר הכוח ורישום המתח המתאים הנמדד ב- FORCE OUT.
- חזור על הליך זה עד חמישה משקלים.
- כוח העלילה המוחל על מתמר הכוח (עומס) לעומת מתח ולבדוק ליניאריות.
- אם אין ליניאריות, להתאים את האפס ולהשיג potentiometers בלוח המעגל של מתמר. עיין בהוראה הספציפית שלו לקבלת מידע נוסף.
- סובבו את האפס פוטנציומטר עד שמתח היציאה יהיה 0.0 V.
- יד משקל בינוני על מחט המתמר ולהתאים את potentiometer רווח לקרוא את המתח המתאים (למשל, 50 מ"ג מתאים 1 V). הסר את המשקל ולהתאים מחדש את האפס potentiometer ל 0.0.
- חזור על שלב 2.6.2 עד שהפלט עם וללא המשקל יהיה נכון.
- הר מתמר הכוח בחזרה לתוך המנגנון.
3. הגדרת המנגנון הניסיוני
- להפשיר בקבוקון אחד של כל אחד מההפעלה, 4.5, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 ופתרונות מרגיעים ולשמור אותם על קרח.
הערה: ATP ו- PCr הם תרכובות labile כי צריך להישמר בטמפרטורות קרות. - הכן את המיקרוסקופ, את מנגנון הבדיקה ואת המחשב המשויך לשימוש (איור 1).
- התאם את הטמפרטורה כך המדחום בתא קורא 15 °C (60 °F). בצע את כל הניסויים בטמפרטורה זו למעט דגירה קינאז ופוספטאז (20 °C (60 °F).
- הפעל את מתמר הכוח ואת המנוע.
4. מיצוי וחלחלה של קרדיומיוציטים עור
- להפשירו 50 מ"ל של פתרון RELAX-ISO.
- הפעל את הצנטריפוגה ומהר לקרר אותו עד 4 °C (60 °F).
- הפשר 3-5 מיקרוגרם של דגימת שריר הלב בצלחת פטרי המכילה 2.5 מ"ל של פתרון RELAX-ISO.
- חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות עם להב אזמל (איור 2). חותכים את המדגם בצורה מדויקת כדי למנוע נזק לתאים מיותרים.
- העבר את 2.5 מ"ל של פתרון RELAX-ISO עם הרקמה לזכוכית פוטר-Elvehjem באמצעות קצה פיפטה לחתוך.
- לשבש מכנית את הרקמה עם מטחנה במהירות סיבוב של 30-40 סל"ד. לחץ על הרקמה 3 פעמים עבור 2 s כל אחד כדי לקבל השעיה תא טוב.
- הכן 10% טריטון ב פתרון RELAX-ISO (250 μL של טריטון עם 2.25 מ"ל של RELAX-ISO) בצינור 15 מ"ל ולהוסיף פתרון זה ההשעיה התא.
- מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור 3 פעמים.
- דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות ו 4 דקות על קרח.
- לשטוף את טריטון על ידי הוספת RELAX-ISO עד החלק העליון של צינור 15 מ"ל; ערבוב עדין (היפוך 3 פעמים את הצינור) ולבסוף מסתובב במורד התאים בצנטריפוגה זוויתית (1 דקות ב 348 x גרם). הסר את supernatant עד 3 מ"ל מעל גלולת התא.
הערה: הסר את העל-טבעי בעדינות כדי למנוע הפרעה לכדור התא. עדיין, חלק מהתאים ב"על-טבעי" יאבדו באופן בלתי נמנע. - חזור על השלב 4.10 לפחות 4 פעמים או עד שלא נצפו בועות נוספות המיוצרות על ידי שאריות טריטון.
הערה: ככל שנעשים יותר צעדי שטיפה, כך תאים רבים יותר הולכים לאיבוד עם העל-טבעי שנזרק. - בסחף האחרון, להסיר את supernatant עד נפח של 5-10 מ"ל של השעיית תא.
5. בחירה והדבקה של קרדיומיוציט עור
- שים טיפת מתלה תא על כיסוי מעל מגלשת זכוכית במחזיק השקופיות של המיקרוסקופ (איור 1).
- בחר קרדיומיוציט בצורת מוט יחיד עם תבנית וגודל טובים של סטריאנס (איור 2).
- מצא את קצות המחט של מתמר הכוח ואת המנוע באמצעות ההגדלה הנמוכה ביותר של המיקרוסקופ ההפוך.
- סובב את הכיסוי כדי למקם את הקרדיומיוציט שנבחר אופקית כך שקצוותיו מיושרים עם המחט של מתמר הכוח והמנוע (איור 2).
- מניחים קו דק של דבק בצד הכיסוי בעזרת קצה ספוגית ( איור2).
- לטבול את קצות המחט של מתמר הכוח ואת המנוע לתוך קו הדבק כדי ליצור הילה דבק סביב שני הטיפים.
הערה: שלבים 5.6 - 5.10 מושגים באמצעות שימוש זהיר במיקרו-מפוזיציות ממונעות. - הזז במהירות את קצות המחט קרוב למישור המוקד של הקרדיומיוציט.
- הזז את קצה המחט של מתמר הכוח כלפי מטה כך שהוא מודבק לקצה אחד של cardiomyocyte.
