외상성 뇌 손상 뮤린 모델에서 비강 내 전달 후 MRI를 사용하여 수퍼 파라마그네틱 철 산화물 표지 메젠키말 줄기 세포 추적

중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 중추 신경계 (CNS) 무질서 및 인간에 있는 상해의 처리에 있는 줄기 세포 기지를 둔 치료를 위한 매력적인 후보입니다. 더욱이, 중전적시(MCS)는 상해 부위^1,2에서치료 단백질의 전달을 위한 비차량으로 사용되고 있다. 최근 몇 년 동안, 유망한 혁신은 1) 세포 전달의 새로운 경로 및 2) CNS 무질서의 줄기 세포 기지를 둔 치료를 위한 세포 추적을 설치하기 위하여 개발되었습니다. 뇌로 줄기 세포의 비강 전달은 진골 판을 우회하고 실사 경로를 통해 부분적으로 후각 전구를 입력하는 세포의 능력에 따라 달라집니다^3. SPIO 나노입자가 자기공명영상(MRI)을 위한 안전한 프로브이기 때문에,MRI3,^4에의한 미균 전달및 미균전달과 초파라마그네틱 산화철(SPIO) 나노입자의 라벨링의 조합은 CNS 장애 치료에 있어 MCS의 임상적 적용을 위한 유망한 접근법을 나타낸다. 또한, 비강 내 전달은 짧은 시간 내에 반복 투여를 허용하는 안전하고 비침습적 경로입니다.

이 기사에서는 SPIO 표지 세포와 MRI를 사용하는 외상성 뇌 손상(TBI)의 마우스 모델에서 생체 내 비강 전달에서 중식미큐어를 추적하기 위한 매우 민감하고 비침습적인 기술에 대해 설명합니다. SPIO 라벨링의 한 가지 중요한 장점은 MRI에 의한 조직 내 SPIO의 민감한 검출이며, 이를 통해 세포를 효율적이고 비침습적으로 추적할 수 있습니다. 여기서 사용되는 SPIO 나노입자는 시판되고 면역 염색 이나 추가 처리 없이 조직에서 SPIO를 검출할 수 있는 플루오레세인 이소티오피아네이트(FITC) 플루오로포폴링된다. 또한, 종방향 실시간 추적을 수행하고 전달된 MC의 생체 분포를 조사할 수 있다.

이 프로토콜에 동물과 관련된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며, 타이베이 의과 대학의 동물 사용에 대한 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 없음). LAC-2018-0574; 15.03.2019).

1. SPIO 나노 입자와 자두의 라벨링

1. SPIO로 중간 엽을 붙이려면 라벨링 배지 6mL(덜베코의 수정된 이글 배지 [DMEM]에서 25 μg/mL)을 미균(80% 수렴)을 함유한 T75 플라스크에 추가합니다.
2. CO2 인큐베이터(37°C, 5%_CO2)에서라벨링 매체로 세포를 흔들어 서 두지 않고 배양한다. 24 시간 후, 진공에 부착 된 플라스틱 팁으로 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 라벨 매체를 부드럽게 제거하십시오. 세포 단층 2x를 인산완충식염수(PBS)의 6mL로 세척하여 내재되지 않은 SPIO의 흔적을 제거합니다.
   1. 세포가 성공적으로 표지되었는지 확인하려면, SPIO가 형광포로 태그가 부착된 경우 형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 표지된 세포를 확인하십시오(즉, 여기에 사용된 것과 같은; 그림 1B, C). 대안적으로, 세포에 대한 프로이센 청색 염색을 수행한다(염색 프로토콜에 대한 단계 6.2-6.4 참조).
3. 3 mL의 트립신으로 처리하여 부착 세포를 수확하고 37 °C에서 배양합니다. 배양 5분 후, 미리 데운 DMEM 미디어 7mL를 10% FBS(v/v)로 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 피펫을 사용하여 15 mL 원엽 튜브에 셀 현탁액을 수집합니다.
4. 세포 현탁액을 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리. 상급체를 버리고 PBS에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 트라이판 블루 염료와 혈세포계를 사용하여 실행 가능한 세포를 계산합니다.
   참고: 표지된 세포의 세포 펠릿은 철 로딩으로 인해 어두운 색으로 나타날것이다(도 1D). 이 프로토콜은 MSC 표지 및 MRI 화상 진찰을 위해 관련됩니다. MSC 라벨링^6에 대한 절차는 이전에 최적화되었으며 생체 내 추적이 초점이기 때문에 생체 내에서 추적하는 라벨이 붙은 MSC를 준비하는 단계만 여기에 포함되어 있습니다. 그밖 세포 모형의 배양 그리고 표지를 위한 프로토콜은 연구원에 의해 최적화되어야 합니다.
5. PBS의 18 μL (또는 비강 내 전달 절차에서 사용될 총 부피)에서 PBS를 사용하여 세포 농도를 150,000 세포 (또는 충분한 MRI 신호를 초래하는 숫자)로 조절하십시오.
   참고: PBS의 150,000 세포/18 μL 보다 높은 세포 농도가 세포 응집으로 이어지며, 이는 비강 내 전달의 효율에 영향을 미칠 수 있다는 것을 발견하였다. 비강 내 전달에 더 많은 수의 세포가 필요한 경우, 비강 내 투여가 비침습적 절차이기 때문에 세포 현탁액의 총 부피를 늘리고 비강 내 투여 횟수를 증가시키고 다중 투약이 가능합니다.

