Summary
الثقافة الكلية للغشاء الأوّلي الكلّي (MAAC) هي طريقة جديدة لاستزراع الخلايا الشحمية البشرية الناضجة. هنا نحن بالتفصيل كيفية عزل الخلايا الدهنية من الدهنية الإنسان وكيفية إعداد MAAC.
Abstract
الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) dysregulation يلعب دورا مركزيا في تطوير مقاومة الأنسولين ومرض السكري من النوع 2 (T2D). لتطوير علاجات جديدة لT2D، وهناك حاجة إلى نماذج أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في المختبر الدهني. تصف هذه الدراسة تقنية جديدة لعزل وثقافة الخلايا الشحمية البشرية الناضجة. هذا الأسلوب هو عنوان MAAC (غشاء الناضجة الثقافة الأعلى adipocyte) ، وبالمقارنة مع غيرها من الخلايا الدهنية في نماذج المختبر ، MAAC تمتلك توقيع الجينات adipogenic التي هي الأقرب إلى الخلايا التخلايا الناضجة المعزولة حديثا. باستخدام MAAC ، يمكن استزراع الخلايا الشحمية من المرضى الهزيلين والبدناء ، ومستودعات الدهنية المختلفة ، والمشاركة في الاستزراع مع أنواع الخلايا المختلفة ، والأهم من ذلك ، يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة لمدة أسبوعين. ويمكن أيضا إجراء التجارب الوظيفية على MAAC بما في ذلك امتصاص الجلوكوز، وlipogenesis، وتحلل الدهون. وعلاوة على ذلك، يستجيب MAAC بقوة إلى الآلام الدوائية المتنوعة ويمكن استخدامها لدراسة التغيرات الدهنية فينوتبيك، بما في ذلك تمايز الخلايا الدهنية البيضاء إلى خلايا دهنية تشبه البني.
Introduction
وتستلزم الزيادة العالمية في الأمراض المشتركة المرتبطة بالسمنة والسمنة استحداث علاجات جديدة. الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) هو منظم مهم لعملية التمثيل الغذائي في الجسم كله، وتوازن الطاقة، وهو لاعب مركزي في تطوير مقاومة الأنسولين ومرض السكري من النوع 2 (T2D)1،2. أثناء استهلاك السعرات الحرارية الزائدة المزمنة، تتضخم الخلايا الشحمية للتعامل مع فائض الطاقة. ومع ذلك ، يمكن أن تصبح تتجاوز قدرة تخزين الدهون الدهنية ، مما يؤدي إلى ارتفاع مستويات تعميم الأحماض الدهنية وزيادة التخزين في الأنسجة الطرفية غير الدهنية ويؤدي إلى سمية الدهون3،4.
عدم وجود نماذج adipocyte في المختبر مع أهمية عالية الترجمة هو التحدي الرئيسي في تطوير علاجات جديدة للسمنة وT2D. نموذج explant explant exvo السابق ، حيث يتم استزراع قطع صغيرة من الأنسجة الدهنية ، يرتبط بالتعديلات السريعة في التعبير الجيني المبوع مدفوعًا بنقص الأكسجة والالتهاب5،6. الثقافات السقف (CCs) حيث الخلايا الشحمية ناضجة تطفو وتتمسك بالجزء العلوي من قوارير مملوءة بالوسائط، وdedifferentiate بسرعة إلى خلايا تشبه الخلايا الليفية تفتقر إلى الدهون7،8،9،10. النموذج الأكثر استخداما هو الخلايا الشحمية المتمايزة في المختبر من السلائف الملتزمة. ومع ذلك، فإن الخلايا المتمايزة متميزة شكلياً عن الخلايا الشحمية الناضجة في الجسم الحي لأنها أصغر بكثير في الحجم وتفتقر إلى قطرة دهنية أحادية. وتشمل القيود الأخرى مع هذا النموذج الحاجة غير الفسيولوجية من كوكتيل الكيميائية لدفع التمايز، فضلا عن التباين في كفاءة التمايز التي يمكن أن تتأثر بعدد من العوامل11،12،13،14.