- חזור על הליך זה עם קצה המנוע ואת הקצה האחר של התא.
הערה: הליך זה חייב להימשך פחות מ 2-3 דקות כמו הדבק מתחיל לרפא מהר מאוד. - לאחר 5-8 דקות, להרים את המחטים ≈ 15 מיקרומטר כדי למנוע הדבקה של התא לכיסוי. זה נעשה על ידי הזזת שני המיקרומניפולטורים בו זמנית.
- תן לדבק לרפא. הליך זה יכול להימשך בין 15 ל 45 דקות, בהתאם לסוג הדבק. במקרה שלנו, cardiomyocyte מודבק כראוי לאחר ≈15 דקות.
6. מדידות כוח הקלטה של רגישות אקטיבית, פסיבית ו- Ca2+
- מלאו את באר הניסוי הראשונה בתתא המרגיע (55-100 μL במנגנוני הניסוי) ובבאר הניסוי השנייה עם פתרון הפעלה.
- באמצעות תוכנת המצלמה, למקם את האזור של עניין (ROI) באזור של cardiomyocyte עם דפוס ברור של סחיטה.
הערה: עבור מיוציטים לב, אורך sarcomere ההפעלה משתנה בין 1.8 ו 2.2 מיקרומטר, ואת אורך sarcomere אופטימלי הוא סביב 2.15 מיקרומטר. - למדוד את המרחק בין שני הקצוות של cardiomyocyte (מן המנוע כדי הילה דבק מתמר, איור 3) לאחר אורך sarcomere אופטימלי נקבע (2.2 מיקרומטר). רשום את הערך כאורך מיוציט בתוכנה.
- למדוד רוחב ועומק cardiomyocyte, האחרון בעזרת מראה פריזמה להציב בניצב לתא.
הערה: יידרש מקור אור חיצוני רב עוצמה כדי לדמיין את התא דרך הפריזמה. במקרה שאין מנסרה, ובהנחה שלתאי לב יש צורה אליפטית, ניתן להסיק עומק קרדיומיוציט כ-70% מרוחב הקרדיומיוציט. - לחשב אזור חתך רוחב (CSA,מ"מ 2) בהנחה צורה אליפטית של cardiomyocyte.
- הזז בעדינות את שלב המיקרוסקופ כך שהתא יעבור מהכיסוי אל הבאר המכילה פתרון מרגיע בחלק האחורי של הבמה.
הערה: הליך זה עלול לגרום נזק קל לתא. לפני הזזת התא, בעדינות להזיז את המחטים קצת יותר. הימנע מהסרת התא מהפתרון. - בחר את הפרוטוקול בתוכנה המכילה קיצור שני תאים (80% מהאורך הראשוני שלו), שיתרחש כאשר התא יופיע בפתרון Ca2+ ובפתרון מרגיע, בהתאמה (איור 1, קובץ משלים).
הערה: "מרווח" ראשון של התא יתבצע בתוך פתרון ההפעלה ואת השני "סלאק" בתוך פתרון מרגיע. על-ידי ביצוע פעולה זו, המשתמש יוכל לחשב את הכוח הכולל (Ftotal) של התא מה- 1st ואת הכוח הפסיבי (Fpassive)של התא מה-2nd. השתמש בנוסחה כדי לחשב כוח פעיל, Fפעיל =סכום F - Fפסיבי. התא מקוצר ב-80% כדי לנתק את כל כוח השיא של הגשרים הצולבים. - התכווצות איזומטרית Elicit על ידי הזזת שלב המיקרוסקופ כך cardiomyocyte נע מן מרגיע לפתרון ההפעלה (pCa = 4.5(1)).
הערה: אם התא מתפקד, הוא יתכווץ באופן מיידי. - עם הגעתם למישור הכוח, התחילו להקליט את נתוני הכוח.
הערה: ניתן לבצע את הבדיקות בנפרד. בהתאם לתוכנה קיימת אפשרות ליצור רצף של בדיקות שיתאימו לפתרונות Ca2+ השונים בתוך פרוטוקול Ca2+רגישות (איור 1, קובץ משלים). - המתן ~ 10 s ולאחר מכן החלף את התא שקוע בפתרון ההפעלה.
הערה: חשוב לחכות 10 שניות לפני טבילת התא בפתרון מרגיע. אם התא מועבר מוקדם מדי, נתונים חשובים לחישוב כוח הפיתוח מחדש של התא (ערך ktr) עלולים ללכת לאיבוד. - הזיזו במהירות את הבמה כך שהקרדיומיוציט יטבול בתסרון המרגיע.
- המתן עד שהבדיקה תיפסק.
- חזור על שלבים 6.8 - 6.12 כך שהתא יופעל פעמיים בתתא ההפעלה (pCa=4.5(2)).
הערה: בדרך כלל, לאחר ההפעלה הראשונה, קצוות cardiomyocyte יכול להתנתק מעט מן קצות המחט, שינוי אורך cardiomyocyte, CSA ו / או אורך sarcomere. הסתגלו מחדש לאורך הסרקומר הרצוי והכניסו את הממדים המותקנים בתוכנה.- המשך לשלב 6.13.2 עבור Ca2 + פרוטוקול רגישות או לשמור את הנתונים, אם ערכים של כוח פסיבי ופעיל של התא הם הפרמטרים היחידים הדרושים ולנתק את התא ממחטים ולנקות אותם עם אצטון כדי להסיר את הדבק.
