Obtenir des données transcriptome de haute qualité à partir de graines de céréales par une méthode modifiée pour le profilage de l’expression génique

Le transcriptome représente l’ensemble complet des transcriptions d’acide ribonucléique (ARN) exprimées par le génome d’un organisme à un moment donné et en particulier les conditions environnementales et de croissance. Chaque cellule a son transcriptome individuel, qui reflète son état physiologique et métabolique actuel. Une collection de cellules dérivées d’un tissu ou d’un organe similaire est utilisée dans une étude typique de transcriptome, mais les transcriptomics à cellule unique et spatialement résolues deviennent populaires¹. Les analyses transcriptomiques commencent par l’extraction de l’ARN total à partir d’un tissu sélectionné à un moment précis, et dans des conditions de croissance définies. À cette fin, nous recommandons l’utilisation d’une méthode nouvellement développée pour l’extraction de l’ARN total à partir d’échantillons riches en amidon ou en sucre, tels que les graines de céréales². La comparaison des transcriptomes entre différents échantillons entraîne l’identification de molécules d’ARN avec une abondance différente. Ces molécules d’ARN sont considérées comme des gènes exprimés différemment (DEG). L’abondance de transcriptions dérivées de gènes marqueurs spécifiques peut alors être utilisée pour estimer l’état du développement ou déterminer la réponse d’un organisme aux fluctuations environnementales. Les gènes qui n’ont aucun changement détectable dans leur abondance de transcription à travers les points de temps de développement à l’étude sont souvent utilisés comme gènes de référence ou d’entretien ménager.

L’ARN est généralement détecté et quantifié par diverses méthodes, telles que le ballonnement du Nord et la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse (qRT-PCR), mais les méthodes actuelles de transcriptomique à haut débit reposent fortement sur l’hybridation de l’acide nucléique à l’aide de la technologie de microrésorité ainsi que du séquençage de l’ARN (ARN-Seq). RNA-Seq est très populaire à l’heure actuelle parce qu’il fournit plusieurs avantages pour les applications transcriptomiques à haut débit comme examiné ailleurs^3,4. Bien qu’une technologie plus ancienne, le profilage d’expression génique à l’aide de puces microarray est encore largement utilisé parce qu’il s’agit d’une technologie plus établie, qui nécessite moins d’une formation en bioinformatique. Par rapport à l’ARN-Seq, les ensembles de données générés par les expériences de microrésion sont plus petits et plus faciles à analyser. En outre, il est plus rentable, surtout s’il s’agit de grands nombres d’échantillons. Dans notre laboratoire, nous utilisons régulièrement des analyses transcriptomiques à l’aide de la technologie de microrésion pour déterminer le rôle des centres de réglementation centraux qui régissent les réseaux moléculaires et les voies impliquées dans la croissance, le développement et le métabolisme des céréales^5,6,7,8,9. Nous l’utilisons également régulièrement pour mener des études de profilage d’expression génique à l’échelle du génome afin d’obtenir une compréhension mécaniste de la réponse des céréales aux stress abiotiques¹⁰, ainsi que dans la conduite de l’association à l’échelle du transcriptome (TWAS) et des études de cartographie de liaison pour identifier les gènes responsables de la qualité des céréales et de la nutrition^11,12. D’autres groupes ont également utilisé la technologie de micro-array pour fournir l’atlas d’expression génique spécifique au développement dans l’orge¹³, le riz^14,15,16, le sorgho¹⁷, et le blé¹⁸.

Le but de cette publication est de fournir un bref résumé textuel et une description visuelle détaillée de la méthode que nous employons actuellement dans notre laboratoire pour le profilage transcriptomique des céréales à l’aide d’une plate-forme de microrésion agile. Veuillez noter que d’autres plates-formes de microrésarroie sont disponibles, mais ne seront pas couvertes par cette méthode. Nous commençons le protocole en présentant une description détaillée de l’extraction de l’ARN à partir de la mise au point ou de la germination des graines de céréales. D’après notre expérience, l’obtention d’un transcriptome de haute qualité et de haute quantité prêt à des analyses transcriptomiques en aval est souvent le goulot d’étranglement lors de l’utilisation des tissus de graine. Nous avons essayé plusieurs kits d’extraction d’ARN disponibles dans le commerce, mais aucun n’a fourni des résultats satisfaisants. Par conséquent, nous avons développé un protocole d’extraction chimique pour obtenir un extrait d’ARN brut qui est ensuite soumis à la purification de colonne utilisant un kit disponible dans le commerce. En utilisant cette méthode, nous obtenons régulièrement et de façon reproductible ARN² (figure 1), qui peut être utilisé pour différentes applications en aval pour générer un profil transcriptome.