لقد قمنا مؤخرًا بتطوير الثقافة المجمعة للغشاء الناضج (MAAC) ، وهي طريقة لثقافة طويلة الأجل من الخلايا الشحمية الناضجة المعزولة حديثًا ، حيث يتم استزراع الخلايا الشحمية تحت أغشية نفاذة10. وقد أظهر التحليل غير المتحيز لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أن نسبة إلى النباتات الدهنية الدهنية والدهنية المتمايزة في المختبر ، MAAC هي الأكثر تشابهًا مع الخلايا الدهنية المعزولة حديثًا. يمكن استخدام MAAC لثقافة الخلايا الدهنية الناضجة المعزولة عن الأنسجة الدهنية تحت الجلد والحشوية على حد سواء ، وكذلك الخلايا الشحمية من كل من الموضوعات البدينة والهزيلة. تسمح هذه المنهجية بدراسة التغيرات الدهنية طويلة الأجل وتسهل الثقافة المشتركة للخلايا الشحمية مع أنواع الخلايا الأخرى. هنا نقدم بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الشحمية الناضجة من الأنسجة الدهنية البشرية وكيفية إنشاء نظام MAAC.
Protocol
تم جمع عينات مجهولة من الأنسجة الدهنية من منطقة البطن للمرضى الإناث الخضوع لعملية جراحية اختيارية في مستشفى جامعة ساهلغرينسكا في غوتنبرغ، السويد. تلقت جميع مواضيع الدراسة معلومات مكتوبة وشفوية قبل إعطاء موافقة خطية مستنيرة على استخدام الأنسجة. ووافق المجلس الإقليمي لاستعراض الأخلاقيات في غوتنبرغ، السويد، على هذه الدراسات.
ملاحظة: يتم توفير نظرة عامة على الأسلوب في الشكل 1.
1. إعداد المخازن المؤقتة، وسائل الإعلام ثقافة الأنسجة، ولوحات الثقافة
- إعداد 5x كريبس رينجر (KR) الأسهم عن طريق حل 35.1 غرام من NaCl، 1.75 غرام من KCl، 0.82 غرام من KH2PO4،و 1.48 غرام من MgSO4·7H2O في 900 مل من الماء. إضافة 1.84 غرام من CaCl2·2H2O وضبط مستوى الصوت إلى 1 لتر عن طريق إضافة الماء. مرشح معقم من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- من مخزون 5x KR ، قم بإعداد 1 لتر من العازلة التي تحتوي على 1x KR ، 25 mM HEPES ، 2 mM الجلوكوز ، و 2 ٪ من الألبومين مصل البقر (BSA) (يشار إليها فيما بعد باسم العازلة غسل). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
- إعداد 500 مل من العازلة الكولاجين التي تحتوي على 1x HBSS + CaCl2 + MgCl2،2٪ BSA، و 450 مل من الماء (يشار إليها فيما بعد باسم العازلة الهضم).
ملاحظة: لا ينبغي إضافة الكولاجين إلى المخزن المؤقت للهضم إلا بعد أن يتم وزن الأنسجة الدهنية في الخطوة 2.2. - ضبط درجة الحموضة من المتوسط 199 إلى 7.4.
- تصفية معقمة على حد سواء المخازن المؤقتة والمتوسطة 199 من خلال قارورة مرشح 0.22 ميكرومتر ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: لتوفير الوقت، يمكن إعداد وسائط زراعة الأنسجة وإضافتها إلى اللوحات قبل معالجة الأنسجة الدهنية. للحصول على تنسيق لوحة 24-well(الشكل 1A)،استخدم 0.5−1 مل/بئر من خليط النسر المعدل ة من نوع النسر F12 (DMEM/F12)، و10% مصل الأبقار الجنيني (FBS)، و1% بينسيلين-ستريبتومسين (بنسلفانيا/ستريبت) و20 مليون أنسولين. يمكن أيضًا إضافة الجزيئات الصغيرة وغيرها من العوامل الدوائية المستقرة في هذا الوقت إلى الوسائط في التخطيط المطلوب. ضع الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2).