- כוונן את אורך הסרקומר של התא ל- 2.2 מיקרומטר על-ידי מתיחה קלה שוב, במידת הצורך.
- החלף את פתרון ההפעלה על ידי הפתרון הבא Ca2+ (55-100 μL כאן). חזור על שלבים 6.8 - 6.12.
- החלף את פתרון ההפעלה בפתרון Ca2+ הבא (55-100 μL כאן) וחזור על שלבים 6.8 - 6.12 עד שכל הפתרונות ייבדקו (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0).
- לבסוף, הפעל מחדש את התא עם פתרון הפעלה (pCa4.5(3)). חזור על שלבים 6.8- 6.12.
7. דגירה עם קינאזות ופוספטאזות
- לאחר ביצוע פרוטוקול הבסיס שנבחר, לדלל את קינאז / phosphatase בתסרון מרגיע בריכוז המומלץ.
הערה: מומלץ לבצע עקומת תגובת מינון לפני הניסוי. - הגדר את הטמפרטורה של בארות הניסוי ל 20 °C (60 °F).
- מלאו את בארות הניסוי בקינאז/פוספטאז, פתרון מרגיע ופתרון הפעלה (55-100 מיקרו-ל"ל).
- הזיזו בעדינות את שלב המיקרוסקופ כך שהתא יהיה שקוע באר המכילה קינאז/פוספטאז.
- דגירה cardiomyocyte עם קינאז / פוספטאז לפחות 30 דקות או על פי הוראות היצרנים.
- חזור על פרוטוקול הבסיס שנבחר.
8. תם את הניסוי
- בטל הדבק את cardiomyocyte מן קצות מתמר כוח מנוע על ידי מתיחת התא.
- בזהירות להסיר את הילה דבק מן קצות המחט באמצעות ספוג כותנה ספוג אצטון.
- כבה את הציוד.
9. ניתוח הנתונים
- לאסוף את כל הקבצים מכל cardiomyocyte נבדק.
הערה: כל בדיקה תתאים לקובץ אחד. משמעות הדבר היא כי עבור כל Ca2 + פתרון או אורך sarcomere, יהיה קובץ מתאים. - לחשב כוחות פעילים ופסיביים של קרדיומיוציט יחיד.
- פתח את הקובץ המתאים להפעלה הראשונה (pCa=4.5(1)) באמצעות גיליון אלקטרוני (איור 3A, נספח א' בקובץ משלים).
הערה: השתמשנו בתוכנית מותאמת אישית כדי לבצע את הניתוח. נא ראה נספח א' בקובץ המשלים. - ממוצע ≈60 ערכים לפני הממוצע ≈60 לאחר המרווח 1st של התא (כאשר התא שקוע בפתרון Ca2+ ). שני ערכים אלה תואמים ל- a ו- b, בהתאמה.
- חזור על אותו ניתוח עבורהמרווח השני של התא (כאשר התא שקוע בפתרון מרגיע). שני ערכים אלה תואמים ל- c ו- d, בהתאמה.
- חישוב ההפרש בין a ל- b (כוח כולל, סכוםF).
- חשב את ההפרש בין c ל- d (כוח פסיבי, Fפסיבי).
- לחשב כוח פעיל, Fפעיל = Fסה"כ - Fפסיבי.
- לנרמל את כל ערכי הכוח ל- CSA (ראה נוסחה לעיל) כדי להשיג את המתח הכולל (Ttotal), מתח פסיבי (Tפסיבי) ומתח אקטיבי (Tפעיל).
- חזור על שלב 9.2.1 עד 9.2.5 עבור ההפעלההשנייה (pCa=4.5(2)).
- שקול ערכים אלה כמו אלההמייצגיםT סה"כ , Tפעיל ו T פסיבי של cardiomyocyte תחת ניתוח.
הערה: ההפעלה הראשונה של התא עם pCa4.5(1) קשורה בדרך כלל לשינויים בממדי התא. מסיבה זו, ההפעלה השנייה עם pCa4.5 מדויקת יותר והיא זו שיש להשתמש בה. - חזור על השלבים 9.2.1 עד 9.2.5 עבור כל קובץ/pCa פתרונות שנבדקו (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- פתח את הקובץ המתאים להפעלה הראשונה (pCa=4.5(1)) באמצעות גיליון אלקטרוני (איור 3A, נספח א' בקובץ משלים).
- לחשב pCa50 ו nהיל של קרדיומיוציט יחיד.
הערה: עבור ניתוח זה, השתמש בערכים הפעילים F שאינםמנורמלים מהקבצים 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 ו- 4.5(3).- מקם בקובץ גיליון אלקטרוני את כל הערכים הלאמנורמלים של F הפעילים עבור כל פתרון Ca2+ שנבדק (4.5(2),5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
- חשב את מ פקטור התיקון = Fפעיל [4.5(2)] - Fפעיל [4.5(3)] / 7.
- חשב את הערכים מתוקנים של Fפעיל עבור כל Ca2+ פתרונות (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0) על-ידי חיסור Fפעיל - גורם תיקון.
