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Article de méthode

Modèle murin in vivo d’infection par implant rachidien

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DOI :

10.3791/60560

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23 juin 2020

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1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles, 2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

Dans cet article

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Résumé

Le protocole décrit un nouveau modèle murin in vivo d’infection par implant rachidien où un implant k-wire en acier inoxydable est infecté par Staphylococcus aureus Xen36 bioluminescent. La charge bactérienne est surveillée longitudinalement par imagerie bioluminescente et confirmée par le nombre d’unités formant colonie après euthanasie.

Résumé

Les infections des implants rachidiens laissent présager de mauvais résultats, car le diagnostic est difficile et l’éradication chirurgicale est en contradiction avec la stabilité mécanique de la colonne vertébrale. L’objectif de cette méthode est de décrire un nouveau modèle murin d’infection par implant rachidien (SII) qui a été créé pour fournir un outil in vivo peu coûteux, rapide et précis pour tester des thérapies potentielles et des stratégies de traitement pour les infections par implants vertébraux.

Dans cette méthode, nous présentons un modèle de chirurgie de la colonne vertébrale par voie postérieure dans lequel un fil k en acier inoxydable est transfigé dans l’apophyse épineuse L4 de souris de type sauvage C57BL/6J âgées de 12 semaines et inoculé avec 1 x 103 UFC d’une souche bioluminescente de la bactérie Staphylococcus aureus Xen36. Les souris sont ensuite imagées longitudinalement pour la bioluminescence in vivo les jours postopératoires 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 et 35. Les signaux d’imagerie par bioluminescence (BLI) provenant d’un champ de vision normalisé sont quantifiés pour mesurer la charge bactérienne in vivo.

Pour quantifier l’adhérence des bactéries aux implants et aux tissus péri-implantaires, les souris sont euthanasiées et l’implant et les tissus mous environnants sont prélevés. Les bactéries sont détachées de l’implant par sonication, cultivées pendant la nuit, puis les unités formant colonie (UFC) sont comptées. Les résultats obtenus à l’aide de cette méthode comprennent les numérations bactériennes longitudinales mesurées par bioluminescence in vivo de S. aureus (flux maximal moyen) et les numérations d’UFC après euthanasie.

Alors que les modèles animaux antérieurs d’infection de la colonne vertébrale instrumentée impliquaient une analyse tissulaire invasive ex vivo, le modèle murin de SII présenté dans cet article tire parti de l’imagerie optique in vivo non invasive en temps réel des bactéries bioluminescentes pour remplacer l’étude statique des tissus. Les applications du modèle sont vastes et peuvent inclure l’utilisation de souches bactériennes bioluminescentes alternatives, l’incorporation d’autres types de souris génétiquement modifiées pour étudier simultanément la réponse immunitaire de l’hôte, et l’évaluation des modalités diagnostiques et thérapeutiques actuelles ou en recherche de nouvelles telles que les antibiotiques ou les revêtements d’implants.

Introduction

L’objectif de cette méthode est de décrire un nouveau modèle murin d’infection par implant rachidien (SII). Ce modèle a été conçu pour fournir un outil peu coûteux et précis permettant d’évaluer de manière flexible l’effet des variables de l’hôte, de l’agent pathogène et/ou de l’implant in vivo. La mise à l’essai de thérapies potentielles et de stratégies de traitement pour les infections par implants rachidiens dans ce modèle vise à guider le développement de la recherche avant l’application dans des modèles animaux plus grands et des essais cliniques.

L’infection liée à l’implant après une chirurgie de la colonne vertébrale est une complication dévastatrice et survient malheureusement chez environ 3 à 8 % des patients subissant une chirurgie élective de la colonne vertébrale 1,2,3,4,5 et jusqu’à 65 % des patients subissant une chirurgie à plusieurs niveaux ou une chirurgie de révision6. Le traitement des infections par implants rachidiens nécessite souvent de multiples hospitalisations, de multiples interventions chirurgicales et une antibiothérapie prolongée. Les SII laissent présager de mauvais résultats pour les patients, notamment une atteinte neurologique, une invalidité et un risque accru de mortalité. La prise en charge de l’IS est extrêmement coûteuse, coûtant plus de 900 000 $ par patient7.