2. تشريح الأنسجة الدهنية تحت الجلد الإنسان
ملاحظة: العمل داخل خزانة السلامة البيولوجية واستخدام تقنية معقمة طوال عملية العزل، فضلا عن الاستخدام الحصري للمعدات المعقمة والمعقمة.
- ضع الأنسجة الدهنية البشرية في طبق بتري 15 سم وإضافة حجم صغير من المتوسط 199 للحفاظ على ترطيبها أثناء تشريحها.
- العمل مع قطع من الدهنية تقريبا حجم كرة الغولف، وفهم الأوعية الليفية الكبيرة مع ملاقط والإفراج بلطف الخلايا الدهنية عن طريق كشط الدهنية مع الجزء الخلفي من مقص مغلق. تجاهل القطع الكبيرة من الأنسجة الليفية. وزن الدهون المشذبة.
3. علاج الكولاجين
- إضافة الكولاجين إلى المخزن المؤقت للهضم (انظر الخطوة 1.3) بتركيز 1 ملغ / مل. قم بتصفية المحلول باستخدام فلتر معقم 0.22 ميكرون.
ملاحظة: يوصى بثلاثة مل من عازل الهضم لكل غرام من الدهون (أي ل100 غرام من الدهون، وإعداد 300 مل من عازل الهضم مع 300 ملغ من نوع 2 الكولاجين).
تنبيه: النوع 2 الكولاجين يشكل خطرا على العينين والجلد ويمكن أن يسبب تهيج الجهاز التنفسي. ارتداء القفازات، وحماية العين، والعمل في غطاء التهوية عند التعامل مع الكولاجين. - نقل ما يقرب من 10 غرام من الأنسجة الدهنية إلى طبق بيتري 15 سم والمفروم الدهون بعناية باستخدام زوج من مقص منحني حتى يصبح خليط متجانس على نحو سلس وليس هناك قطع كبيرة من الدهنية اليسار. كرر العملية حتى تتم معالجة جميع الدهون.
ملاحظة: يجب أن تستغرق كل جولة حوالي دقيقتين وينبغي أن تكون القطع الدهنية صغيرة بما يكفي بحيث يمكن أن تكون pipetted باستخدام طرف ماصة واسعة. هذه الخطوة حاسمة لإنتاج adipocytes عالية الجودة. إذا كانت القطع كبيرة جدا، وأوقات الهضم يجب أن تمتد، مما يعرض للخطر خلية viabilty. - نقل الدهون المفرومة إلى 50 مل أنابيب مخروطية باستخدام ملعقة. أضف 10 مل من الأنسجة المفرومة و 30 مل من عازل الهضم إلى كل أنبوب. تقليص إلى وحدات التخزين المناسبة إذا كان أقل من 10 مل من الدهون المفرومة المتاحة.
- هضم الأنسجة عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز مع الهياج المستمر في 150 دورة في الدقيقة لمدة 30-45 دقيقة. بعد 30 دقيقة، تحقق من العملية كل 5 دقيقة لتجنب الإفراط في الهضم.
ملاحظة: يكتمل الهضم عندما يكون المحلول الدهني متجانسًا دون أي قطع كبيرة وله لون مشمش.
4. ترشيح تعليق الخلية وتنقية الخلايا العضوية الناضجة
- ضع قمعًا فوق قارورة معقمة 1 لتر ووضع فلتر شبكة معقم ًا بقيمة 250 ميكرومترًا داخل القمع. صب محلول الدهون المهضومة في مرشح لإزالة الأنسجة غير المهضومة.
- عندما مرت كل من تعليق الخلايا الدهنية من خلال مرشح، والضغط بلطف مرشح شبكة لزيادة غلة الخلايا الشحمية. صب ما يقرب من 50-100 مل من مخزن الغسيل في الفلتر لشطفه والضغط على الفلتر مرة أخرى.
- صب تعليق الخلايا الدهنية المعزولة من قارورة في قمع فصل وإضافة عازلة غسل حتى يتم تعبئة القمع تماما تقريبا. عكس بلطف القمع عدة مرات لخلط تعليق الخلايا الدهنية مع المخزن المؤقت.