- חשב את הכוח היחסי (Fיחסית) עבורכל פתרונות Ca2+ על-ידי נרמול כלערך פעיל F לפי הערך הנכון.
הערה: יחסי F [4.5(3)] צריכים להיות שווים 1. כל פרוטוקול ניסיוני מתחיל ומסתיים בהפעלת בקרה בריכוז Ca2+ רווי (pCa 4.5(2) ו- 4.5(3)). זה מאפשר נורמליזציה כוח והערכה של ההיסוף של ההכנות באמצעות השוואת שינויים כוח מקסים Ca2 +מופעל (Fמקסימום). אם בסוף הפרוטוקול הניסיוני, cardiomyocyte מייצר פחות מ 70% לפחות של הכוח המרבי של ההתכווצות הראשונה, תא / מדידה זה צריך להיות נשלל מהניתוח. - השתמש ביחס Fובערכי ה- pCa המתאימים כדי להתאים לעקומה סיגמואידית עם המשוואה הבאה F(Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill).
- ערכי pCa ו- nHill מהמשוואה שהוזכרו לעיל.
- חשב את קצב פיתוח הכוח (ktr) של קרדיומיוציט יחיד.
- בצע התאמה לעקומה התואמת לערכים מיד לאחר מרווח התאים של1 st.
- חשב את השיפוע של העקומה וערך זה יתאים לקצב פיתוח הכוח.
- חזור על שלבים 9.4.1 ו- 9.4.2 עבור כל פתרון Ca2+ .
הערה: התאמה עקומה ירודה תושג עבור Ca-solutions הנמוך ביותר (R בריבוע≤0.90).
Representative Results
קרדיומיוציטים פונקציונליים מחלחלים צריכים להיראות אחידים עם דפוס סטריאציה עקבי לאורך כל הניסוי. למרות דרגה מסוימת של הידרדרות וירידה בכוח צפוי לאחר ניסויים ממושכים, הערכים של מתח פעיל צריך להיות יציב יחסית. יש לא לכלול תאים המראים סימנים ברורים של אובדן סטריה או ירידה משמעותית בכוח (< 15 kN∙m-2 או <80% מהכוח הפעיל הראשוני). טבלה 6 מציגה את הערכים הרגילים הצפויים לפרמטרים החשובים ביותר הנגזרים מכרסמים, חזירים ודגימות אנושיות.
הפרמטרים המתקבלים תלויים בעיקר בפרוטוקול שנבחר. איור 5 מראה עקבות כוח מייצגים של 3, מתוך 8, הקלטות כוח הדרושות כדי לבצע פרוטוקול של myofilaments Ca2+- רגישות. על ידי העברת התא ל הבאר המכילה את פתרון ההפעלה, cardiomyocyte מתחיל לפתח כוח עד שהוא מגיע לרמה. לאחר בדיקת רפוי מהירה (משך של 1 ms), לפיה cardiomyocyte מתקצר ל 80% של אורכו, אנו מקבלים את הערכים הבסיסיים של כוח אפס. לאחר בדיקת הרפוי, התא ממשיך לפתח כוח כפי שהוא שקוע בתתא ההפעלה. כוח כולל(סכום F)מחושב על-ידי חיסור ערך הרמה מהערך המינימלי. השיפוע של החלק האחרון של עקומה זו נותן לנו את הערך של קצב פיתוח הכוח (ktr) (איור 6), שהוא מדד לקצב לכאורה של חיבור וניתוק חוצי גשרים (fapp ו- g aap)10. כאשר ערך ktr R2 הוא <0.90 יש לא לכלול את ערך ktr ובדרך כלל זה קורה בריכוזים נמוכים יותר של Ca2+ (pCa 5.6, 5.8 ו- 6.0). לאחר העברת התא בחזרה ל הבאר המכילה את הפתרון המרגיע, התא נרגע וכוחו יורד. כוח פסיבי (Fפסיבי)מחושב על-ידי חיסור הערך המינימלי (המתקבל לאחר קיצור תא ממושך) לערך כוח חדש זה. כוח פעיל נובע מההפרש בין סכום Fלבין Fפסיבי.
הכוח האקטיבי והפסיבי המקסימלי המאפיין קרדיומיוציט הוא זה הנגזר מהפעלת התא השני עם פתרון רווי Ca2+-(pCa = 4.5). ההפעלה הראשונה נמחקת בדרך כלל כמו אורך sarcomere לעתים קרובות צריך להיות מחדש.
כדי לבצע פרוטוקול רגישות Ca2+, יש צורך לבצע לפחות 9 בדיקות הפעלה (4.5; 4.5; 5.2; 5.6; 6.0; 5.0; 5.4; 5.8 ו-4.5). רצף זה הוא רק דוגמה אבל תמיד צריך להתחיל עם 4.5 (פעמיים) ולסיים עם 4.5. התכנות של התוכנה לרכישת נתונים עבור פרוטוקול רגישות Ca2+שלי מתואר איור 1 של הקובץ המשלים.