Staphylococcus aureus est l’agent pathogène virulent le plus courant du SII 8,9,10,11. Les bactéries peuvent ensemencer le matériel directement pendant la chirurgie, à travers la plaie pendant la période postopératoire ou plus tard via la propagation hématogène. En présence d’implants métalliques, S. aureus forme un biofilm qui protège les bactéries de l’antibiothérapie et les cellules immunitaires. Bien que l’élimination du matériel infecté puisse aider à éradiquer efficacement une infection, cela n’est souvent pas possible dans la colonne vertébrale sans provoquer de déstabilisation et risquer une atteinte neurologique12.

En l’absence d’explantation de matériel infecté, de nouvelles approches sont nécessaires pour prévenir, détecter et traiter le SII. Historiquement, il y a eu peu de modèles animaux de SII pour évaluer efficacement l’innocuité et l’efficacité de nouvelles thérapies. Les modèles animaux antérieurs de SII nécessitaient un grand nombre d’animaux et la collecte de points de données nécessitant l’euthanasie, y compris le comptage des colonies, l’histologie et la culture13,14,15. En l’absence d’un suivi longitudinal in vivo, ces modèles ne fournissent qu’un seul point de données par animal et sont donc coûteux et inefficaces.

Des travaux antérieurs portant sur un modèle murin d’infection par arthroplastie du genou ont permis d’établir la valeur et la précision de l’imagerie optique in vivo non invasive pour surveiller longitudinalement la charge de l’infection16. La détection de la bioluminescence permet de quantifier la charge bactérienne sur une période longitudinale chez un seul animal de manière humaine, précise et efficace. De plus, des études antérieures ont démontré une forte corrélation entre la bioluminescence in vivo et l’adhérence des UFC aux implants17. La capacité de suivre l’infection au fil du temps a conduit à une compréhension plus nuancée de l’infection liée à l’implant. De plus, le suivi de l’infection longitudinale de cette manière a permis d’évaluer avec précision l’efficacité de l’antibiothérapie et des nouveaux antimicrobiens16,17,18.

En nous appuyant sur ces outils, nous avons développé et validé un modèle d’infection postopératoire des implants rachidiens. Dans la méthode présentée, nous utilisons un inoculum de S. aureus Xen36 bioluminescent pour établir un modèle murin in vivo de SII afin de surveiller longitudinalement la charge bactérienne16,17,18. Ce nouveau modèle fournit un outil précieux pour tester efficacement les stratégies potentielles de détection, de prévention et de traitement de l’IS avant leur application dans des modèles animaux et des essais cliniques de plus grande envergure.

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Protocole

Tous les animaux ont été manipulés en stricte conformité avec les bonnes pratiques animales telles que définies dans les règlements fédéraux tels qu’énoncés dans la Loi sur le bien-être des animaux (AWA), le Guide de 1996 pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, la Politique de PHS pour le soin et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire, ainsi que les politiques et procédures de l’établissement telles qu’énoncées dans le Manuel de formation sur le soin et l’utilisation des animaux. et tous les travaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité de recherche sur les animaux (ARC) du chancelier de l’Université de Californie à Los Angeles.

1. Choix de la souche bioluminescente de S. aureus

  1. Utilisez la souche bioluminescente de S. aureus Xen36 comme inoculum d’intérêt.
    REMARQUE : Cette souche est dérivée de la souche parentale S. aureus ATCC-49525, qui est un isolat clinique provenant d’un patient septique. S. aureus Xen36 utilise de manière unique un opéron ABCDE de lux, qui est optimisé et intégré dans le plasmide natif de l’hôte. 19 En conséquence, la souche Xen36 est capable de produire une lumière bioluminescente bleu-vert avec une émission de longueur d’onde maximale de 490 nm. Ce signal d’émission n’est produit que par des organismes bactériens vivants métaboliquement actifs.