- دع التعليق يقف لمدة 2-3 دقيقة حتى يكون هناك فصل متميز من طبقتين(الشكل 1B)، مع طبقة صفراء علوية تحتوي على الخلايا الدهنية الناضجة والدهون الحرة وطبقة القاع التي تحتوي على المخزن المؤقت وجزء الأوعية الدموية الدهنية (SVF).
- فتح فوهة على قمع الفصل، وببطء اللبدة المحلول السفلي في قارورة معقمة (يمكن أن تكون خلايا من SVF بيليه وجمعها بعد الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 7 دقيقة). الحفاظ على الطبقة العليا مع الخلايا الشحمية ناضجة في قمع الفصل.
- كرر عملية الغسيل في الخطوات 4.3-4.5 ثلاث مرات لغسل الخلايا الشحمية الناضجة جيدا وإزالة كل من الكولاجين.
5. التعبئة من adipocytes ناضجة
- افتح الفوهة واجمع تعليق الخلايا الشحمية الناضجة المنقى إلى أنابيب مخروطية 50 مل.
- حزمة طفيفة adipocytes ناضجة عن طريق الغزل الأنابيب في 50 × ز لمدة 3 دقيقة.
- استخدم إبرة 18 G وحقنة لإزالة العازلة غسل المتبقية تحت تعليق الخلايا الشحمية.
- إزالة طبقة الدهون الحرة (النفط من الجزء الصغير من الخلايا الشحمية التي كسرت أثناء إجراء العزل) تطفو على رأس الخلايا الدهنية الناضجة باستخدام ماصة.
ملاحظة: للحد من خطر أن الخلايا الشحمية سوف بالتنقيط قبالة الأغشية في الخطوة 6.5، من المهم أن طبقة الدهون وجميع العازلة غسل قد أزيلت عندما يتم بذر الخلايا الشحمية ناضجة على الأغشية. لهذا السبب جمع الخلايا الشحمية في 3 أنابيب. العينات التي يتم جمعها الماضي سيكون لها الدهون الأكثر ترحيل وبالتالي سوف تكون من أدنى نوعية. ومع ذلك، مع pipetting دقيق يمكن استخدام هذه العينات.
6. البذر من الخلايا التخلايا الناضجة
- فتح الحزمة التي تحتوي على إدراج غشاء نفاذة(جدول المواد)ويخرج مكون الغشاء. الوجه رأسا على عقب ووضعها على سطح معقم بحيث تواجه الأغشية السقف.
- ماسيت 30 ميكرولتر من الخلايا الشحمية الناضجة معبأة على كل من الأغشية(الشكل 1C). تجنب لمس الغشاء مع طرف. استخدام نصائح ماصة واسعة لحفر لبذور الخلايا، أو استخدام مقص لقطع قطعة صغيرة من تلميح ماصة لجعلها أوسع.
- عكس بلطف أنابيب 50 مل مع الخلايا الشحمية معبأة عدة مرات في جميع أنحاء عملية البذر لضمان توزيع حتى من الخلايا الشحمية مع أحجام مختلفة.
- أحضر الأطباق المتعددة الآبار المعدة التي تحتوي على الوسائط من الحاضنة إلى خزانة السلامة البيولوجية وأزل الأغطية. التقاط الأغشية المبذر مع الخلايا الشحمية وفهمه من أسفل بحيث يمكن عكسها في الخطوة 6.5.
- في حركة واحدة على نحو سلس عكس الأغشية مع الخلايا الشحمية على رأس بحيث الخلايا الشحمية المصنفة تواجه الآن إلى أسفل(الشكل 1D). خفض لوحة مع الخلايا الشحمية في الآبار التي تحتوي على وسائل الإعلام(الشكل 1E).
- وضع الغطاء على لوحة ونقل بعناية لوحة إلى حاضنة زراعة الأنسجة. تجنب الحركة السريعة للصفيحة منذ الخلايا الشحمية يمكن بسهولة أن تكون مخليحة في البداية.
ملاحظة: يستغرق الأمر بضعة أيام حتى تلتصق الخلايا بإحكام أكبر في الغشاء.