לאחר חישוב הכוח הפעיל עבור כל פתרונות ההפעלה הללו, בדוק אם ההפעלה האחרונה הניבה יותר מ- 80% מהכוח המקסימלי הראשוני (אחרת יש למחוק תוצאות תא זה, כאמור לעיל). כדי לתקן את הירידה ב- Fmax במהלך סדרת הניסויים, ניתן להשתמש בערכי Fmax המשולבים כדי לנרמל את נקודות הנתונים. הנתונים המנורמלים יכולים להתאים לעקומה סיגמואידית עם המשוואה הבאה F(Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill). ערכי הפרמטר המתקבלים מייצגים את רגישות הסידן (Ca50, אשר ניתן להמיר pCa50) ושיתוף פעולה (nHill). ניתן להמיר את כל ערכי הכוח לערכי מתח לאחר הנורמליזציה לאזור חתך. מלבד myofilament Ca2+- רגישות ופרוטוקולי ההפעלה תלויי האורך, ניתן לבצע בדיקות אחרות. כזה הוא המקרה של תלות באורך סרקומר של Tאקטיבי, Tפסיבי (איור 7), וכוח שאריות cardiomyocyte. הקלטות כוח שיורית מחושבות מתוך התאוששות הכוח הראשונית (pCa 4.5) שהושגה לאחר שינוי האורך של התא (80%) ומנורמל לכל כוח מצב יציב הכולל הגיע לפני שינוי אורך11. עלייה בכוח שיורית מעידה בדרך כלל על גשרים צולבים עם קינטיקה איטית של ניתוק ונוקשות גבוהה יותר.
לבסוף, עלינו להדגיש כי טכניקה זו יכולה להתבצע קרדיומיוציטים עור מופק מכנית מדגימות קפואות או שנאספו טרי, כמו גם אנזימטי מבודד ואחריו permeabilization של הממברנות שלה. האופן שבו הקרדיומיוציטים מבודדים משפיע באופן משמעותי על התוצאות הנגזרות מטכניקה זו. איור 8 מציג את ההבדלים שנצפו בין שלושת הליכי הבידוד.
איור 1: ערכה משולבת של מנגנון הבדיקה. מנגנון הבדיקה כולל את המיקרוסקופ, את המיקרומניפולטורים ואת המחשב המשויך. בחלק התחתון של האיור נראה קרדיומיוציט עור מודבק בין המנוע לבין מתמר הכוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרשים זרימה של פרוטוקול בידוד התאים, ההדבקה וההדבקה. התמונה בפינה השמאלית העליונה מורכבת מ -4 תמונות המציגות חתיכות של דגימת הלב בתסמת RELAX-ISO (A) בצלחת פטרי, (B) בצינור המשמש להומוגניזציה מכנית של רקמה, (C) homogenizer, (D) הרקמהמידלאחר הומוגניזציה ו - E ) כאשר הוא נמצא בצינור עבור permeabilization טריטון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קביעת אורך ואורך סרקומר של קרדיומיוציט עור. אורך תא וקביעת רוחב באורך סרקומר של ≈2.2 מיקרומטר.
איור 4: פרוטוקול הפעלה תלוי אורך (מחקה את מנגנון סטרלינג פרנק במבחנה). עקבות כוח מייצג ופרמטרים הנגזרים מפרוטוקולי הרגישות Ca2+ של myofilaments שבוצעו לפני (A, 1.8 מיקרומטר) ולאחר מתיחת קרדיומיוציט עד 2.2 מיקרומטר(B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: פרוטוקול רגישות Ca2+. מעקבי כוח מייצגים ופרמטרים נגזרים. למען הפשטות, רק 3 מתוך 8 עקומות כוח מתוארות. כלומר קרדיומיוציטים המופעלים עם הרוויה, פתרון ביניים והנמוך ביותר המכיל Ca2+(4.5, 5,6 ו- 6.0, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: עקבות מייצגים מתא לב של עכברים המופעלים בפתרונות סידן שונים ועיקול התאמה ktr בהתאמה. (א)pCa 4.5; (B)pCa 5.0; (ג)pCa 5.2; (ד)pCa 5.4; (ה)pCa 5.6; (F) pCa 6.0 וערכי E עבור מתח כולל, פסיבי ופעיל, ערך ktr ו- Rsquare עבור התאמה ktr. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: פרוטוקולים של יחסי תלות באורך סרקומר של Tפסיבי (A) ו- Tפעיל (B). מתח פסיבי ומתח אקטיבי חושבו בקרדיומיוציט יחיד באורך סרקומר של 1.8 מיקרומטר עד 2.3 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: תוצאות מייצגות לקרדיומיוציטים מבודדים מכנית מדגימות שריר הלב הטריות ("טריות") והקפאה ("קפוא") וכן מקולאגנס מתעכל לב (טכניקת לנגנדורף שונה) עם חלמקות אחורית עם טריטון ("Collag+Triton"). ערכים של (A) מתח מוחלט, (B) מתח פעיל ו - (C) מתח Pasisve מ cardiomyocytes מופעל עם pCa 4.5 פתרון באורך סרקומר של ≈2.2 מיקרומטר. (D) עקומת רגישות סידן ואת הערכים המתאימים עבור (E) pCa50 ו (F) nHill. (G) שאריות כוח ( H )ערכיktr מחושבים בפתרון הפעלה מרבי (pCa 4.5). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
| אחסן ב | פתרונות מלאי | [M] | נפח סופי (mL) | משקל/ נפח | הערות |
| 4°C | אשלגן הידרוקסידי (KOH) | 1 | 100 | 5.611 גרם | כדי להתאים את ה- pH |
| 4°C | אשלגן הידרוקסידי (KOH) | 5 | 50 | 14.03 גרם | כדי להתאים את ה- pH |
| 4°C | BES | 1 | 50 | 10.66 גרם | |
| 4°C | חומצה פרופיונית | 1 | 100 | 7.483 מ"ל | כוונן את ה- pH ל- 7.0 עם KOH של 5M או 1M |
| 4°C | CaEGTA מורכב מ: | 0.1 | 100 | מערבבים ומחממים את הפתרון ל-60 מעלות צלזיוס במשך יותר משעה. כוונן את ה- pH ל- 5-6 עם KOH של 1M. | |
| - CACO3 | 0.1 | 1.001 גר' | |||
| - טיטריפלקס (EGTA) | 0.1 | 3.804 |
טבלה 1: הוראות להכנת פתרון מלאי.