1. Extraction et purification totales de l’ARN

REMARQUE : Travaillez toujours sous le capot de fumée car cette méthode implique l’utilisation de solvants organiques volatils nocifs. Préchauffer un tube de microfuge d’eau sans nucléase dans un bloc thermique de 50 oC avant de commencer l’expérience. Cette eau sans nucléase sera utilisée pour éléter l’ARN total de la colonne de spin dans l’étape 1.8.

1. A broyer séparément les échantillons, chacun avec au moins trois répliques biologiques, dans une poudre fine à l’aide d’un mortier stérilisé et de pilon qui sont pré refroidis dans de l’azote liquide.
   1. Scoop les échantillons en poudre à l’aide d’une petite spatule métallique trempée dans de l’azote liquide et placer les échantillons en poudre dans des tubes de microfuge sans nucléase de 2,0 ml, également pré trempés dans de l’azote liquide. Conservez immédiatement les échantillons dans un congélateur à température ultralow (-80 oC) jusqu’au jour alloué à l’extraction par l’ARN en lots (STOP POINT).
      REMARQUE : Les échantillons de graines peuvent être broyés en poudre fine avec ou sans dhusking. Pour le riz, nous broyons régulièrement les échantillons sans se défasserer parce que l’enveloppe contient de la silice qui peut aider pendant le processus de broyage.
      AVERTISSEMENT: Cette étape doit être faite rapidement et dans des conditions strictement cryogéniques. Une option pour l’automatisation est de broyer les échantillons à l’aide d’une usine à billes cryogénique pour minimiser la dégradation de l’ARN et la détérioration de la qualité.
2. Obtenez un extrait d’ARN brut à l’aide d’environ 200 mg de l’échantillon en poudre d’origine. Ajouter chaque échantillon à un tube de microfuge sans nucléase contenant 750 ll de tampon d’extraction d’ARN (100 mM Tris, pH 8,0, 150 mM LiCl, 50 mM EDTA, 1,5% SDS, 1,5% 2-mercaptoethanol) et 500 'L de phénol:chloroform:isoamyl (25:24:1).
   1. Mélanger tous les échantillons en même temps pendant 5 minutes à température ambiante à l’aide d’un mélangeur à vortex multi-tube réglé à grande vitesse. Gardez immédiatement tous les tubes sur la glace pendant deux minutes.
      CAUTION: Travaillez toujours à l’intérieur du capot de fumée, en particulier pour toutes les étapes impliquant le phénol, le chloroforme et d’autres solvants organiques. Idéalement, utilisez un hotte à fumée large qui peut accueillir une centrifugeuse de banc, un mélangeur de vortex, un mélangeur de vortex multi-tube et un mélangeur rotatif multi-tube.
3. Séparer l’extrait brut d’ARN des débris par centrifugation à 14 000 x g pendant 10 min. Faites toutes les étapes de centrifugation dans les mêmes paramètres pour cette section.
   1. Transférer environ 800 L de supernatant dans un nouveau tube de microfuge de 2,0 ml contenant 400 L de 1,2 M NaCl et 700 l d’isopropanol. Mélanger la solution doucement par inversion 5x.
   2. Précipiter l’ARN en incuber dans un congélateur régulier (-20 oC) ou à température ultralow (-80 oC), pendant au moins 1 h (ou toute la nuit).
      Point STOP ou PAUSE : il suffit de garder les échantillons dans un congélateur régulier de -20 oC pour faire une pause de quelques heures. Pour la nuit ou un point d’arrêt plus long, conservez les échantillons dans un congélateur à température ultra-douce (-80 oC).
4. Obtenez une granule d’ARN brut par centrifugation à 18 800 x g pendant 15 min. Après avoir jeté le supernatant, purifier la boulette d’ARN brut par purification de colonne à l’aide d’un Mini Kit(Tableau des matériaux).
   1. Dissoudre la granule dans 450 L fraîchement préparé de RLT Buffer (avant utilisation, ajouter 100 L de mercaptoethanol par tampon RLT de 100 ml, préparé frais tous les jours). Améliorer la dissolution de toutes les granulés en mélangeant tous les tubes à température ambiante dans un mélangeur à vortex multi-tube pendant au moins 5 minutes.
5. Purifier la pastille d’ARN dissoute en passant par la colonne de mini-spin violet avec un tube de collecte de 2 ml. Centrifugeuse à température ambiante pendant 1 min à 9 000 x g et jeter la colonne de mini-spin pourpre.
   1. Ajouter 0,5 volume d’éthanol absolu (225 ll) au lysate effacé dans le tube de collecte de 2 ml. Mélanger la solution à l’aide de la même pointe en plastique en passant de haut en bas à quelques reprises.
6. Recueillir l’ARN purifié en transférant immédiatement la solution à une colonne rose mini spin avec un tube de collecte de 2 mL. Centrifugeuse à 9 000 x g pour 15 s pour recueillir l’ARN sur la membrane de silice de la colonne de spin min rose. Jetez le flux à travers et lavez l’ARN avec 350 L de Tampon RW1 par centrifugation à 9.000 x g pour 15 s.
7. Enlever l’ADN génomique contaminant en ajoutant 80 l de DNase diluée 1 (50 l de stock de DNase congelés à 350 lL de RDD à l’aide de l’ensemble DNase) directement sur la membrane et digérer en incuber à température ambiante pendant au moins 15 minutes (POINT PAUSE).
   1. Laver le DNase 1 en ajoutant 350 L de RW1 et en tournant vers le bas à 9.000 x g pour 15 s. Répétez deux fois, mais cette fois laver avec 500 'L de Tampon RPE. Transférer dans un nouveau tube de collecte de 2 ml et tourner à 9 000 x g pendant 2 minutes pour sécher.
8. Transférer la colonne de spin séchée dans un nouveau tube de collection sans nucléase de 1,5 mL. Commencez le processus d’elution de l’extrait d’ARN purifié en ajoutant 50 L d’eau sans nucléase (pré-réchauffer à 50 oC) et en incuber pendant 3 min à 50 oC.
   1. Après l’incubation, elute l’extrait total d’ARN en centrifugant à 9 000 x g pendant 1 min. Placez immédiatement tous les échantillons sur la glace.
9. Déterminer la quantité et la qualité de l’extrait total d’ARN en exécutant des dilutions appropriées (habituellement 1:10) dans Nanodrop et BioAnalyzer en utilisant leurs protocoles de fabricant respectifs. Les extraits d’ARN devraient au moins avoir une valeur RIN de 8,0 et une concentration de 50 ng/L. La figure 1 montre un résultat typique pour les extraits d’ARN obtenus à partir de feuilles d’orge et de graines.
   POINT STOP : Conservez les échantillons à -80 oC jusqu’à l’utilisation.