7- صيانة الخلايا التبحمية والحصاد للتحليل
- تغيير وسائل الإعلام على الأقل كل 7 أيام. إزالة وإضافة وسائل الإعلام عبر ثقب انقطاع في كل إدراج غشاء. لإزالة وسائل الإعلام، استخدم حقنة وإبرة، عصا aspirating، أو ماصة مع طرف P200. لإضافة وسائل الإعلام، واستخدام ماصة وببطء ماصة وسائل الإعلام الجديدة في الآبار على طول الجانب من الجدار لتجنب إزعاج adipocytes.
ملاحظة: وقد تم مثقف adipocytes لمدة 2 أسابيع مع تغيير واحد وسائل الإعلام بعد 7 أيام. ومع ذلك، قد تستفيد الأصول الدهنية المختلفة والأسئلة التجريبية من زيادة التغييرات في وسائل الإعلام. - لحصاد الحمض النووي الريبي، وإزالة وسائل الإعلام كما هو موضح في الخطوة 7.1، وإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانليس(جدول المواد)مباشرة في الآبار لخلايا. لإصلاح الخلايا للتصوير، إضافة الفورمالديهايد مباشرة إلى البئر بتركيز نهائي من 1٪.
ملاحظة: يمكن بعد ذلك تخزين الخلايا عند 4 درجة مئوية.
Representative Results
الخلايا الشحمية الناضجة مثقف كما MAAC يحافظ على وظيفتها، النمط الظاهري، ويمكن استخدامها لدراسة الاستجابات adipocyte لمختلف العلاجات الدوائية. بعد أسبوع واحد من الثقافة MAAC معزولة عن الأنسجة الدهنية تحت الجلد الحفاظ على قطرات الدهون أحادية المميزة وجدت فقط في الخلايا الدهنية الناضجة(الشكل 2A). وقد مثقف MAAC لمدة 1 أسبوع في حين تعامل مع إما ناهضات PPARа rosiglitazone (روزي) وpioglitazone (بيو), أو مستقبلات الجلوكوكورتيكويد (GR) ناهض ديكساميثازون (ديكس) لتحديد ما إذا كان مختلف مستقبلات الهرمونات النووية (NHR) ناهضات محرك التغيرات المتوقعة في الجينات المستهدفة المصب في MAAC. وزاد روزي وبيو من التعبير عن الجينات المستجيبة لـ PPARа FAB4 و LPL بمقدار 4 و2−3 أضعاف، على التوالي، في حين لم يكن للديكساميثازون أي تأثير(الشكل 2B). وبالمثل، قاد ديكساميثازون بقوة التعبير الجيني للجينات الهدف GR APOD و FKBP5 بنسبة 13-و 55 أضعاف على التوالي، في حين لم يكن للناهضين PPARа أي آثار كبيرة. لقد سبق لنا أن أظهرت أن الإنسان المعزولة حديثا الناضجة الخلايا الشحمية البيضاء يمكن أن تتحول إلى النمط الظاهري البني مثل في MAAC عندما تعامل مع روزي10. وهناك علاج 7 أيام مع روزي أو بيو بقوة حث التعبير الجيني للجين البني محددة الدهون UCP1 من قبل 44-65 أضعاف، فضلا عن زيادة التعبير عن علامة الدهون البني PDK4 12-18 أضعاف(الشكل 2C).