| RELAX-ISO (לבידוד קרדיומיוציטים) | [mM] | משקל |
| Na2ATP | 5.95 | 3.28 גרם |
| MgCl2.6H2O | 6.04 | 1.23 גר' |
| טריטיפלקס (EGTA) | 2 | 0.76 גרם |
| KCl (1999 | 139.6 | 10.41 גר' |
| אימידזול (1999) | 10 | 0.68 גרם |
טבלה 2: הוראות להכנת פתרון RELAX-ISO.
| פתרון הפעלה (למידות) | [mM] | משקל / נפח |
| Na2ATP | 5.97 | 0.823 גרם |
| MGCl 1M | 6.28 | 1.57 מ"ל |
| חומצה פרופיונית | 40.64 | 10.16 מ"ל |
| BES | 100 | 25 מ"ל |
| CaEGTA (פתרון מלאי שהוכן בעבר) | 7 | 17.5 מ"ל |
| נה2PCr | 14.5 | 0.925 גרם |
טבלה 3: הוראות להפעלת הכנת פתרון.
| פתרון מרגיע (למדידות) | [mM] | משקל / נפח |
| Na2ATP | 5.89 | 0.325 גרם |
| MGCl 1M | 6.48 | 0.65 מ"ל |
| חומצה פרופיונית | 40.76 | 4.08 מ"ל |
| BES | 100 | 10 מ"ל |
| טיטריפלקס (EGTA) | 6.97 | 0.265 גרם |
| נה2PCr | 14.5 | 0.370 גרם |
שולחן 4: הוראות להכנת פתרון מרגיע.
| pCa = -יומן [Ca2+] | מרגיע (pCa = 9.0) מ"ל |
תקצוב (pCa =4.5) מ"ל |
| 5 | 0.86 | 39.14 |
| 5.1 | 1.2 | 38.80 |
| 5.2 | 1.54 | 38.46 |
| 5.3 | 2 | 38.00 |
| 5.4 | 2.51 | 37.49 |
| 5.5 | 3.14 | 36.86 |
| 5.6 | 3.89 | 36.11 |
| 5.7 | 4.8 | 35.20 |
| 5.8 | 5.89 | 34.11 |
| 5.9 | 7.14 | 32.86 |
| 6 | 8.57 | 31.43 |
טבלה 5: הוראות להכנת פתרונות pCa.
| פרמטר | מכרסם | חזיר | אנושי |
| מתח פעיל, kN.m-2 (ב 2.2 מיקרומטר) | 17 – 28 | 19 – 40 | 19 – 36 |
| מתח פסיבי, kN.m-2 (ב 2.2 מיקרומטר) | 3.6 – 5.5 | 1.9 – 6.8 | 1.8 – 2.3 |
| pCa50 | 5.58 – 5.64 | 5.40 – 5.50 | 5.43 – 5.82 |
| nהיל (1999 | 2.60 – 2.76 | 2.95 – 3.36 | 2.99 – 3.10 |
| ktr, s-1 | 4.00 – 8.00 | 1.00 – 3.00 | 0.90 – 2.00 |
טבלה 6: פרמטרים ומדדים אופייניים הנגזרים מקרדיומיוציטים חד-מחלחלים ממכרסמים, חזירים ובני אדם. הותאםמ 12.