2. synthèse de l’ADNC suivie de la transcription et de l’étiquetage de l’ARN

REMARQUE : Cette étape convient au traitement simultané de 24 échantillons. Il est suggéré que l’étape entière se déroule en continu en une journée, mais les points d’arrêt et de pause optionnels sont identifiés. Assurez-vous de préchauffer trois blocs de chaleur du tube de microfuge à 80 oC, 65 oC et 37 oC avant de commencer les marches ci-dessous. Ces réglages de température seront modifiés comme indiqué dans les étapes ci-dessous. Par exemple, le bloc thermique de 37 oC sera réglé à 40 oC après la préparation du Spike Mix (ou s’il a déjà été préparé). Préparez spike Mix, T7 Promoter Mix et cDNA master mix à l’aide du kit d’étiquetage de l’expression des gènes amplifiants à faible entrée (voir Tableau des matériaux)sur la base des instructions du fabricant. Cette préparation dépend de la quantité d’extraits d’ARN de départ, qui vont généralement de 10 à 200 ng pour l’ARN total ou 5 ng pour l’ARN PolyA. Nous utilisons régulièrement 50 ng ARN total comme matériau de départ pour l’hybridation de microrésons² et pour la méthode qui sera décrite ci-dessous. Lors de la préparation d’un mélange principal pour 24 échantillons, ajoutez 2 réactions supplémentaires pour tenir compte des variations de tuyauterie. Utilisez toujours des tubes de microfuge sans nucléase et de l’eau sans nucléase dans cette étape.

1. En raison d’un rendement élevé, diluez généralement l’extrait d’ARN 100 fois pour s’adapter dans la gamme 50-100 ng. D’après les résultats de la quantification de l’ARN à l’étape 1.9, faites une dilution de 1:100 en ajoutant 1 l d’extrait d’ARN purifié à 99 L d’eau sans nucléase dans un tube de microfuge de 1,5 mL. Déterminer la concentration réelle de cette dilution à l’aide d’une nanodrop.
   1. Faire une deuxième dilution de chaque échantillon total d’ARN dans un tube de microfuge de 1,5 mL pour faire 50 ng d’ARN total dans un volume final de 1,5 lL. Conserver tous les échantillons sur la glace.
2. Préparer le Spike Mix à partir des instructions du fabricant. Cette étape est également résumée dans l’année 2019^2019. Utilisez un bloc thermique de 37 oC pour cela. Conserver la première et la deuxième dilution du mélange de pointe d’une couleur dans un congélateur à température ultralow (-80 oC) et ne passer que par huit cycles répétés de gel/dégel.
   1. Préparer la troisième et quatrième dilution fraîche tous les jours. Décongeler et conserver la troisième et quatrième dilution du mélange de pointe sur la glace avant utilisation.
      REMARQUE : Convertir la température du bloc thermique de 37 oC à 40 oC lorsque le mélange Spike a été préparé (ou s’il a été préparé auparavant).
3. Préparer le mélange de promoteur T7 et entreposer sur la glace avant l’utilisation. Ce qui suit est suffisant pour 24 échantillons :
   20.8 L de l’apprêt promoteur T7
   26,0 L d’eau sans nucléase
   46,8 L du volume total T7 Promoter Mix
4. Ajouter 1,8 L de T7 Promoter Primer Mix (étape 2.3) dans chaque tube de microfuge contenant 1,5 L de 50 ng d’échantillon d’ARN de l’étape 2.1. Mélanger correctement les composants en faisant du tuyauterie plusieurs fois. Denature le mélange modèle-primer d’ARN en incuber dans le bloc de chaleur de 65 oC pendant 10 min. Placez immédiatement les tubes de microfuge sur la glace en vue de la prochaine étape.
5. Tout en dénaturant le mélange de modèle-primer (étape 2.4), préchauffez le 5x First Strand Buffer à 80 oC pendant au moins 4 min. Préparez rapidement le Master Mix de synthèse de l’ADN à partir du kit d’étiquetage rapide à faible entrée (voir tableau des matériaux) sur la base des instructions du fabricant. Ce qui suit est suffisant pour 24 réactions :
   52.0 L de 5x First Strand Buffer pré-réchauffé (étape 2.5)
   26,0 L de 0,1 M TNT
   13,0 L de mélange dNTP de 10 mM
   31.2 'L de RNase Block Mix
   122,2 L de volume total cDNA synthèse Master Mix
   1. Décongeler chaque composant sur la glace. Mélanger chaque composant en faisant de la tuyauterie douce. Conserver le Master Mix à température ambiante avant l’utilisation.
      CAUTION : Le mélange de bloc RNase doit être immédiatement remis dans le congélateur de -20 oC après utilisation.
6. Retirez brièvement le mélange modèle-primer de l’ARN sur la glace (étape 2.4) et la centrifugeuse à température ambiante pour faire tourner tout le contenu au fond du tube de microfuge. Distribuer 4,7 l de la cDNA Master Mix (étape 2.5) à chaque tube, en mélangeant soigneusement en tuyautant de haut en bas. Le volume total lorsque tous les composants sont ajoutés doit être de 8,0 l.
   1. Synthèse de l’ADNC pendant 2 h dans un bloc thermique de 40 oC. Pendant l’incubation de 2 h, déplacez la température du bloc thermique de 65 oC à 70 oC en vue de l’inactivation de la chaleur (étape 2.7).
      POINT PAUSE OPTIONAL : Entreposez les échantillons à -80 oC pendant la nuit. L’expérience peut se poursuivre le lendemain après l’inactivation de la chaleur (étape 2.7).
7. Incuber chaque tube dans un bloc thermique de 70 oC pendant 15 minutes pour activer le mélange de bloc RNase. Transférer les tubes sur la glace immédiatement et incuber pendant au moins 5 minutes.
8. Pendant que les échantillons sont sur la glace pendant 5 min (étape 2.7), préparez rapidement le mélange principal de transcription. Tous les composants peuvent être combinés à température ambiante, mais décongeler les composants sur la glace. Ce qui suit est suffisant pour 24 échantillons :
   19.5 L d’eau sans nucléase
   83,2 L de 5x Transcription Buffer
   15,6 L de 0,1 M TNT
   26,0 L de mélange NTP
   Mélange de polymérase T7 RNA
   6,2 L de Cyanine 3-CTP (Cy3)
   156,0 L du volume total Transcription Master Mix
   CAUTION : Le mélange de polymérase à ARN T7 doit être conservé dans le congélateur de -20 oC et remis immédiatement après utilisation. De plus, Cy3 est sensible à la lumière. Par conséquent, le mélange (étape 2.9) et la distribution (étape 2.10) doivent être effectués dans des conditions de faible luminosité. Pour cela, nous éteignent habituellement toute lumière directement au-dessus du banc de laboratoire.
9. Comme les tubes ont été soumis à un chauffage et un refroidissement brusques (étape 2.7), tournez brièvement le contenu de chaque échantillon à l’aide d’une microcentrifugeuse pour recueillir tout le liquide au fond de chaque tube de microfuge. Ajouter 6 L de Transcription Master Mix (étape 2.8) en faisant doucement de la canalisation de haut en bas. Le volume total de cette réaction devrait être de 16 l à ce stade. Incuber les tubes à 40 oC pendant 2 h pour générer l’ARN Cy3..
   POINT D’ARRÊT FACULTATIF : Les tubes peuvent être stockés à -80 oC après transcription.
10. Tout en générant l’ARN (étape 2.9), fixez la température du bloc de chaleur à 55 oC. Ajouter au moins un tube de microfuge d’eau sans nucléase dans le bloc de chaleur. Cette eau sans nucléase sera utilisée pour l’elution de l’ARN purifié.
11. Après la transcription et l’étiquetage de l’ARN, purifiez l’ARN étiqueté à l’aide d’un mini kit RNeasy tel que détaillé dans l’étape 3.

3. Purification cRNA

1. Purifiez l’ARN étiqueté à l’aide d’un mini kit RNeasy (voir Tableau des matériaux). Préparer les tampons en fonction des instructions du fabricant. Par exemple, l’APR Buffer est fourni dans le kit sous forme concentrée. Avant l’utilisation, ajoutez 4 volumes d’éthanol absolu de grade de biologie moléculaire (96-100 %).
2. Ajouter 84 L d’eau sans nucléase à chaque échantillon pour ajuster le volume total à 100 L. Ajoutez ensuite 350 L d’éthanol absolu de tampon et 250 l d’éthanol absolu à chaque tube. Mélanger soigneusement en tuyautant.
3. Transférer 700 L de chaque mélange sur une mini colonne de spin avec un tube de collecte de 2 ml. Recueillir l’ARN étiqueté sur la membrane par centrifugation à 4 oC pour 30 s à 7 534 x g. Jetez le liquide d’écoulement.
4. Laver chaque échantillon dans 500 l de tampon RPE. Centrifugeuse et rejet de flux-through comme dans l’étape précédente. Répétez cette étape une fois, puis passez à l’étape suivante.
5. Transférer la mini colonne de spin dans un nouveau tube de collecte. Séchez les échantillons par centrifugation comme dans l’étape 3.3.
6. Transférer la mini colonne de spin dans un tube de microfuge de 1,5 mL sans nucléase qui est fourni avec le kit. Elute chaque échantillon d’ARN étiqueté en ajoutant 30 L d’eau sans nucléase (pré-réchauffé à 55 oC) directement dans le filtre à membrane. Améliorer l’elution en incuber dans un bloc thermique de 55 oC pour 60 s.
7. Recueillir l’ARN étiqueté par centrifugation à température ambiante pour 30 s à 7 535 x g. Jetez la colonne de spin et fermez chaque tube de microfuge. Placez immédiatement chaque tube sur la glace.
   POINT D’ARRÊT FACULTATIF : Les échantillons peuvent être stockés à -80 oC après l’elution.
8. Quantifier l’ARN avec Nanodrop à l’aide de la fonction de microrésarroie. Réglez l’échantillon à l’ARN-40. Obtenez les valeurs et les records suivants dans une feuille de calcul : concentration de cyanine 3 teinture (pmol/L), taux d’absorption de l’ARN (260 nm/280 nm) et concentration d’ARN (ng/L).
   POINT STOP : Entreposez immédiatement les échantillons d’ARN à -80 oC après la lecture.
9. Calculer le rendement de l’ARN et l’activité spécifique comme indiqué dans la zone 2019².

4. Hybridation et numérisation microrésons

REMARQUE : Cette étape ne prend que 3-4 h et donc l’hybridation de 24 échantillons peut être commencée après le déjeuner. Un opérateur peut fonctionner confortablement jusqu’à 4 diapositives (32 échantillons). Le matin du lendemain est alloué pour le lavage et la numérisation des diapositives microarray. D’autres pistes peuvent ensuite être effectuées dans l’après-midi de la deuxième journée. Cette étape est répétée jusqu’à ce que tous les échantillons soient hybrides et numérisés. Il est fortement recommandé d’utiliser des gants en latex sans couleur et sans poudre pour manipuler et traiter les diapositives afin de s’assurer que les échantillons ne sont pas contaminés par des pigments colorés qui peuvent interférer avec les analyses de microrésion. Mis à part les microarrays disponibles dans le commerce, les tableaux personnalisés suivants sont conçus par notre groupe et disponibles pour commande auprès d’Agilent: Order Code 028827 pour l’orge (Hordeumvulgare), 054269 pour Rice (Oryzasativa subs. Japonica), 054270 pour Le riz (Oryzasativas subdica) et 048923 pourWheattictum ( Tritivum).

1. Effectuer l’hybridation microarray à l’aide de la trousse d’hybridation de l’expression génique (voir Tableau des matériaux). Préparer 10x Agent de blocage selon les spécifications du fabricant². Aliquot l’agent de blocage 10x en portions de 200 L et entreposez-le à -20 oC jusqu’à l’utilisation. Chaque aliquote est suffisant pour jusqu’à 40 hybridations et est stable jusqu’à 2 mois.
2. Le jour alloué à l’hybridation de microrésion, dégelez un aliquot de 10x sur glace. En outre, préchauffer le four d’hybridation à 65 oC et préchauffer un bloc de chaleur à 60 oC pour une utilisation pendant la fragmentation de l’ARN.
3. Préparer le mélange de fragmentation pour chaque échantillon tel que décrit par le fabricant². Dans notre laboratoire, nous utilisons régulièrement 600 ng d’ARN Cy3 linéairement amplifié pour l’hybridation dans une microrésion de 8 paquets. Dans ce cas, la liste ci-dessous résume les composantes du mélange de fragmentation par échantillon :
   600 ng de cRNA linéairement amplifié, cyanine 3 étiquette
   5 L de 10x Agent de blocage
   Ajuster le volume à 24 ll avec de l’eau sans nucléase
   1 ll de 25x Fragmentation Buffer
   25 l de volume total Fragmentation Mix
   1. Mélanger délicatement les échantillons à l’aide d’un mélangeur à vortex. Tourner tous les échantillons brièvement à l’aide d’une microcentrifugeuse.
4. Incuber tous les échantillons dans le bloc thermique de 60 oC pendant exactement 30 min. Refroidir immédiatement chaque tube sur la glace pendant une minute, puis passer rapidement à l’étape suivante.
5. Pour arrêter complètement la réaction de fragmentation, ajoutez 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM à chaque tube. Mélanger doucement en faisant monter et descendre, en prenant grand soin de ne pas introduire de bulles pendant le mélange. Nous utilisons régulièrement 25 L de tampon d’hybridation pour arrêter la réaction de fragmentation pour le format de micro-array de 8 paquets.
6. Centrifuge tous les tubes pendant 1 min à 15 750 x g à température ambiante. Placez rapidement tous les tubes sur la glace et chargez chaque échantillon aussi vite que possible.
7. Avant de quitter le laboratoire pour l’incubation de 17 h pendant la nuit, préparez l’assemblage d’hybridation² comme indiqué dans la vidéo.
   1. ÉTAPE CRITIQUE : Transférer chaque mélange d’hybridation et distribuer lentement au centre de chaque puits de joint, en observant un grand soin de ne pas introduire de bulles pendant la distribution. Nous utilisons régulièrement 44 L de mélange d’hybridation pour le format de microarray 8-pack. Placez également 44 L de 1x Hybridization Buffer dans tous les puits inutilisés.
   2. Mettez immédiatement la diapositive de microarray avec une orientation correcte sur le dessus de la diapositive de joint. Cela doit être fait très soigneusement afin de ne pas renverser de liquide. Fermez l’assemblage d’hybridation étroitement et faites-le pivoter pour vérifier si aucune bulle d’air permanente n’a été introduite. Toutes les bulles doivent se déplacer dans la glissière du joint.
8. Placez l’assemblage de chambre d’hybridation dans le rotateur de four d’hybridation. Si vous utilisez le tampon d’hybridation 2x GEx, définissez la vitesse de rotation à 10 tr/min et hybridez à 65 oC pour exactement 17 h.
9. Laver les microrésages hybrides à l’aide de la trousse tampon de lavage d’expression génique (voir Tableau des matériaux). Préparer les tampons de lavage d’expression génique 1 et 2 en fonction des instructions du fabricant². Ajouter 2 ml de Triton X-102 à 10 % aux deux tampons (purement facultatifs mais fortement recommandés pour réduire l’incidence des artefacts de lavage de microarray)².
10. Préparer trois assemblages de chambre à laver comme indiqué dans la publication précédente². Les détails de chaque chambre de lavage sont compilés ci-dessous (tableau 1).
11. Aliquot 500 ml de Wash Buffer 1 dans une bouteille de réactif de 1 L et laisser à température ambiante. Préparer une bouteille de réactif de 1 L supplémentaire et l’étiquette avec « Wash Buffer 1 Reuse » pour enregistrer le tampon de lavage de la première chambre. De plus, l’aliquot 500 ml de Wash Buffer 2 dans une bouteille de réactif et incuber dans un bain d’eau de 37 oC pendant la nuit.
    REMARQUE : Ne quittez pas le laboratoire sans préparer les étapes 4.9 à 4.11. Ils sont nécessaires pour les étapes de lavage le lendemain.
12. Le lendemain, préparez les tampons de lavage tels que détaillés dans le tableau 2. Remplir chaque plat à trois quarts de leur tampon correspondant. Chaque tampon de lavage est bon pour jusqu’à 4-5 diapositives.
13. Après exactement 17 h d’hybridation, obtenez une chambre d’hybridation et démontez sur le banc de laboratoire bordé de papier sans peluche comme détaillé dans la publication précédente².
    1. ÉTAPE CRITIQUE : Transférer le sandwich microarray au plat 1. Assurez-vous que le code-barres de microarray est orienté vers le haut dans une position inclinée, et évitez de submerger la glissière entière dans le tampon. Manipulez chaque diapositive de microarray de leurs extrémités et évitez de toucher le côté actif de la glissière.
    2. Séparer les deux toboggans en verre à l’aide d’un forceps². Laissez le joint glisser doucement dans le fond du plat 1, tout en veillant à ce que la glissière de microarray est maintenue fermement pour l’étape suivante.
14. ÉTAPE CRITIQUE: Soulevez lentement les diapositives de microarray latéralement et transférez immédiatement dans le support de microarray dans le plat 2 comme indiqué dans la publication précédente². Il est essentiel que les diapositives de microrésarroie soient peu exposées à l’air.
    1. Répétez les étapes 4.13 et 4.14 jusqu’à ce que les huit diapositives soient dans la grille. Répartissez les diapositives de microréseau uniformément le long de la grille. Cette étape peut être effectuée par un opérateur sans aide pour un jusqu’à 4 diapositives. Fixez le support et transférez toute la configuration Dish 2 au premier agitateur magnétique. Remuer délicatement pendant exactement 1 min.
15. En remuant pendant 1 min (étape 4.14), transférer le plat 3 de l’incubateur mini 37 oC et placer au-dessus du deuxième agitateur magnétique. Placer délicatement Wash Buffer 2 (à partir du bain d’eau de 37 oC) sur le plat 3. Évitez la formation de bulles pendant la coulée.
    1. Après 1 min en remuant est fait (étape 4.14), soulevez doucement et lentement la grille de glissement du plat 2 et transférer au plat 3. Retirer le support et remuer pendant exactement 1 min.
16. Soulevez lentement et doucement la grille de la glissière du plat 3. Assurez-vous d’éviter la formation de gouttelettes tampons². Séchez les côtés de chaque toboggan en touchant doucement sur du papier sans peluche. Placer chaque toboggan séché à une tache dans une boîte à diapositives et répéter l’étape 4.16 jusqu’à ce que toutes les diapositives microarray soient dans la boîte à diapositives. Sécher environ 15 min.
    POINT D’ARRÊT OPTIONNEL
17. Placez chaque diapositive microarray dans un porte-glissières, en veillant à ce que le code-barres soit orienté vers le haut.
    REMARQUE : Les niveaux d’ozone à l’intérieur de la salle de microarray doivent être de 50 ppb (100 g/m³⁾ou moins. Ceci est purement facultatif, mais est fortement recommandé: utiliser une couverture de glissement de barrière d’ozone pour éviter la dégradation causée par l’ozone des colorants de cyanine.
18. Placez les porte-diapositives assemblés dans le carrousel de balayage. Chargez les échantillons dans l’ordre, en fonction du numéro de code-barres. Scannez immédiatement les diapositives à l’aide d’un scanner microarray (voir Tableau des matériaux),tel que détaillé dans la publication précédente².
19. Après la course, soumettez les données à l’extraction des fonctionnalités et à la validation qc, comme indiqué dans la publication^{précédente 2}.

Cette méthode est optimisée pour extraire des échantillons de graines de céréales contenant des quantités importantes d’amidon ou de sucres contaminants. Il est conçu pour extraire l’ARN total de 24 échantillons de semences par jour. Il doit être effectué en continu en une journée, mais des points d’arrêt et de pause facultatifs sont identifiés tout au long du protocole. Alternativement, le lecteur peut utiliser ses kits d’extraction d’ARN préférés ou sa méthode d’extraction chimique manuelle. Cependant, d’après notre expérience antérieure, les trousses d’extraction d’ARN végétal disponibles dans le commerce ne conviennent pas aux graines en raison de quantités importantes d’amidon, de protéines, de sucre et/ou de contamination par les lipides. Dans la méthode décrite, une extraction chimique de l’ARN brut est suivie par la purification de colonne utilisant un kit commercial d’extraction d’ARN. Cela fournit généralement l’ARN avec une meilleure qualité et le rendement. La figure 1 montre le résultat d’une course BioAnalyzer pour tester la qualité de l’extraction de l’ARN à l’aide de la méthode décrite ici. Les résultats sont présentés pour les feuilles d’orge (échantillons 1 et 2 représentant des échantillons à faible teneur en amidon) et les graines d’orge (échantillons 3 et 4 représentant des échantillons à teneur élevée en amidon). La valeur d’intégrité de l’ARN (RIN) pour tous les échantillons est de 10.

La figure 1 montre un gel représentatif de l’extrait d’ARN purifié, où la qualité a été testée à l’aide d’un Bioanalyzer. Les échantillons 1 et 2 sont des résultats typiques pour les échantillons à faible teneur en amidon tels que les feuilles d’orge, où des bandes d’ARN supplémentaires provenant de chloroplastes sont évidentes. Les échantillons 3 et 4 sont des résultats représentatifs pour les échantillons à teneur élevée en amidon tels que les graines d’orge, montrant 18S et 28S rRNA. Veuillez noter qu’aucune valeur automatisée de RIN ne peut être calculée pour les tissus végétaux verts tels que les échantillons de feuilles, en raison de l’ARR du chloroplaste. Cependant, l’intégrité et la haute qualité peuvent être visuellement déterminées par l’absence de tout produit de dégradation, qui apparaît généralement comme faible frottis moléculaire. La valeur RIN pour les échantillons de graines d’amidon élevé tels que les graines d’orge est généralement de 10 en utilisant le protocole décrit dans ce document.

En outre, nous présentons également ici une donnée représentative d’une expérience de cours de temps de deux lignes d’élite d’abrage d’orge (Sofiara et Victoriana) utilisées pour l’analyse de la qualité du maltage19. Pendant le processus de maltage, l’amidon est converti en sucre. Par conséquent, les échantillons représentent des tissus dont les proportions variables d’amidon et de sucre sont contenus. Comme le processus de maltage industriel est semblable au processus de germination, les transcriptions de deux lignes d’orge, différentes dans leur qualité de maltage, ont été analysées. Les ARN ont été extraits des graines germinantes à 2, 24, 48, 72, 120, 144 et 196 h après l’imbibition dans les triplicates biologiques. La préparation et l’hybridation de l’ARN à la puce personnalisée de microarray d’orge ont été exécutées comme décrit ci-dessus. La figure 2 indique que la grille normalisée est ressortie de l’hybridation microrésactique donnée dans le rapport de contrôle de la qualité (QC)(figure 3) et la parcelle d’histogramme pour détecter les signaux. La grille donne l’exemple des signaux dérivés de chaque coin de la puce, y compris le fond et le pic-dans lire les points utilisés pour l’étalonnage. L’histogramme indique l’écart des points détectables avec des intensités de signal respectives. Une hybridation réussie donne une large courbe en forme de Gaussien avec seulement des valeurs aberrantes mineures comme le montre la figure. Les hybridations ratées peuvent entraîner un fort déplacement vers un côté (« monstres verts »).

Enfin, un résultat représentatif des valeurs acceptables est affiché dans la colonne 4 de la figure 3. Pour indiquer la fiabilité des expériences réalisées, les résultats sont évalués à l’aide du logiciel GeneSpring. Les données recueillies sont présentées comme l’analyse principale des composants (APC). L’APC intègre les valeurs de certains points (gènes) comme vecteur. Le nombre de points évalués qui sont utilisés peut varier de plusieurs centaines à l’ensemble de la puce et dépend du logiciel utilisé. Chaque puce (échantillon) donne une valeur (vecteur) résultant des intensités intégrées du signal pour les points analysés. Par conséquent, la position relative dans le graphique (PCA) indique la similitude des échantillons les uns aux autres. Plus les échantillons sont proches, plus ils sont semblables. Les répliques techniques doivent être plus rapprochées que les répliques biologiques, et les reproductions biologiques d’un échantillon devraient se regrouper plus étroitement les unes des autres que les échantillons de différents points de temps, tissus ou conditions.

Figure 1 : Résumé de fichier Electrophoresis obtenu après vérification de la qualité de l’ARN avec Bioanalyzer. Les échantillons 1 et 2 sont des tissus de feuilles d’orge, comme l’indiquent d’autres bandes ribosomales provenant de chloroplastes. Les échantillons 3 et 4 sont des tissus de graines d’orge avec des bandes d’ARN 18S et 28S montrées. Un facteur RIN n’est pas toujours calculé pour les tissus verts tels que la feuille, mais selon le gel, la qualité de l’ARN est très bonne. La valeur RIN pour les échantillons 3 et 4 est de 10. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Qc Rapport de l’hybridation réussie de microarray d’orge. A - indique les signaux détectés sur la grille de tous les coins de la puce. L’histogramme montre le nombre de signaux classés selon l’intensité du signal (fluorescence) comme logarithme après soustraction de fond. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Sommaire du contrôle de la qualité (QC) après hybridation et numérisation. Les valeurs de la diapositive hybride sont données dans la colonne 2 (valeur) et la gamme de valeurs acceptables est indiquée dans la colonne 4. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Préparation des assemblages de la chambre à laver.

Tableau 2 : Température incubation et temps pour les assemblages de chambre à laver.

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.