الشكل 1: الرسم التخطيطي المرئي لإعداد MAAC. (أ)إعداد المتوسطة. (ب)عزل وتعبئة الخلايا الشحمية الناضجة. (C)البذر الخلايا الشحمية الناضجة على الأغشية. (D)عكس الأغشية مع الحفاظ على الخلايا الشحمية المرفقة. (E)خفض الأغشية في الوسط وتغيير الوسط. وقد تم تعديل هذا الرقم من Harms et al.10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: MAAC يحافظ على مظهر أحادي من خلال أسبوع واحد والاستجابة للاضطرابات الدوائية المتنوعة. (أ)ممثل 4x و 10x صور ميدانية مشرقة من MAAC بعد أسبوع واحد من الثقافة. الخلايا التبحمية التي يبلغ متوسط قطرها 100 ميكرومتر مع قطرات كبيرة من الدهون أحادية الخلايا يمكن تمييزها بسهولة. (ب)مستويات مرنا من الجينات المستهدفة PPARа مستقبلات الجلوكوكورتيكويد (GR) الجينات المستهدفة في MAAC بعد 7 أيام من العلاج مع السيارة (Vehc)، rosiglitazone (روزي)، pioglitazone (بيو)، أو ديكساميثازون (ديكس). وقد استخدمت روزي، بيو وديكس في التركيز النهائي من 10 ميكرومتر (C) مرنا مستويات الجينات الغنية بالدهون البني في MAAC بعد 7 أيام من العلاج مع السيارة (Vehc)، rosiglitazone (روزي)، pioglitazone (بيو)، أو ديكساميثازون (ديكس). وقد استخدمت كل من روزي وبيو وديكس بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر. بالنسبة لجميع بيانات التعبير الجيني، تم استخدام بروتين تاتا الملزم (TBP) كتحكم داخلي في التطبيع. تم حساب الإحصائيات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار مقارنات Tukey المتعددة. (يعني ± SD، n = 3، *p < 0.05؛ **p < 0.01؛ ***p < 0.001). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
الثقافة الكلية للغشاء المثل (MAAC) هي طريقة جديدة للثقافة طويلة الأجل للخلايا التأنية الناضجة المعزولة حديثًا. في إنشاء MAAC هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي تؤثر بشكل كبير على العائد والجودة والقدرة على البقاء من الخلايا الشحمية ناضجة. وينبغي أن يوضع الكثير من الجهد في التشبيب الدهون في الخطوة 3.2 منذ هذه الخطوة يؤثر مباشرة على مقدار الوقت يتعرض الخلايا الشحمية إلى الكولاجين. إذا كانت قطع الدهنية كبيرة جدا، فإن وقت الهضم يجب أن تمتد مما يؤثر سلبا على قدرة الخلايا على البقاء. على العكس من ذلك ، إذا تمت معالجة الأنسجة بدقة كبيرة مع مقص ، يمكن أن تتأثر القدرة على البقاء أيضًا. لثقافة ناجحة من الخلايا الشحمية الناضجة كما MAAC، ينبغي للمرء أن يعطي اهتماما خاصا للخطوات التالية: لالبذر الناجح للخلايا الشحمية على الأغشية، فمن الأهمية بمكان أن الدهون الحرة وترحيل غسل العازلة تتم إزالة من الخلايا الدهنية ناضجة في الخطوات 5.3 و 5.4. الدهون المتبقية أو غسل العازلة سوف يقلل من التوتر السطحي للadipocytes وزيادة خطر الخلايا الشحمية يقطر قبالة الأغشية عندما يتم قلبها. عندما يتم بذر الخلايا الشحمية وفي وسائل الإعلام ، تبقى الخلايا على اتصال مع الغشاء في المقام الأول من خلال الطفو ، وبالتالي يوصى بتقنية بطيئة ولطيفة عند تغيير الوسائط لعدم فقدان الخلايا. إزالة وسائل الإعلام من أسفل الآبار كما هو موضح في الخطوة 7.1 وإضافة وسائل الإعلام عن طريق الأنابيب ببطء وسائل الإعلام أسفل جانبي الجدران. وأخيرا، اقتراح توفير الوقت هو إعداد لوحات مع وسائل الإعلام والعلاجات قبل عملية عزل الخلايا الشحمية. خاصة بالنسبة للتصاميم التجريبية المعقدة ، يمكن أن يوفر الإعداد المسبق للأطباق الكثير من الوقت ويضمن وضع الخلايا الشحمية في الوسائط مع علاجاتها بمجرد عزلها.
فائدة واحدة من استخدام MAAC مقارنة مع التمييز preadipocytes هو أن وسائل الإعلام MAAC المستخدمة بسيطة جدا ولا تتطلب كوكتيل هرمون غير فسيزيولوجية. هنا لدينا ثقافة MAAC في وسائل الإعلام الغنية بالجلوكوز (DMEM/F12)، 10٪ FBS، 1٪ بنسلفانيا / العقدية، و 20 nM الأنسولين. الأهم من ذلك، وجدنا أن الأنسولين مطلوب تماما لrosiglitazone / pioglitazone مدفوعة تحريض UCP110. الأنسولين، ومع ذلك، ليست مطلوبة للحفاظ على النمط الظاهري الخلايا adipogenic. وهكذا ، اعتمادا على السؤال التجريبي ، يمكن تضمين الأنسولين أو حذفها.
وقد تم تحسين الإجراء المفصل أعلاه لعزل وثقافة الخلايا الشحمية البشرية. ومع ذلك ، يمكن أيضًا استزراع الماوس ، وربما الخلايا الشحمية للكائن الحي الآخر ، باسم MAAC. إذا كان للخلايا الشحمية الماوس أن تكون مثقفة كما MAAC هناك اعتبارات إضافية والاحتياطات التي ينبغي أن يوضع في الاعتبار. لقد وجدنا أن الخلايا الشحمية الناضجة من الفئران هي أكثر هشاشة بكثير من تلك التي من البشر. ونتيجة لذلك، ينبغي تقصير وقت الهضم إلى الحد الأدنى المطلق لزيادة صلاحية الخلية. وجدنا أيضًا أن الخلايا الشحمية من الفئران الصغيرة (8 أسابيع وأصغر) قدمت أقوى النتائج وأكثرها قابلية للتكرار. وأخيرا، يمكن أن يكون مثقف MAAC الماوس لمدة تصل إلى أسبوع واحد، ولكن بالنظر إلى أن النمط الظاهري adipogenic يبدو أقل استقرارا من البشر (والتي يمكن أن تكون مثقفة من خلال ما لا يقل عن أسبوعين) نوصي زراعة الماوس MAAC للحد الأدنى من الوقت المطلوب لمعالجة أسئلة تجريبية.
وبما أن نموذج MAAC يعتمد على استخدام أغشية نفاذة ، فإن إحدى مزايا هذه التقنية هي إمكانية المشاركة في زراعة الخلايا الشحمية الناضجة مع أنواع الخلايا الأخرى. لقد سبق لنا أن أظهرت قدرة الخلايا الشحمية ناضجة والضامة على التحدث عبر من خلال استخدام MAAC10. وهذا يفتح فرصا لمزيد من استكشاف الصلة بين السمنة، ومقاومة الأنسولين، والاستجابات المناعية15،16،17. يمكن أن تتضمن التجارب المستقبلية أنواع خلايا أخرى مثل خلايا الكبد أو الخلايا التوليفية أو الخلايا الفيوسلية أو خلايا البنكرياس لزيادة تعقيد نموذج MAAC وأهميته الانتقالية والتحقيق في الكلام المتبادل بين أنواع الخلايا المتعددة.
على الرغم من أن MAAC قد ثبت أن متفوقة في الحفاظ على وظائف وهوية الخلايا الشحمية نسبة إلى نماذج الخلايا الشحمية الأخرى في المختبر، كما أن لديها القيود التي تحتاج إلى النظر فيها. بالمقارنة مع استخدام الخلايا الشحمية المتمايزة عن الخلايا السليفة ، MAAC هو نموذج أكثر صعوبة وتستغرق وقتا طويلا. لوحات مع الأغشية هي أيضا أكثر تكلفة بالمقارنة مع لوحات ثقافة الخلايا العادية. الأهم من ذلك، الخلايا الشحمية ناضجة تحتاج إلى أن تكون معزولة حديثا في كل مرة عند البذر ولا يمكن توسيعها أو تجميدها في المخزونات مثل الخلايا السلائف. وبالتالي، فإن هذا يتطلب الحصول على عينات الأنسجة الدهنية البيضاء الطازجة، ولكنه يضيف أيضا مستوى من التعقيد الناجم عن الاختلافات بين المانحين والجهات المانحة.
