这里介绍的是一个非侵入性的中伤性干细胞(MSC)传递和跟踪的小鼠模型创伤性脑损伤的协议。超对磁氧化铁纳米颗粒用作磁共振成像(MRI)探头,用于MSC标签和非侵入性体内跟踪,使用实时MRI进行鼻内传递。
基于干细胞的脑损伤疗法,如创伤性脑损伤(TBI),是临床试验的一种有前途的方法。然而,侵入性细胞交付和移植效率低的跟踪等技术障碍仍然是转化干细胞治疗的挑战。本文介绍了一种基于用超副磁性氧化铁(SPIO)纳米颗粒标记的中位干细胞(MSCs)以及标记MSCs的鼻内传递的干细胞标记和跟踪的新兴技术。这些纳米粒子是含氟素等子素 (FITC) 嵌入和安全标记 MSC,随后通过内陆途径输送到 TBI 诱导小鼠的大脑。然后,通过实时磁共振成像(MRI)对它们进行非侵入性的体内跟踪。该技术结合了SPIO用于细胞标记和鼻内输送的重要优势,包括:(1)非侵入性、体内MSC跟踪后进行长时间的跟踪,(2)由于非侵入性,可以进行多种给分方案MSC的交付途径,以及(3)由于SPIO的安全性、MRI细胞跟踪方法的非侵入性以及给给的路线,可能应用于人类。
中枢神经系统干细胞 (MSC) 是治疗中枢神经系统 (CNS) 疾病和人类损伤的干细胞疗法的诱人候选者。此外,MSC还被用作在损伤部位1、2运送治疗蛋白的工具。近年来,已经开发出有前途的创新技术,为基于干细胞的中枢神经系统疾病疗法建立了细胞传递和2)细胞跟踪的新途径。干细胞进入大脑的内层传递取决于细胞绕过婴儿床板的能力,并通过脑小道3部分进入嗅球。鼻内传递和MSCs与超副磁性氧化铁(SPIO)纳米颗粒的标记相结合,是MSCs在治疗中枢神经系统疾病的临床应用上一个有希望的方法,因为SPIO纳米粒子是磁共振成像(MRI)的安全探针,允许MRI3、4、5在MSC交付后进行非侵入性敏感纵向跟踪。此外,鼻内分娩是一种安全且非侵入性的路线,允许在短时间内进行反复管理。
本文介绍了一种高度敏感和非侵入性的技术,用于在使用SPIO标记细胞和MRI的创伤性脑损伤小鼠模型中跟踪MSC在体内的创伤性脑损伤后分娩。SPIO 标签的一个重要优点是 MRI 对组织中的 SPIO 进行灵敏检测,从而能够高效、非侵入性地跟踪细胞。此处使用的 SPIO 纳米颗粒是市售的,并标有荧光素异物素 (FITC) 荧光磷,允许在组织中检测 SPIO,无需免疫染色或额外处理。此外,还可以执行纵向实时跟踪,并调查交付的 MSCs 的生物分布。
此处描述的协议代表了 MSC 的 SPIO 标签和 SPIO 标记 MSC 的 MRI 跟踪的一般程序。该协议允许有机会使用非侵入性方法研究MSC在体内分娩后在大脑中的迁移和生物分布。
MSC是干细胞疗法的有吸引力的候选,治疗中枢神经系统疾病和损伤,因为它们能够分泌营养因子,1)触发神经恢复过程,2)提供神经保护,因为它们在损伤区域9,10,11,12的抗炎作用。虽然长期MRI跟踪和检测SPIO标记MSCs可能由于细胞间SPIO与细胞分裂稀释可能受到限制,标记细胞可以在移植后长达数周的动物模型13的大脑中检测到。
这里还描述了MSC的标签协议,带有SPIO纳米颗粒,涂有无转染剂的dextran。其他协议已在文献中使用了14,15,16。然而,在所有情况下,这些协议应根据细胞类型、SPIO大小、孵育时间和SPIO浓度进行调整。MSCs已被证明有受损的软骨分化潜力,但不是在SPIO标签17的腺体分化。因此,强烈建议在干细胞交付之前进行分化测定,以评估SPIO对干细胞分化效力的影响。在以前的研究中,证明MSC标签与相同的SPIO类型和浓度在这里使用不影响MSCs6的成骨或异化抗性抗性效力。
治疗性干细胞治疗性脑疾和损伤的内向途径是干细胞临床应用的一条有希望的途径。然而,决定鼻腔干细胞行为的内在和分子机制仍不清楚。虽然对小分子的传递被广泛探索,但治疗干的大小和生物分布行为与小分子不同。当前协议表明,MSC 倾向于在鼻内分娩后迁移到损伤部位。
此处,T2+ 加权图像用于跟踪标有 SPIO 的 MSC。其他报告使用了梯度回波成像。然而,由于细胞间SPIO,在梯度回波成像中经常观察到易感伪影。在当前协议中,表示T2+加权图像上标有SPIO的MSCs的低强度区域的位置与组织学检查检测到的脑部分SPIO的位置相同(图3)。这表明T2+加权旋转回波成像对大脑中标有SPIO标记的MSC跟踪有足够的灵敏度。
总之,所述方案有利于脑损伤和紊乱的体内干细胞跟踪研究。对体内干细胞的纵向跟踪传统上是通过在多个时间点牺牲动物来进行的。目前的协议为MSCs的交付和跟踪提供了一种非侵入性和有效的方法,它代表了基于干细胞治疗脑损伤和临床疾病的潜在程序。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了科学和技术部赠款的支持, 台湾(MOST 104-2923-B-038-004 -MY2,MOST 107-2314-B-038-063,以及 MOST 107-2314-B-038-042)和台北医科大学(TMU 105-AE1-B03,TMU 106-5400-004-400,TMU106-5310-001-400、DP2-107-21121-01-N-05 和 DP2-108-21121-01-N-05-01)。
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |