Summary
Dit protocol beschrijft een uitgebreide hemocompatibiliteitsevaluatie van bloedcontactapparatuur met behulp van lasergesneden neurovasculaire implantaten. Een flow loop model met vers, gehepariniseerd menselijk bloed wordt toegepast om de bloedstroom na te bootsen. Na perfusie worden verschillende hematologische markers geanalyseerd en vergeleken met de waarden die direct na de bloedafname zijn opgedaan voor hemocompatibiliteitsevaluatie van de geteste apparaten.
Abstract
Het toenemende gebruik van medische hulpmiddelen (bijvoorbeeld vaattransplantaties, stents en hartkatheters) voor tijdelijke of permanente doeleinden die in de bloedsomloop van het lichaam achterblijven, vereist een betrouwbare en multiparametrische aanpak die de mogelijke hematologische complicaties door deze apparaten evalueert (d.w.z. activering en vernietiging van bloedbestanddelen). Uitgebreide in vitro hemocompatibiliteitstests van bloedcontactimplantaten is de eerste stap naar een succesvolle implementatie in vivo. Daarom is uitgebreide analyse volgens de International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) verplicht voorafgaand aan de klinische toepassing. De gepresenteerde stroomlus beschrijft een gevoelig model om de hemostatische prestaties van stents te analyseren (in dit geval neurovasculair) en bijwerkingen te onthullen. Het gebruik van vers menselijk volbloed en zachte bloedafname zijn essentieel om de preactivering van bloed te voorkomen. Het bloed wordt geperfundeerd door een gehepariniseerde slang die het testmonster bevat met behulp van een peristaltische pomp met een snelheid van 150 mL/min bij 37 °C gedurende 60 min. Voor en na perfusie, hematologische markers (d.w.z. het aantal bloedcellen, hemoglobine, hematocriet en plasmatische markers) die de activering van leukocyten (polymorfoomaat [PMN]-elastase), bloedplaatjes (β-tromboglobine [β-TG]), het stollingssysteem (thombin-antithrombine III [TAT]) en de complementcascade (SC5b-9) worden geanalyseerd. Tot slot presenteren we een essentieel en betrouwbaar model voor uitgebreide hemocompatibiliteitstests van stents en andere bloedcontactapparatuur voorafgaand aan de klinische toepassing.
Introduction
De in vivo toepassing van implantaten en biomaterialen, die interageren met menselijk bloed, vereist intensieve preklinische tests gericht op het onderzoek van verschillende markers van het hemostatisch systeem. De Internationale Organisatie voor Normalisatie 10993-4 (ISO 10993-4) specificeert de centrale principes voor de evaluatie van bloedcontactapparatuur (d.w.z. stents en vasculaire grafts) en beschouwt het apparaatontwerp, klinisch nut en benodigde materialen1.
Menselijk bloed is een vloeistof die verschillende plasma-eiwitten en cellen bevat, waaronder leukocyten (witte bloedcellen [WBC's]), erytrocyten (rode bloedcellen [RBCs]), en bloedplaatjes, die complexe functies in het menselijk lichaam uitvoeren2. Het directe contact van vreemde materialen met bloed kan nadelige effecten veroorzaken, zoals activering van het immuunsysteem of stollingssysteem, wat kan leiden tot ontsteking of trombotische complicaties en ernstige problemen na implantatie3,4,5. Daarom biedt in vitro hemocompatibiliteitsvalidatie een mogelijkheid voorafgaand aan de implantatie om eventuele hematologische complicaties op te sporen en uit te sluiten die kunnen worden veroorzaakt bij contact van het bloed met een vreemd oppervlak6.
Het gepresenteerde stroomlusmodel werd opgericht om de hemocompatibiliteit van neurovasculaire stents en soortgelijke apparaten te beoordelen door een stroomsnelheid van 150 mL/min in buizen (diameter van 3,2 mm) aan te passen om cerebrale stroomomstandigheden en slagaderdiameters na te bootsen2,7. Naast de behoefte aan een optimaal in vitro model, is de bron van bloed een belangrijke factor bij het verkrijgen van betrouwbare en ongewijzigde resultaten bij het analyseren van hemocompatibiliteit van een biomateriaal8. Het verzamelde bloed moet onmiddellijk na de bemonstering worden gebruikt om veranderingen veroorzaakt door langdurige opslag te voorkomen. In het algemeen moet een zachte verzameling bloed zonder stasis met behulp van een 21 G naald worden uitgevoerd om de vooractivering van bloedplaatjes en de stollingscascade tijdens het tekenen van bloed te minimaliseren. Bovendien, donor uitsluiting criteria omvatten degenen die roken, zwanger zijn, zijn in een slechte staat van gezondheid, of hebben orale anticonceptiva of pijnstillers genomen tijdens de voorgaande 14 dagen.
Deze studie beschrijft een in vitro model voor de uitgebreide hemocompatibiliteittesten van stentimplantaten onder stromingsomstandigheden. Bij het vergelijken van ongecoate stents met fibrine-heparine, weerspiegelen de resultaten van de uitgebreide hemocompatibiliteitstests een verbeterde hemocompatibiliteit van de met fibrine-heparine gecoate stents9. Daarentegen veroorzaken de ongecoate stents activering van de stollingscascade, zoals blijkt uit een toename van thombin-antitrombine III (TAT) concentraties en verlies van bloedplaatjesnummers als gevolg van de hechting van bloedplaatjes aan het stentoppervlak. Over het algemeen wordt aanbevolen om dit hemocompatibiliteitsmodel als preklinische test te integreren om eventuele nadelige effecten op het hemostatische systeem te detecteren die door het apparaat worden veroorzaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De bloedafnameprocedure werd goedgekeurd door de ethische commissie van de medische faculteit van de Universiteit van Tuebingen (projectidentificatiecode: 270/2010BO1). Alle onderwerpen verstrekt schriftelijke, geïnformeerde toestemming voor opname voor deelname.
1. Voorbereiding van heparin-loaded Monovettes
- Meng de onverdunde heparine (5.000 IU/mL) met natriumchloride (NaCl, 0,9%) oplossing en bereiden een oplossing met een resulterende concentratie van 15 IE/mL heparine.
- Voeg 900 μL van de verdunde heparineoplossing toe aan elke neutrale monovette (9 mL) om na bloedafname een uiteindelijke heparineconcentratie van 1,5 IE/mL te verkrijgen. Bereid drie monovettes per donor plus drie reserve monovettes en bewaar de heparine-loaded monovettes op 4 °C tot bloedafname.
2. Bloedafname
- Haal de met heparine geladen monovettes 30 minuten vóór de bloedafname uit de koelkast.
- Verzamel een bloedmonster van 27 mL van elke gezonde donor (n = 5) door venipunctie voor de stroomlus. Breng alleen een gladde tourniquet aan om voortijdige activering van de bloedplaatjes en de bloedstollingscascade te voorkomen.
- Verzamel bloedmonsters in drie monovettes die 900 μL van de heparineoplossing (1,5 IU/mL) bevatten en bundel alle drie de monovettes in één plastic container om ervoor te zorgen dat alle componenten gelijkmatig worden verdeeld.
- Breng het gepoolde heparinized bloed rechtstreeks over in drie verschillende monovettes die EDTA (1,2 mL), citraat (1,4 mL) of een mengsel van citraat, theophylline, adenosine en dipyridamole (CTAD, 2,7 mL) bevatten om basiswaarden te verzamelen. Ga verder met de monsters zoals beschreven in de secties 5−8.
OPMERKING: Om niet beïnvloed stollingsgedrag te garanderen, moeten donoren de inname van hemostase-beïnvloedende geneesmiddelen (bijvoorbeeld acetylsalcylzuur, naproxen en carbenicillin) in de afgelopen 14 dagen vermijden, evenals orale anticonceptiva en roken.
3. Voorbereiding van de stroomlus
- Snijd drie met heparine gecoate polyvinylchloridebuizen met een lengte van 75 cm en een binnendiameter van 3,2 mm. Belaad de buizen met de neurovasculaire lasergesneden implantaten met of zonder de fibrine-heparinecoating. Vergeet niet om een bad gelost als een controle te verlaten.
- Plaats het ene uiteinde van de buis in een reservoir gevuld met 0,9% NaCl, sluit de slang aan op de pompkop en steek het andere uiteinde in een meetcilinder.
- Pas de instellingen van de peristaltische pomp aan om een stroomsnelheid van 150 mL/min te bereiken met behulp van een timer terwijl u het vulniveau in de meetcilinder controleert.
4. Prestaties van hemocompatibiliteitstests
- Gebruik een spuit van 12 mL om de buizen te vullen met bloed. Laat 6 mL bloed soepel in elke buis met een monster of geloste controle.
- Vorm een circuit en sluit de buizen stevig met een lengte van 0,5 cm siliconen verbindingsbuizen. Plaats de buizen in een waterbad van 37 °C en start de perfusie gedurende 60 min.
5. Whole Blood Count Analyse
- Doe 1,2 mL bloed na bemonstering (baseline) of na perfusie in een monovette met EDTA en omkeer de buis voorzichtig 5x.
- Steek de monovette in de bloedanalyzer en voer een bloedtellingsanalyse uit voor elk monster. Vervolgens de monovettes op ijs 15-60 min uitbroeden na de bloedtellingsmeting voor verdere analyse, zoals beschreven in sectie 7.
6. Verzameling van citrate plasma
- Vul de monovettes met een citrate met 1,4 mL bloed (vers getrokken of na circulatie) en voorzichtig omkeren 5x.
- Centrifugeer de buizen gedurende 18 min bij 1.800 x g bij kamertemperatuur (RT). Aliquot drie 250 μL monsters van de plasmafractie in 1,5 mL reactiebuizen en vries de plasmamonsters in vloeibare stikstof. Bewaar ze op -20 °C tot de analyse.
7. Inzameling van EDTA-plasma
- Incubeer de monovettes op ijs gedurende 15-60 min na de bloedtellingsmeting. Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende 20 min bij 2.500 x g en 4 °C.
- Aliquot drie 250 μL monsters van de plasmafractie in 1,5 mL reactiebuizen na centrifugering en vries de buizen in vloeibare stikstof. Bewaar ze op -80 °C tot de analyse.
8. Verzameling van CTAD Plasma
- Vul de monovettes met het CTAD mengsel met 2,7 mL bloed (vers getekend of na incubatie) en voorzichtig omkeren 5x. Daarna, uitbroeden de monovettes op ijs voor 15-60 min. Centrifugeer vervolgens de buizen gedurende 20 min bij 2.500 x g en 4 °C.
- Breng 700 μL van de middelste plasmafractie over in een 1,5 mL-reactiebuis en centrifugeer de gevulde reactiebuizen gedurende 20 min bij 2.500 x g en 4 °C.
- Aliquot twee 100 μL monsters van de middelste fractie in 1,5 mL reactiebuizen na centrifugering en vries de buizen in vloeibare stikstof. Bewaar ze op -20 °C tot de analyse.
OPMERKING: De verzameling EDTA-plasma en CTAD-plasma kan samen worden uitgevoerd omdat de bedrijfsomstandigheden hetzelfde zijn.
9. Meting van menselijke TAT van citrate plasma
- Ontdooi het citrateplasma in een waterbad van 37 °C.
- Gebruik de TAT-enzym-linked Immunosorbent test (ELISA) kit volgens de instructies van de fabrikant. Reconstrueren van de plasmanormen en controle en verdun de wasoplossing, anti-mens-TAT peroxidase (POD)-geconjugeerd antilichaam, en chromogenoplossing. Laat alle reagentia en de microtiterplaat 30 minuten bij RT (15−25 °C) staan voordat u met de test begint.
- Pipet 50 μL van de monsterbuffer in elke put van de microtiterplaat en voeg 50 μL van de monsterbuffer (leeg), plasmastandaard, plasmacontrole en onverdund plasmamonster in duplicaten toe aan de putplaat. Sluit de plaat af en incubeer 15 min met zacht schudden bij 37 °C. Was vervolgens de plaat 3x met 300 μL wasoplossing.
- Voeg 100 μL van het POD-geconjugeerde anti-mens-TAT-antilichaam toe aan elke put. Sluit de plaat af en incubeer 15 min met zacht schudden bij 37 °C. Was vervolgens de plaat 3x met 300 μL wasoplossing.
- Voeg 100 μL van de vers bereide chromogene oplossing toe aan elke put. Sluit de plaat af en incubeer 30 min bij RT.
- Verwijder de afdichtingsfolie en voeg aan elke put 100 μL stopoplossing toe. Lees de optische dichtheid (OD) met een fotometer op 490−500 nm. Pas de standaardcurvegegevens als een trendlijn en bereken de concentratie van de monsters.
10. Meting van PMN-elastasase uit Citrate Plasma
- Ontdooi het citrateplasma in een waterbad bij 37 °C.
- Gebruik de polymorfonucleaire (PMN)-elastasase ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant: reconstrueren de PMN-elastase controle en de PMN-elastase standaard om een standaard curve voor te bereiden met behulp van de kit verdunning buffer.
- Verdun de wasoplossing volgens de beschrijving van de fabrikant. Laat alle reagentia en de microtiterplaat 30 minuten bij RT achter voordat u met de test begint. Verdun de citrate plasmamonsters tot 1:100 met de verdunningsbuffer.
- Voeg 100 μL van de monsterbuffer (blanco), PMN-elastasase standaardcurve (15,6−1.000 ng/mL), PMN-elastase-controles (hoge en lage concentraties) en verdunde plasmamonsters in duplicaten op de putplaat toe. Sluit de plaat af en incubeer 60 min bij RT met zacht schudden. Daarna, was de plaat 4x met 300 μL wasmiddel.
- Voeg 150 μL van het enzymgeconjugeerde antilichaam toe aan elke put. Sluit de plaat af en incubeer 60 min bij RT met zacht schudden. Daarna, was de plaat 4x met 300 μL wasmiddel.
- Voeg aan elke put 200 μL van de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)-substraatoplossing toe. Verzegel de plaat en incubeer bij RT gedurende 20 min in het donker. Verwijder vervolgens de afdichtingsfolie en voeg 50 μL van de stopoplossing aan elke put toe.
- Lees de OD met een fotometer op 450 nm met een referentiemeting op 630 nm. Pas de standaardcurvegegevens als een trendlijn en bereken de concentratie van de monsters.
11. Meting van Terminal Complement Complex (TCC) van EDTA Plasma
- Ontdooi het EDTA-plasma in een waterbad bij 37 °C en bewaar op ijs na het ontdooien.
- Gebruik de complement cascade SC5b-9 ELISA kit volgens de instructies van de fabrikant: verdun de wasoplossing zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Laat alle reagentia en de microtiterplaat 30 minuten bij RT achter voordat u met de test begint. Verdun de EDTA-plasmamonsters tot 1:10 met de verdunningsbuffer van de kit.
- Voeg 300 μL wasoplossing toe aan elke put om het oppervlak te hydrateren en aan te zuigen na 2 min. Voeg 100 μL van de monsterbuffer (blanco), SC5b-9-normen, SC5b-9-controles (hoge en lage concentraties) en de verdunde plasmamonsters in duplicaten toe aan de putplaat.
- Sluit de plaat af en incubeer 60 min bij RT. Was vervolgens de plaat 5x met 300 μL wasoplossing.
- Voeg 50 μL van het enzymgeconjugeerde antilichaam toe aan elke put. Sluit de plaat af en incubeer 30 min bij RT. Was vervolgens de plaat 5x met 300 μL wasoplossing.
- Voeg 100 μL van de TMB-substraatoplossing toe aan elke put. Verzegel de plaat en incubeer bij RT gedurende 15 min in het donker.
- Verwijder de afdichtingsfolie en voeg aan elke put 100 μL van de stopoplossing toe. Lees de OD met een fotometer op 450 nm. Pas de standaardcurvegegevens als een trendlijn en bereken de concentratie van de monsters.
12. Meting van β-tromboglobuline uit CTAD Plasma
- Ontdooi het CTAD-plasma in een waterbad bij 37 °C.
- Gebruik de β-tromboglobuline (β-TG) ELISA-kit volgens de instructies van de fabrikant: reconstrueer de β-TG-regeling en de β-TG-norm en verdun de wasoplossing met behulp van gedistilleerde H2O. Rereconstrueer het POD-geconjugeerd antilichaam met behulp van de meegeleverde fosfaatbuffer. Laat alle reagentia en de microtiterplaat 30 minuten bij RT achter voordat u met de test begint.
- Bereid de standaardcurve en de besturing volgens de instructies van de fabrikant voor met de meegeleverde fosfaatbuffer. Verdun de CTAD-plasmamonsters tot 1:21.
- Voeg 200 μL van de fosfaatbuffer (blanco), β-TG-normen, β-TG-controles (hoge en lage concentraties) en verdunde plasmamonsters in duplicaten toe aan de putplaat. Sluit de plaat af en incubeer 60 min. Daarna was de plaat 5x met 300 μL wasoplossing.
- Voeg 200 μL van het enzymgeconjugeerde antilichaam toe aan elke put. Sluit de plaat af en incubeer 60 min. Daarna was de plaat 5x met 300 μL wasoplossing.
- Voeg aan elke put 200 μL van de TMB-substraatoplossing toe. Verzegel de plaat en incubeer bij RT gedurende 5 min in het donker. Verwijder de zeehondenfolie en stop de reactie door 50 μL zwavelzuur (H2SO4)aan elke put toe te voegen.
- Laat de plaat 15-60 min staan en lees de OD met een fotometer op 450 nm. Pas de standaardcurvegegevens als een trendlijn en bereken de concentratie van de monsters.
13. Monstervoorbereiding voor scanning elektronenmicroscopie
- Verwijder het implantaat uit de buis met behulp van tangen en spoel het implantaat kort door het te dompelen in 0,9% NaCl oplossing 3x.
- Bewaar glutaraldehydeoplossing (2% glutaraldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS-buffer zonder Ca2+/Mg2+]) 's nachts bij 4 °C.
- Vervolgens de implantaten in PBS-buffer voor 10 min uitbroeden. Dehydrateer de monsters door ethanol met een toenemende concentratie gedurende 10 min elk te uitbroeden: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% en 100%. Bewaar de uitgedroogde monsters in 100% ethanol tot verdere analyse.
- Uitvoeren van kritische punt drogen volgens de instructies van het droogapparaat of literatuur10 net voor het scannen van elektronenmicroscopie (SEM).
14. Scanning Electron Microscopie
- Bevestig de gedroogde implantaten aan een monsterdrager voor de scanmicroscoop en sputter de monsters met goudpalladium.
- Introduceer de gesputteerde implantaten in de monsterkamer. Maak foto's in 100-, 500-, 1.000- en 2.500-voudige vergroting van de gebieden met de representatieve oppervlakte- en celhechting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kort samengevat, menselijk volbloed werd verzameld in heparine-geladen monovettes vervolgens samengevoegd en gebruikt om de basislijn niveaus van cel tellingen evenals plasmatische hemocompatibiliteit markers te evalueren.
Vervolgens werd de slang met de neurovasculaire implantaatmonsters gevuld en werd het bloed gedurende 60 min geperfundeerd bij 150 mL/min en 37 °C met behulp van een peristaltische pomp. Ook hier werd het aantal cellen in alle groepen geanalyseerd en werden de plasmamonsters voorbereid voor ELISA-analyses(figuur 1). De kwantificering van de bloedcellen en bloedparameters, zoals hemoglobine en hematocriet, werd direct na de bloedafname en na perfusie in het stroomlusmodel uitgevoerd voor alle monstertypen en de controle. Er zijn geen wijzigingen geconstateerd met betrekking tot het aantal WbC's (figuur 2A), RBC's (figuur 2B) of de hematocrietwaarden (figuur 2C). Echter, een daling van de hemoglobine niveaus werd gedetecteerd na de incubatie van het bloed in de stroom lus model in vergelijking met de basiswaarden, die te wijten was aan de perfusie van bloed in de stroomlus systeem (figuur 2D). Bovendien werd een afname van het bloedplaatjesaantal waargenomen als gevolg van bloedperfusie. Bovendien werd dit effect verhoogd toen een ongecoate stent aanwezig was in de slang, wat wijst op de hechting van bloedplaatjes aan het biomateriaal. Niettemin werd duidelijk aangetoond dat het verlies van bloedplaatjes aanzienlijk hoger was toen de ongecoate stent werd geïncubeerd met bloed, in tegenstelling tot de met fibrine bedekte stent met fibrine(figuur 2E).
Mogelijke veranderingen van de hematologische plasmamarkers werden ook onderzocht in de testgroepen na perfusie en vergeleken met de uitgangswaarden van het vers getrokken bloed. De tat-complexe concentratie, die de activeringsstatus van het stollingssysteem weerspiegelt, werd licht verhoogd als gevolg van bloedperfusie(figuur 3A). In de bare metal stent groep, echter, een aanzienlijke toename van de TAT werd gedetecteerd, wat wijst op een diepgaande activering van het stollingssysteem. De met fibrine-heparine gecoate stent verhinderde de activering van het stollingssysteem, aangezien geen verhoging in TAT werd bepaald.
De perfusie leidde tot een verhoogde activering van de complementcascade, die werd bepaald door sc5b-9 (figuur 3B) te meten. Echter, incubatie met ongecoate of fibrin-heparine-gecoate stents niet verder verhogen van de SC5b-9 concentratie. Vergelijkbare resultaten werden verkregen bij het analyseren van de activering van de neutrofiele granulocyten door de kwantificering van PMN-elastasaseconcentraties(figuur 3C).
Visualisatie van het stentoppervlak werd uitgevoerd met behulp van SEM. Duidelijke verschillen tussen de twee stentgroepen werden ontdekt na de bloedincubatie. Terwijl op het oppervlak van de ongecoate stent een dicht netwerk van bloedcellen en eiwitten aanwezig was, werd er geen hechting van eiwitten of cellen gedetecteerd op het oppervlak van de met fibrine bedekte stent (figuur 4).
Figuur 1: Schematisch overzicht van de hemocompatibiliteitsevaluatie van stents in een gevestigd stroomlusmodel. Vers menselijk volbloed wordt verzameld van gezonde donoren in bloedbuizen die heparine bevatten voor antistollingsmiddel. Voor elke donor worden een lege buis en buizen die vooraf met het monstermateriaal zijn geladen, vervolgens gevuld met vers bloed en in de stroomlus geïncubeerd met een snelheid van 150 mL/min bij 37 °C gedurende 60 min. Bovendien worden plasmamonsters bereid uit vers bloed om de basiswaarden van elke donor te verkrijgen. Na de incubatie worden de plasmamonsters van de testslang, met en zonder monstermaterialen, voorbereid en geanalyseerd met behulp van een specifieke ELISA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Analyse van verschillende celtypen en bloedparameters voor en na incubatie van verschillende stentimplantaten in het stroomlusmodel. De bepaling van witte bloedcellen(A),rode bloedcellen (B), hematocriet (C), hemoglobine (D), en bloedplaatjes (E) werd uitgevoerd. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 5, p* < 0,5, p*** < 0,001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Bepaling van bloedplaatjes of activeringsmarkers van het immuunsysteem voor en na incubatie met neurovasculaire implantaten. De markers voor de (A) activering van bloedstolling (TAT), (B) complementsysteem (SC5b-9) en (C) neutrofielen (PMN-elastase) werden gekwantificeerd met behulp van ELISA. De analyse werd uitgevoerd op plasmamonsters opgedaan uit vers getrokken bloed of bloed geïncubeerd met verschillende stents in de flow loop model. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 5, p* < 0,5). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Het scannen van elektronen microscopische analyse van stents na incubatie met bloed. De aggregatie van bloedplasma-eiwitten en bloedplaatjes op ongecoat stentmateriaal werd waargenomen. Ter vergelijking, stent materialen met de fibrine-heparine coating niet aantonen hechting van cellen of andere bloedbestanddelen op het oppervlak (vergroting van 500-, 1.000-, en 2.500-voudig). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft een uitgebreide en betrouwbare methode voor het hemocompatibiliteitsonderzoek van bloedcontactimplantaten overeenkomstig ISO 10993-4 in een schuifstroommodel dat de menselijke bloedstroom imiteert. Deze studie is gebaseerd op het testen van lasergesneden neurovasculaire implantaten, maar kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid aan monsters. De resultaten tonen aan dat deze methode de brede analyse van verschillende parameters mogelijk maakt, zoals het aantal bloedcellen, prevalentie van verschillende hemocompatibiliteitsmarkers en microscopische visualisatie van het apparaatoppervlak na bloedcontact. Met behulp van dit protocol kunnen mogelijke verschillen met betrekking tot de hemocompatibiliteit van verschillende apparaten worden gedetecteerd.