2. 통제된 피질 충격 (CCI) 상해

참고: 이 프로토콜에서, 남성 C57 BL/6 마우스 (7-8 주 오래 된) 음식과 물에 광고 리비툼 액세스와 함께 12/12 h 빛/어두운 주기에 보관 되었다.

1. CCI 부상에 대 한 각 마우스를 준비, zolazepam를 관리 (50 mg/kg) 그리고 자일라진 (20 mg/kg) 복 강 내 를 통해 칵테일을 마 취 (i.p.) 주입 (1 mL/kg). 발가락 핀치 반응의 부족에 의해 마취의 깊이가 충분한지 확인하십시오. 양자 택일로, 60 s를 위한 2%-4% 이소플루란이 공급된 챔버에 마우스를놓습니다.
2. 전자 헤어 클리퍼를 사용하여 귀 사이에 두개골의 등도 표면의 털을 면도하십시오. 요오드에 담근 멸균 면봉을 사용하여 면도 부위를 여러 번 청소하십시오. 요오드를 청소하기 위해 70 % 에탄올에 담근 면봉을 사용하십시오.
3. 마취된 마우스를 입체 프레임에 놓고 이어 바와 노즈 바를 사용하여 마우스를 고정합니다. 두개골 표면에 접근하기 위해 멸균 가위를 사용하여 면도 된 피부에 중자 절개 (약 2.5 cm)를 만듭니다.
4. 두개골을 노출하는 면 패드를 사용하여 뼈의 조직을 제거합니다. 10s에 대해 3% H_2O2에 담근 면봉을 사용하여 두개골 표면을 청소한 다음 마른 면패드로 청소합니다.
   참고: 두개골 봉합사와 bregma와 람다를 모두 쉽게 식별 할 수 있습니다.
5. CCI 부상에 대한 두개골 표면에서 선택한 좌표를 식별하고 연필이나 적절한 마커를 사용하여 좌표 주위에 원(직경 4mm)을 그립니다.
   참고: 이 프로토콜에서, 안테로후부(AP)-2.0 mm 및 절경(ML) +1.5 mm의 좌표를 CCI 유도에 사용하였다.
6. 마이크로드릴과 둥근 버(직경 0.5mm)를 사용하여 표시된 원에서 두개골을 얇게 만듭니다. 뼈를 뚫는 것은 뇌 의 자렌치에 손상을 일으킬 수 있으므로 드릴링하는 동안 압력을 가하지 마십시오. 깨끗하고 건조한 면봉을 사용하여 뼈 먼지를 제거하십시오.
7. 멸균 된 미세 집게를 사용하여 뼈 플랩을 부드럽게 제거하여 두라 메이터에 노출시키면서 그대로 유지하십시오. 부상 전 준비에 사용된 입체 프레임에서 마우스를 제거하고 CCI 장치의 입체 프레임에 놓습니다.
8. 이어 바와 노즈 바를 사용하여 마우스의 머리를 안정시고 있습니다. 마우스의 머리가 로스트랄-코달 방향으로 수평이 되는지 확인하고 필요한 경우 코 바를 조정합니다.
9. 컨트롤 박스의 지침에 따라 충격기 팁을 노출된 피질 표면에 0으로 설정합니다. 임팩터 팁이 임팩트 어의 베이스에 있는 X 및 Y 컨트롤 휠을 사용하여 영향을 받을 수 있도록 원하는 피질 좌표 바로 위에 정렬되어 있는지 확인합니다.
10. 5m/s의 속도, 250ms의 거주 시간 및 부상 깊이1mm의 컨트롤 박스를 사용하여 실험 파라미터를 설정하여 마우스의 경미한 부상을 유도합니다.
11. 컨트롤 박스의 '충격' 버튼을 눌러 부상을 유도합니다. 멸균 면봉을 사용하여 발생하는 모든 출혈을 면봉하십시오.
12. 입체 프레임에서 마우스를 제거하고 실크 수술 봉합사를 사용하여 절개를 닫습니다. 마우스가 MRI를 위해 자기장을 받게 되므로 수술 부위를 닫기 위해 금속 클립을 사용하지 마십시오.
13. 감염을 방지하기 위해 외과 부위에 국소 항생제 (바시트라신 네오마이신)를 적용하십시오. 가열 패드에 마우스를 유지하고 복구 단계 동안 밀접하게 모니터링합니다.
14. 케토프로펜 투여 (2.5 mg /kg, IP) 매일 관리 3 수술 후 일, 케토 프로펜 투여는 연구 목표와 모순되지 않는 한.

3. 비강 내 납품

1. 1 일 후 CCI 유도에서, 졸라제팜 (50 mg/kg) 및 자일라진 (20 mg/kg) i.p. 주입을 통해 칵테일을 마취. 발가락 핀치 반응이 부족하여 마우스가 깊이 마취되었는지 확인하십시오.
2. 히알루로니다제 치료에 의한 중산간 미신전을 위해 마우스를 준비한다.
   1. 두개골을 고정하면서 마우스의 목덜미를 잡고 단단히 등을 켭니다. 마우스의 콧구멍 근처에 멸균 PBS(4 U/μL)에 히알루로니다아제가 들어있는 파이펫 끝을 45° 각도로 놓습니다.
   2. 각 콧구멍에 히알루로니다제 현탁액 3 μL을 투여합니다. 마우스를 고정시키고 깨끗한 패드에서 5분 동안 위쪽으로 향하게 합니다.
3. 히알루로니다아제 처리 후, 처리된 마우스를 깨끗한 패드위에 30분 동안 올려 둔상태로 유지합니다.
4. 뇌에 중전 적 시전을 제공 하려면, 마우스를 단단히 잡고, 단계3.2.1에 설명 된 대로. 3 s 간격으로 MSC 현탁액의 3 μL/콧구멍을 관리합니다. 샘플 방울이 완전히 사라질 때까지 30s 동안 동일한 위치에 마우스를 계속 유지하십시오.
   참고: 투여 하는 동안 기포를 형성 하지 마십시오.
5. 최대 3배의 간격으로 2분 간격으로 투여를 반복합니다.
   참고: 전달되는 총 세포 수는 150,000개이며, 이에 따라 18 μL의 세포 현탁액은 각 콧구멍에 대해 3 μL 투여량으로 전달될 수 있으며, 각각 3배이다.
6. 마우스를 케이지로 되돌리고 마취에서 완전히 회복될 때까지 면밀히 모니터링하십시오.

4. 생체 내 자기 공명 영상

참고: 뇌 조직의 조직학적 염색은 이전에 비강 내 투여 후 줄기 세포의 성공적인 전달을 확인하는 데 사용되었습니다. 그러나 이 방법은 세로가 아닌 연구의 끝점으로만 사용할 수 있습니다. 치료 줄기 세포에 라벨MRI 프로브를 사용하면 MRI를 사용하여 세포의 세로, 비 침습적, 생체 내 추적을 허용합니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 필요한 동물의 수를 효율적으로 감소시킨다는 것이다. 이 프로토콜에서, MRI 스캐닝은 1일, 7일 및 14일 자식전 후 에서 수행되었다.