2. Préparation de S. aureus pour l’inoculation

  1. Ajouter 200 μg/mL de kanamycine au bouillon Luria et 1,5 % de gélose pour isoler S. aureus Xen36 des contaminants potentiels, en utilisant le gène de résistance à la kanamycine lié à l’opéron lux 19.
  2. Filtrer la bactérie S. aureus Xen36 sur des plaques de gélose tryptique de soja (bouillon de soja tryptique [TSB] plus gélose à 1,5 %) et incuber à 37 °C pendant 12 à 16 h.
  3. Isoler des colonies isolées de S. aureus Xen36 et les cultiver individuellement dans le BST pendant 12 à 16 h à 37 °C dans un incubateur à agitation (200 tr/min).
  4. Diluer la culture résultante dans un rapport de 1 :50.
  5. Cultiver pendant 2 h supplémentaires à 37 °C pour isoler les bactéries de la phase médio-logarithmique.
  6. Granulés, remettre en suspension et laver les bactéries dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) trois fois.
  7. Mesurer l’absorbance à 600 nm. Le OD600 idéal se situe entre 0,700 et 0,750, ce qui correspond à 4x105 UFC/mL. Effectuer des dilutions en série pour obtenir l’inoculum bactérien souhaité (1 x 103 UFC/2 μL).
    REMARQUE : La concentration optimale de Xen36 pour l’établissement d’une infection chronique s’est avérée être de 1 x 103 UFC. Une dose plus faible de bactéries a été éliminée par le système immunitaire de l’hôte et une dose plus élevée a provoqué une dégradation de la plaie. La rupture de la plaie ne fait pas la différence entre une infection implantaire profonde et une infection superficielle de la plaie et est donc évitée dans ce modèle (Figure 1)20.

3. Souris

  1. Utilisez des souris mâles de type sauvage C57BL/6J âgées de 12 semaines.
  2. Souris domestiques dans des cages avec un maximum de 4 à la fois.
  3. Gardez de l’eau disponible en tout temps. Maintenez un cycle lumière/obscurité de 12 heures et n’effectuez pas d’expérimentation pendant la phase sombre du cycle.
  4. Utilisez de la nourriture sans luzerne pour l’alimentation en raison des interférences potentielles avec la signalisation fluorescente.
  5. Demandez au personnel de recherche ou au personnel vétérinaire d’évaluer quotidiennement les souris pour s’assurer du bien-être des animaux tout au long de l’expérience.

4. Interventions chirurgicales chez la souris

  1. Induire l’anesthésie en plaçant les souris dans une chambre d’isoflurane (2 %) pendant environ 5 minutes. Confirmez la profondeur appropriée de l’anesthésie en surveillant les respirations pour qu’elles restent rythmées et plus lentes que lorsqu’elles sont éveillées et qu’elles ne changent pas en réponse à des stimuli nocifs (p. ex., manipulation chirurgicale, pincement des orteils).
  2. Transférez les souris anesthésiées dans une station de préparation et enlevez les poils du sacrum à la colonne thoracique supérieure à l’aide d’une tondeuse pour rongeurs.
  3. Nettoyez et stérilisez la peau avec trois lavages d’une solution alternée de bétadine et d’alcool isopropylique.
  4. Transférer les souris anesthésiées et stérilisées en position couchée sur un lit chirurgical stérile en maintenant l’anesthésie avec l’administration d’isoflurane inhalé (2 %) par cône nasal.
  5. Fléchissez au maximum les hanches et identifiez la position du genou au niveau de la colonne vertébrale pour vous rapprocher du corps lombaire 4 vertébral.
  6. Faites une incision longitudinale de 2 cm à travers la peau avec un scalpel chirurgical à 15 lames.
  7. Palpez les apophyses épineuses pour confirmer la ligne médiane et continuez l’incision jusqu’à l’os.
  8. Disséquer sous-périostée sur le côté droit de l’apophyse épineuse L4, en s’étendant latéralement jusqu’à l’apophyse transverse.
  9. Passez une suture tressée résorbable de taille 5-0 céphalade et caudade sur le corps L4 à travers le fascia et laissez ouvert, en préparation d’une fermeture future.
  10. À l’aide d’une aiguille spinale de 25 G, alésez l’apophyse épineuse de L4 à l’aide d’une aiguille spinale de 25 G et insérez un implant en acier inoxydable de qualité chirurgicale en forme de « L » de 0,1 mm de diamètre et de 1 cm de long le long de la lame avec le long bras de la céphalade de pose.
  11. Inoculez l’implant avec 1 x 103 UFC/2 μL de S. aureus Xen36 bioluminescent, en prenant soin de s’assurer que toute la solution entre en contact avec l’implant.
  12. Attendez environ 10 secondes avant de nouer la suture résorbable précédemment passée après l’inoculation pour assurer le confinement de l’inoculum sur l’implant.
  13. Fermez la peau en courant avec une suture résorbable.
  14. Administrer un analgésique par injection sous-cutanée de buprénorphine (0,1 mg/kg) immédiatement à l’arrêt, puis toutes les 12 heures pendant 3 jours par la suite.
  15. Récupérez les souris sur un coussin chauffant et surveillez le retour à une activité normale.
  16. Obtenir des radiographies postopératoires pour confirmer la mise en place appropriée de l’implant.