| בעיה | סיבה אפשרית | פתרון |
| הקרדיומיוציט מתנתק במהלך הפעלה מקסימלית | זמן הדבקה לא מספיק; הדבק ישן ומיובש | להגדיל את הזמן של שלב ההדבקה; שקול לפתוח צינור דבק חדש. |
| יש טריטון® פתרון השעיית התא, אשר כבר לא ניתן להסיר | חזור על הליך החילוץ עם טריטון אחד או שניים נוספים® לשטוף את השלבים | |
| לקרדיומיוציט יש כוח נמוך בתנאי שליטה | החילוץ השתבש והעביר תאים באיכות נמוכה | להגדיל את גודל המדגם ולעשות חילוץ חדש. אם הבעיה נמשכת היא כנראה בשל איסוף מדגם לא תקין - בטל מדגם זה |
| התא מתכווץ בעליל אך לא נרשם כוח; לתא יש ערכי כוח יוצאי דופן | מתמר הכוח כבוי | הפעל אותו |
| מתמר הכוח אינו מכויל היטב | כייל את מתמר הכוח באמצעות קבוצה של משקולות ידועות (עיין במדריך ההוראות של היצרן). | |
| מחט מתמר הכוח רופפת | הדבק את המחט שוב באמצעות קשר גביש 509 או שעווה תכשיטנים. | |
| תבנית ההתהוות אינה מספיק טובה כדי לקבוע את אורך הסרקומר | אין די אור | להגדיל את אור המיקרוסקופ או להזיז את התא בחזרה לכיסוי ולהעריך את אורך sarcomere שוב (הבארות יש עוצמת אור נמוכה יותר) |
| החילוץ השתבש והעביר תאים באיכות נמוכה | הגדל את גודל הדגימה ותעשה חילוץ חדש | |
| הטיפים של המחטים לא נמצאים באותו מישור | באמצעות מיקרומניפולטורים, להתאים את הטיפים של המחטים למעלה או למטה עד מציאת סרקומרים ממוקדים | |
| אין וריאציית אורך ו/או כוח במהלך הרכישה | המנוע או מתמר הכוח כבויים | הפעלתם |
| המנוע שבור ולא מייצר קיצור תאים | החלף אותו או נסה לכייל אותו באמצעות מחולל פונקציות | |
| יותר מדי רעש בהקלטות הרכישה | יותר מדי זרימת אוויר סביב הציוד | הגן על הציוד מפני זרימת האוויר הישירה |
| יותר מדי ויברציות סביב הציוד | מומלץ להשתמש בטבלת ייצוב. גם אז, מומלץ להסיר כל ציוד שעשוי להיות מדחס או לפלוט תנודות (מקפיא, מקררים) | |
| Ca2+- עקומת רגישות יש ערכים מוזרים וערכי הכוח אינם גדלים עם [Ca2+]. | התערובת של פתרון הפעלה ומרגיעה לא נעשתה כראוי (בדוק 3.10 עד 3.14 של סעיף השיטות, אולי בגלל ערבוב לא מספיק) | להפשיר את הבקבוקונים עם אותו ריכוז, לאסוף את כל התוכן של בקבוקון באותו מקור, לערבב עם מערבל ולחלק אותם שוב. בדוק פתרונות אלה שוב בתא חדש. אם פעולה זו פותרת את הבעיה, הכן אצווה חדשה של פתרונות המכילים Ca2+ |
טבלה 7: טבלת פתרון בעיות.
Discussion
להערכת חוץ של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור מייצג טכניקה חשובה כדי להבהיר את השינויים המתרחשים ברמת cardiomyocyte בפיזיולוגית (למשל, למתוח) והקשר פתולוגי (למשל, חוץמיה). מתודולוגיה זו יש מספר יתרונות כגון דרישת כמות מינימלית של שריר הלב כדי להעריך את הפונקציה cardiomyocytes המתקבל דגימות הפשרה; באמצעות קרדיומיוציטים ממגוון רחב של מינים(עכברים 13,חולדה 1,14,15,ארנב 16,חזיר 17,כלב 18,שרקן 19 ואדם 20) ומקומות לב שונים, כולל אטריה, חדרים שמאלה ויימין או אזור מסוים של הלב אוטם. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת לספקריכוזים ספציפיים של Ca 2 + ואנרגיה (ATP) תוך מדידת הפונקציה של מבנים רגולטוריים והתכווצות בתצורה המקורית שלהם.
למרות הפשטות של טכניקה זו, ישנם כמה צעדים קריטיים. זה חיוני כדי להבטיח את האיכות של כל צעד מההתחלה, כולל איסוף מדגם. חלבונים myofilament רגישים פרוטאזות21. לכן חובה לאחסן דגימות בחנקן נוזלי מיד לאחר האוסף שלה. דגימות טריות, שלא הוקפאו קודם לכן, יפתחו כוחות גבוהים משמעותית, ולכן לא מומלץ לערבב מדידה שנעשתה בדגימות טריות וקפואות באותו פרוטוקול. הצעד השני הקריטי ביותר הוא החילוץ של הקרדיומיוציטים. במהלך הליך זה, זה חיוני כדי לשמור על המדגם על הקרח רוב הזמן. קוקטייל מעכב פרוטאז יכול לשמש כדי להפחית את הסיכון של השפלת חלבון במהלך החילוץ / permeabilization22. שלישית, יש לחתוך דגימות לחתיכות קטנות יותר באמצעות תנועות אזמל מדויקות שכן ציינו קרדיומיוציטים באיכות מופחתת כאשר צעד זה התעלם. צעד קריטי נוסף הוא שטיפת cardiomyocytes שכן קשה לקבל את האיזון הנכון בין שטיפת טריטון (מחלחל את התא אבל מקדם ungluing שלה) ושמירה על תאים רבים ככל האפשר על טבעי. חשוב לנסות תחילה את החילוץ ואת מספר סחף עבור כל מדגם, מין או פרוטוקול. למשל, בידיים שלנו, ציינו כי ZSF1 עקירות רקמת חולדה שמנים יש היבט "שומני", מה שהפך תאים אלה חלקלקים יותר במהלך ההדבקה אבל לא קשה יותר למדוד. הדרך בה אנו עוקפים את הבעיה הזו הייתה על ידי ביצוע ניסויים נוספים כדי שיהיה לנו מספר סביר של תאים לכל בעל חיים. יתר על כן, חשוב לבחור תא טוב להדביק, כלומר עם סטריציה טובה ואורך סביר. אם cardiomyocyte אין תכונות אלה, זה יהיה בעיקר להתנתק טיפים מחט או לפתח כוח לא / נמוך. חשוב גם להשתמש בדבק הנכון עבור התקשרות cardiomyocyte, בהתחשב בזמן הדבקה ויעילותו להדביק את התא למחט. בידינו, דבק הסיליקון(שולחן החומרים)מרפא מהר (10-15 דקות) וחזק מספיק. לבסוף, הצעד הקריטי האחרון קשור עם הרמת בזהירות את cardiomyocyte 5 דקות לאחר הדבקת התא (כדי למנוע הדבקה של התא לכיסוי) ולפני העברתו אל הבארים (כדי למנוע את התא להיגרר על ידי שלב המיקרוסקופ). טבלה 7 מסכמת את פתרון הבעיות המשויך לטכניקה זו, את הסיבות הבסיסיות שלה ואת הפתרונות האפשריים להתגבר על בעיות תכופות.
המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שהיא אינה יכולה לענות על כל השאלות הקשורות להתכווצות myofilament, כגון כמה מהר myofilaments להפעיל / להשבית. בהגדרת in vivo, depolarization ממברנה, תאיים Ca2 + להגדיל ואת הפיזור שלה myofilaments צריך להתרחש עבור myocytes להתכווץ, ואילו ב cardiomyocytes עור Ca2 + דיפוזיה myofilaments מתרחשת מיד כאשר התא שקוע בתספוס Ca2+ . קצב מהיר יותר זה של פיזור Ca2+ יהיה הטיה myofilaments הפעלה / ביטול ניתוח23.
ניסויים אלה מושפעים מגורמים שונים, כולל הטמפרטורה, ה- pH של הפתרון, הפרעה מכנית (מתיחה מחדש רפויה לעומת מרווח) והליכי התקשרות לתא (עניבת סיכה לעומת דבק), כל המשתנים הללו מהווים אי-התאמות בספרות במונחים של ktr והגברת תלוית האורך בסרקומרבכוח 4,12.
התקדמות עתידית של הטכניקה כוללת ביצוע מחקרים פונקציונליים ללא פגע ולא קרדיומיוציטים מחלחלים. טכניקה זו יש את החיסרון של הסתמכות על cardiomyocytes מבודד טרי (לא קפוא בעבר). נושא חשוב נוסף אינו קשור ישירות למתודולוגיה זו, אך זה עשוי להשפיע באופן משמעותי זה קשור לתקופה המקסימלית של אחסון קפוא מדגם. באופן ספציפי, חובה לקבוע את מידת השפלה myofilament לאורך זמן האחסון (כלומר, במשך כמה זמן דגימות קפואות ניתן לאחסן על מנת להבטיח נתונים פונקציונליים באיכות טובה נגזר cardiomyocytes שחולצו).
Disclosures
למחברים אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
המחברים מודים לקרן הפורטוגזית למדע וטכנולוגיה (FCT), האיחוד האירופי, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), פאנדו אירופה דה דסנוולוומנטו האזורי (FEDER) ומפעלי האופרה של Programa de Competitividade (להתחרות) על מימון יחידת המחקר של יוניק (UID/IC/00051/2013). פרויקט זה נתמך על ידי FEDER באמצעות COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalição (POCI), הפרויקט DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), הנתמך על ידי התוכנית התפעולית האזורית של נורטה פורטוגל (NORTE 2020), במסגרת הסכם השותפות של פורטוגל 2020, באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF), הפרויקט NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), הנתמך על ידי קרנות מבניות והשקעות אירופיות, התוכנית התפעולית האזורית של ליסבון 2020. פטריסיה רודריגז מומנה על ידי FCT (SFRH/BD/96026/2013) וז'ואאו אלמיידה-קואלו מומן על ידי אוניברסיטת פורטו/FMUP ו-FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa אופראי אזורי לעשות נורטה, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 34580 | |
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
| Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
| Imidazole | VWR | 24720.157 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
| N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
| Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
| Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
| Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
| Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
| Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
| Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
| Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
| Length Controller (Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
| Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
| Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
| Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
| Inverted Microscope (IX51) | Olympus |
References
- Leite-Moreira, A. M., et al. Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load. Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).
- Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart. Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).
- Cokkinos, D. V. Introduction to Translational Cardiovascular Research. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).
- van der Velden, J., Stienen, G. J. M. Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins. Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).
- Garnier, D. Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge. Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).
- Brady, A. J. Mechanical properties of isolated cardiac myocytes. Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).
- Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. Introduction to Translational Cardiovascular Research. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).
- Liang, W. Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato. Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).
- Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
- Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
- Sequeira, V., et al. Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness. Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).
- Edes, I. F., et al. Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes. American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).
- King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).
- Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9 (1), 2956 (2019).
- Rodrigues, P. G., et al. Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle. American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).
- van der Velden, J., et al. Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction. Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).
- Wakili, R., et al. Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs. Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).
- Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch. Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).
- Falcao-Pires, I., et al. Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness. Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).
- Lim, C. C., et al. Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes. Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).
- Woulfe, K. C., et al. A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study. Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12 (2019).
- Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P.