1. MRI 스캐닝을 위해 마우스를 준비하려면 이소플루란으로 마우스를 마취시요(유도를 위해 O_2의 1L/min에서 5%의 이소플루란, 유지관리를 위한 1.5%-2%의 이소플루란). 발가락 꼬집을 수행하여 마우스가 필요한 마취 수준에 도달하도록 합니다.
2. 이미징 홀더에 마우스를 놓고 탭 또는 기타 적절한 방법을 사용하여 위치를 고정합니다. 홀더를 MRI 코일(7T/40cm 자석)의 중심으로 이동하고 모니터링 연결을 연결합니다.
3. 스핀 에코 시퀀스를 사용하여 T2*가중치 스캔을 획득하려면 반복 시간(TR)을 1500ms로 설정하고 에코 시간(TE)을 2.8ms로 설정합니다.
4. 16mm x 16mm 시야각(FOV), 128 x 128 획득 매트릭스(MTX) 및 슬라이스 두께를 4개의 신호 평균과 90° 플립 각도(FA)로 사용하여 0.75 x 0.8mm^2를 사용합니다.
5. 스캔을 완료한 후 MRI 코일 센터에서 마우스 홀더를 철회합니다. 마우스를 케이지로 되돌리고 마취에서 완전히 회복될 때까지 면밀히 모니터링하십시오.
6. T2*가중 이미지에서 레이블이 붙은 MC를 추적하고 정량화하려면 ITK-SNAP 소프트웨어(버전 3.8.0)를 사용합니다^7.
   1. MRI 컴퓨터의 원시 데이터를 MRI 기계의 컴퓨터에서 DICOM(의학의 디지털 이미징 및 통신) 형식으로 분석하는 데 사용되는 컴퓨터로 전송합니다.
   2. ITK-SNAP 소프트웨어를 실행하고 파일 버튼을 클릭하여 MRI 이미지를 로드합니다. 그런 다음 메뉴에서 메인 이미지 열기를 클릭합니다. 디스플레이 창에서 이미지 열기 버튼을 누린 다음 찾아보기 버튼을 사용하여 MRI 이미지를 찾아 엽니다.
      참고: MRI 이미지에 표지 된 세포의 시각화는 저강도 영역으로 나타납니다. 이미지 대비를 조정해야 하는 경우 도구를 선택합니다 | 이미지 대비.
   3. 세분화 레이블 섹션에서 활성 레이블을 선택하여 저강도 영역과 병변 또는 기타 뇌 부분의 세분화를 만듭니다. 여러 세그먼트에 대해 서로 다른 레이블 색상을 사용합니다(두 개 이상의 부품의 분할이 필요한 경우).
   4. 기본 도구 모음의 다각형 도구를 사용하여 SPIO 레이블이 지정된 MC를 나타내는 강렬한 영역 을 그리려면 MRI 이미지 아래에 있는 수락을선택합니다. 분할된 영역은 특정 세그먼트에 할당된 활성 레이블의 동일한 색상으로 표시됩니다. 모든 MRI 조각에 대해 이 세분화 단계를 반복합니다.
   5. TheITK-SNAP 도구 상자 하단의 세분화 레이블 섹션에 있는 3D 도구 모음하단에 있는 메스 도구를 선택하여 전체 뇌의 MSC 분포를 나타내는 세그먼트 영역의 3D 맵을 개발합니다. 그런 다음 생성된 3D 맵 하단의 수락을 누릅니다.
   6. 표지된 셀을 나타내는 분할된 저강도 영역의 정량 분석(볼륨 및 강도 평균)을 수행하려면 상단 패널의 세분화 버튼을 누르고 볼륨 및 통계를선택합니다.

5. 마우스 두뇌및 냉동 부속의 고정

1. 마우스 두뇌를 고치기 위하여는, 앞서 설명한^8과같이 마지막 MRI 검사 다음 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 혈전을 능력을 발휘합니다.
   1. 머리를 참수하고 뇌를 추출⁸. 4°C에서 적어도 48시간 동안 4% PFA로 뇌를 고정시.
   2. 뇌가 용액의 바닥으로 가라 앉을 때까지 4 °C에서 30 % 자당 용액에 담그면 뇌를 탈수하십시오.
2. 뇌를 최적의 절삭 온도(OCT) 용액에 포함하고 -20°C에서 동결합니다. 14 μm 두께의 조각으로 저온 유지 마이크로 톤으로 뇌를 섹션과 슬라이드에 장착. 추가 사용 이전까지 섹션 슬라이드를 -20°C에서 보관하십시오.

6. 프로이센 블루 스테인링

참고: 프로이센 청색 염색은 일반적으로 SPIO 표지된 세포에서 철 함량을 검출하는 데 사용됩니다. 여기서, 프로이센 블루 염색은 MRI 이미지의 저강렬한 신호가 SPIO 표지 된 중식 종새 에 해당하고 아티팩트가 아니라는 것을 확인하기 위해 사용된다. 프로이센 블루 염색은 조직에서 철을 검출하는 데 사용되는 가장 민감한 조직 화학 적 방법 중 하나이며 세포에서 철의 단일 과립을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

1. 뇌 섹션의 슬라이드를 증류수로 5 분 동안 씻으십시오.
2. 동일한 부분염산 (10 %)을 포함하는 염색 용액에 30 분 동안 슬라이드를 침지하여 프로이센 블루 염색을 수행하십시오. 페로샤니드 칼륨 (10%) 사용하기 직전에 준비하십시오.
3. 증류수로 3x를 각각 5분 동안 씻으소서. 5 분 동안 핵 빠른 빨간색으로 섹션을 카운터 스테인. 증류수로 슬라이드 2x를 헹구십시오.
4. 슬라이드를 95% 및 100% 알코올을 각각 2분 동안 침지하여 점차적으로 섹션을 탈수시합니다. 수지 장착 매체로 커버슬립을 추가합니다.
5. 가벼운 현미경을 사용하여 뇌 섹션의 스테인드 세포를 감지하십시오.
   참고: 표지된 세포의 다리미는 청색 침전물처럼 나타납니다.

비강 내 전달 후 24시간 후, SPIO 라벨이 부착된 중간엽 중간엽 은 T2*가중이미지(그림 2B)에서피질 손상에 대한 강한 저강도 영역으로 검출되어 SPIO가 부상 부위로 의표적 이동되었음을 나타냅니다. 이러한 이동은 전달 후 14일까지 가시화되었고, 저강렬한 신호는 이 기간 동안 현저한 감소 없이 보이는 것으로나타났다(그림 2B). PBS로 치료된 부상당한 동물은 관찰된 저강도 영역이 SPIO 표지 된 SC에 해당하고 아티팩트를 신호하지 않음을 나타내는 저강도 영역을 나타내지 않았다(도 2A)MRI로 생체 내에서 관찰된 라벨된 MCS의 생체 분포는 3D 재구성을 사용하여 시각화하였다(도2C,D). 부상당한 피질로의 중식일의 이동은 표지된 MC에서 FITC 태그가 부착된 SPIO의 프로이센 청색 염색 및 FITC 채널 검출에 의해 조직학적으로확인되었다(도 3A, B).

도 1: 프로토콜의 개략적 순서도 및 MSCs에 의한 SPIO 섭취량의 시험관내 확인(A) MCS는 라벨링을 위해 24시간 동안 SPIO로 배양하였다. 이어서, 표지된 MCS를 비강(IN) 경로를 통해 TBI 마우스 모델로 전달하였다. 상이한 시점에서 MRI는 표지된 MC를 추적하기 위해 수행되었다. (D) 표지된 자식세포의 세포 펠릿은 철로 인해 어두운 색으로 나타났다. FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; SPIO = 산화철의 초파라자기 입자; 중간 엽 줄기 세포 = 중간 엽 줄기 세포; MRI = 자기 공명 영상; IN = 비강 내; TBI = 외상성 뇌 손상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 실시간 MRI를 통해 TBI 유도 마우스의 뇌에서 부상 부위로 SPIO 라벨이 부착된 MSC 이동을 감지하고 추적할 수 있습니다. (a)마우스를 TBI를 행하고, PBS 또는 SPIO 라벨이 부착된 MC로 처리한 후, 부상 후 24시간 동안 비강 내 경로를 통해 투여하였다. T2*가중 이미지의 코로나 섹션은 1, 7 및 14일 후 납품 후 부상 부위(윤곽이 있는 영역)의 가장자리에 있는 저강도 영역(화살촉)으로 표시된 MC를 보여주었습니다. PBS 처리된 마우스는 더 강렬한 지역을 보여주지 않습니다. (B)코로나 T2*-MRI 영상을 기반으로 부상 부위 영역(녹색) 및 라벨이 붙은 MBC(빨간색)의 세분화 과정. (C)3D 재구성은 14일 후 뇌에서 SPIO 표지 된 MC의 생체 분포를 보여주는 T2*가중 이미지를 기반으로 한 마우스 뇌 치료의 재구성이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: 조직학적 분석은 치료된 동물의 뇌에서 SPIO 표지 된 중식종의 존재를 확인한다. PS(A)의 뇌 절편(A)마우스의 염색은 PBS(대조군)와(C)마우스를 SPIO 표지형 MCS로 처리하였다. PBS 및(D)마우스로 처리된(B)대조군 마우스의 피질의 형광 현미경 분석은 SPIO 표지형 MCS로 처리한 후 14일 간 진행하였다. 분석은 MSC 처리한 마우스에 있는 부상당한 피질에 FITC 태그된 SPIO 양성 세포 (박스형 세포, 녹색)의 존재를 밝혔습니다, 그러나 PBS 처리한 마우스의 피질에서 FITC 신호는 관찰되지 않았습니다. 스케일 바 = 50 μm(달리 명시되지 않는 한). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없다.