5. Imagerie longitudinale in vivo par bioluminescence pour mesurer la charge bactérienne

  1. Anesthésier les souris avec de l’isoflurane inhalé (2 %). Confirmez la profondeur appropriée de l’anesthésie en surveillant les respirations pour qu’elles restent rythmées et plus lentes que lorsqu’elles sont éveillées et qu’elles ne changent pas en réponse à des stimuli nocifs (p. ex., manipulation chirurgicale, pincement des orteils).
  2. Enlevez les poils du sacrum à la colonne thoracique supérieure avec une tondeuse à rongeurs.
  3. Chargez des souris sur le champ de vision de la plate-forme d’imagerie bioluminescente pour effectuer une imagerie par bioluminescence in vivo (BLI)19.
  4. Capturez le signal bioluminescent sur un temps d’acquisition de 5 minutes. Utilisez de grands paramètres de regroupement avec un champ de vision de 15 cm (B).
  5. Répétez les étapes 5.1 à 5.4 les jours postopératoires 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 et 35 (ou d’autres jours en fonction d’un plan expérimental spécifique) pour surveiller la charge bactérienne.
  6. Présentez les données BLI à l’aide d’une échelle de couleurs et superposez-les sur une photographie en niveaux de gris. Isolez une région ovoïde d’intérêt (ROI) standard à l’aide du logiciel BLI pour quantifier le BLI en flux total (photons par seconde) ou en flux maximum moyen (photons/seconde/centimètre2/stéradian).

6. Quantifier les bactéries adhérentes aux implants et aux tissus environnants

  1. Euthanasier les souris à la POD 35 ou à une autre date postopératoire de votre choix en cas d’exposition au dioxyde de carbone conformément aux directives de l’AVMA. Confirmer l’euthanasie avec luxation cervicale secondaire.
  2. Stérilisez la peau dorsale selon l’étape 4.3 et placez la souris sur le ventre sur un champ chirurgical stérile.
  3. Inciser nettement l’incision précédente à l’aide d’un scalpel chirurgical à 15 lames.
  4. Utilisez des ciseaux stériles pour disséquer sans ménagement l’apophyse épineuse L4 et identifier l’implant chirurgical.
  5. Utilisez un tournevis à aiguille pour tordre doucement et retirer l’implant de sa position dans le processus épineux L4.
  6. À l’aide d’une pince et de ciseaux stériles, prélever environ 0,1 g d’os et de tissus mous de l’apophyse épineuse entourant immédiatement l’implant chirurgical et placer 1 mL de PBS dans un petit tube rhinocéros conique avec 4 billes d’homogénéisation pointues.
  7. Enregistrez le poids des tissus mous en pesant le tube conique avant et après la récolte.
  8. Placer l’implant dans 0,5 mL de Tween-80 à 0,3 % dans du TSB et soniser pendant 15 min.
  9. Vortex la suspension de l’implant résultant pendant 2 min et culture pendant la nuit pendant 12-16 h.
  10. Homogénéiser les tissus mous et les apophyses épineuses préalablement placés dans 1 ml de PBS entourant l’implant à l’aide d’un homogénéisateur.
  11. Vortex la suspension des tissus mous résultante pendant 5 min et culture pendant la nuit pendant 12 à 16 h.
  12. Après une culture pendant la nuit, comptez l’UFC de l’implant et des tissus environnants, respectivement. Exprimez la valeur en UFC/g total récolté pour les tissus mous et en UFC/mL pour l’implant sonique.

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Résultats

La procédure présentée ici a été utilisée pour évaluer l’efficacité des régimes antibiotiques dans un modèle murin in vivo de SII. Plus précisément, l’efficacité de l’antibiothérapie combinée à la vancomycine et à la rifampicine a été comparée à celle de la vancomycine en monothérapie et à celle de témoins infectés non traités.