هنا قدمنا بروتوكول مفصل لعزل الخلايا الشحمية الناضجة البشرية وإنشاء MAAC. لقد أثبتنا أن الخلايا الشحمية الثقافية كما MAAC لا تزال قابلة للحياة من خلال أسبوعين، يتم الحفاظ على توقيعالجينات adipogenic، وأنها تستجيب للآلام الدوائية المتنوعة. استخدام MAAC يسمح لدراسة عبر الحديث بيتوين adipocytes وأنواع الخلايا الأخرى، وتقييم التغيرات فينوتيبيك على المدى الطويل من الخلايا الشحمية ناضجة استجابة لمحفزات مختلفة.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر شياو رونغ بينغ وستيفان هالن لتوفير الموارد وتحسين العزلة الدهنية، ومارتن أوربوم للمساعدة التقنية، ودانيال أولاوسون ومالين لون لتنسيق وتوفير الدهنية البشرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved scissors | |||
| Autoclaved spoons | |||
| Autoclaved tweezers | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Buffer RLT | QIAGEN | 79216 | Lysis buffer |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Conical tubes, 50 mL | |||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 156-4020 | 500 mL |
| Filter flask 0.2 µm pore size, 75 mm | Thermo Scientific | 158-0020 | 1000 mL |
| HBSS+CaCl2+MgCl2 | Gibco | 14065-49 | |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Insulin (Actrapid Penfill) | Novo Nordisk A/S | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| Medium 199 | Gibco | 10012-011 | |
| Mesh filter (250 µM) | Sintab AB | 6111-025043 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Needles, 18 G, 1.20 mm x 40 mm | Sterican | 613-2948 | |
| Pencillin-Streptomycin (Penn/Strep) | Gibco | 15140 | |
| Petri dishes, 150 mm x 21 mm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| Quantstudio 7 Flex Real-Time PCR machine | Applied Biosystems | ||
| RNeasy Mini kits | QIAGEN | 74106 | |
| Separation funnel | VWR | 527-0008 | For large scale preparation |
| Separation funnel | VWR | 527-0005 | For small scale preparation |
| Shaking incubator (37 °C) | |||
| Syringes, 5 mL | Omnifix | 612-2892 | 100 st |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
| Transwells, 24-well (6.5 mm) | Costar | 3397 | Permeable membrane inserts |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 10296010 | Lysis buffer |
| Type 2 Collagenase | Worthington | LS004177 |
References
- Guilherme, A., Virbasius, J. V., Puri, V., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (5), 367-377 (2008).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Lotta, L. A., et al. Integrative genomic analysis implicates limited peripheral adipose storage capacity in the pathogenesis of human insulin resistance. Nature Genetics. 49 (1), 17-26 (2017).
- Gustafson, B., Hedjazifar, S., Gogg, S., Hammarstedt, A., Smith, U.
- Gesta, S., et al. Culture of human adipose tissue explants leads to profound alteration of adipocyte gene expression. Hormone and Metabolic Research. 35 (3), 158-163 (2003).
- Fain, J. N., Cheema, P., Madan, A. K., Tichansky, D. S. Dexamethasone and the inflammatory response in explants of human omental adipose tissue. Molecular and Cellular Endocrinology. 315 (1-2), 292-298 (2010).
- Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), e0122065 (2015).
- Asada, S., et al. Ceiling culture-derived proliferative adipocytes retain high adipogenic potential suitable for use as a vehicle for gene transduction therapy. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (1), C181-C185 (2011).
- Shen, J. F., Sugawara, A., Yamashita, J., Ogura, H., Sato, S. Dedifferentiated fat cells: an alternative source of adult multipotent cells from the adipose tissues. International Journal of Oral Science. 3 (3), 117-124 (2011).
- Harms, M. J., et al. Mature Human White Adipocytes Cultured under Membranes Maintain Identity, Function, and Can Transdifferentiate into Brown-like Adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).
- Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S.
- Ruiz-Ojeda, F. J., Ruperez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. Cell Models and Their Application for Studying Adipogenic Differentiation in Relation to Obesity: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1040 (2016).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
- Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12 (1), 15-28 (2016).
- Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease. The Journal of clinical investigation. 127 (1), 1-4 (2017).
- Lee, Y. S., Wollam, J., Olefsky, J. M.