Avant la chirurgie, les souris ont été randomisées pour recevoir une thérapie combinée, une monothérapie ou un contrôle infecté. Une analyse statistique de la puissance...

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Discussion

Les infections liées aux implants dans la colonne vertébrale laissent présager de mauvais résultats pour les patients 1,2,3,4,5. Contrairement à de nombreuses autres zones du corps, le matériel infecté de la colonne vertébrale ne peut souvent pas être retiré en raison du risque d’instabilité et de compromission neurologique. Ce défi unique dans le contexte des...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier la personne qui a reçu la subvention de la colonne vertébrale biologique de la Pediatric Orthopaedic Society of North America et la subvention KL2 de l’Institut des sciences cliniques et translationnelles des National Institutes of Health, ainsi que la subvention de recherche chirurgicale HH Lee en tant que sources de financement majeures pour ces expériences.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Balance analytique ME104Mettler Toledo30029067capacité de 120 g, précision d’affichage de 0,1 mg, écran LCD rétroéclairé, réglage interne, base métallique
BD Bacto Tryptic Bouillon de sojaBecton Dickinson (BD)BD 211825BD Bacto Tryptic Bouillon de soja (milieu de digestion de caséine de soja)
Spectrophotomètre UV-VIS Biomate 3SThermo Scientific840-208300Spectrophotomètre; Thermo Scientific ; BioMate 3S ; Support de cellule à six positions ; Bande passante spectrale : 1,8 nm ; Lampe au xénon longue durée ; Stocker jusqu’à 40 méthodes d’essai ; 16 x 13 x 9 po H; 19 livres ; Cordon d’alimentation 100/240V US
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conçu et construit pour réussir le test de validation de la suspension de spores de stérilisateur sec : USP XXIII, Part 1211.
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PBS, Phosphate Saline TamponnéBioréactifsBP24384PBS, Phosphate salin tamponné, 1X Solution, pH 7,4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifugeuse, VentiléThermo Scientific7500243624 x 1,5/2,0mL Rotor avec couvercle de bioconfinement ClickSeal
SORVALL LEGEND X1R 120V CentrifugeuseThermo Scientific75004261centrifugeuse, de paillasse ; Thermo Scientific ; Sorvall Legend X1R (réfrigéré), capacité de 1 L ; Vitesse max./RCF 15 200 tr/min/25 830 x g ; Refroidissement sans CFC -10C à +40C ; Bactéries pathogènes bioluminescentes 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36Perkin Elmer119243Staphylococcus aureus - Xen36 pour la découverte de médicaments in vivo et in vitro. Ce produit est dérivé d’une souche parentale de l’American Type Culture Collection, utilisée sous licence. Staphylocoque. aureus-Xen36 possède une copie stable de l’opéron Photorhabdus luminescens lux sur le plasmide natif.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120VHeidolph Tuttnauer23210401Stérilisateur, de paillasse ; Heidolph ; Tuttnauer ; Modèle 2540E ; La conception autonome avec réservoir rechargeable contrôle la pureté de l’eau pour la stérilisation ; 120V 50/60Hz ; 1400w. Avec commandes électroniques
Tween 80Fisher BioreagentsBP338-500Tween 80, Fisher BioReagents, détergent non ionique pour l’extraction sélective des protéines
Mélangeur vortex VX-200 MélangeurLabnet InternationS0200120V, 230V : 0 - 2 850 tr/min, 120V : 0 - 3 400 tr/min Chlorure
de sodium 0,9 % PfizerInjectables/Hospira00409-4888-10Chlorure de sodium injectable à 0,9 %, USP
unique 150L , Fisher tactile ou continu

Références

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Erratum


Formal Correction: Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection
Posted by JoVE Editors on 5/05/2023. Citeable Link.

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Benjamin V. Kelley1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

to:

Benjamin V. Kelley1
Christopher Hamad1
Stephen D. Zoller1
Danielle Greig1
Zeinab Mamouei1
Rene Chun1
Kellyn Hori1
Nicolas Cevallos1
Chad Ishmael1
Peter Hsiue1
Rishi Trikha1
Troy Sekimura2
Brandon Gettleman3
Autreen Golzar2
Adrian Lin2
Thomas Olson2
Ameen Chaudry2
Michael M. Le2
Anthony A. Scaduto1
Kevin P. Francis1
Nicholas M. Bernthal1
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

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