Een alternatief voor in vitro hemocompatibiliteitsbeoordeling bestaat uit in vivo dierproeven, die gepaard gaan met verschillende nadelen, zoals een hogere variabiliteit en vervorming van apparaatgerelateerde effecten als gevolg van de overweldigende kortetermijneffecten van weefselletsel6.
Voor in vitro hemocompatibiliteitstests zijn drie soorten modellen beschikbaar: (1) statische bloedincubatiemodellen, (2) geagiteerde bloedincubatiemodellen en (3) schuifstroommodellen. Het statische model biedt een eenvoudige en snelle methode om trombogenicity te bepalen door het apparaat rechtstreeks met bloed uit te broeden, maar het leidt alleen tot rudimentaire resultaten met betrekking tot hemocompatibiliteit11. Om de belangrijkste nadelen van statische modellen (d.w.z. sedimentatie van bloedcellen en het grote luchtcontactoppervlak) te overwinnen, kan het agiterende bloedincubatiemodel worden gebruikt, waarbij een testkamer met de implantaten wordt gevuld met bloed en geïncubeerd op een schommelplatform12. Deze modeltypen zijn echter nog steeds inferieur in vergelijking met de bestaande schuifstroommodellen, zoals de hier gepresenteerde stroomlus. De kwintessens van deze modellen is dat vasculaire menselijke bloedstroom kan worden geïmiteerd; aldus, kan een dichte weergave van de echte interactie tussen het implantaat en de bloedcellen13worden getoond. Naast het stroomlusmodel bestaan modellen zoals de Chandler-lus of meerdere perfused flow chamber14,15,16.
De Chandler lus is een gesloten buis systeem dat gedeeltelijk is gevuld met lucht en geklemd in een roterende apparaat, wat resulteert in de bloedcirculatie door de slang17. In het huidige stroomlussysteem wordt de buis volledig gevuld met bloed en wordt de stroom geforceerd met behulp van een peristaltische pomp. Bij het gebruik van de Chandler lus model, exploitanten geconfronteerd met twee grote nadelen als gevolg van de eis van het opnemen van lucht in de test slang. Ten eerste is het bekend dat de constante interactie van bloed en lucht de aggregatie van leukocyten en bloedplaatjes en eiwitdenaturatie18,19activeert. Ten tweede is de bloedcirculatie beperkt, omdat de lucht altijd op het hoogste punt van de lus20blijft .
Deze nadelen kunnen worden overwonnen bij het gebruik van het stroomlussysteem. Aangezien er geen lucht-vloeistof interface aanwezig is in het systeem, geen bloedplaatjes activering optreedt. Zo heeft het model een lage achtergrond voor trombotische gebeurtenissen, zodat een lage concentratie van antistollingsmiddelen, meestal 1 IE/mL of 1,5 IU/mL heparine, voldoende is om stolling te voorkomen, zelfs als hoge stroomsnelheden worden toegepast6. De verstelbare pompgereguleerde bloedstroomsnelheid en de vrij selecteerbare buisdiameter stellen de operator in staat om de fysiologische omstandigheden van een ader of slagader na te bootsen, die overeenkomen met het te testen implantaat, en relevante testresultaten te bereiken21. Dit voordeel is echter tegelijkertijd een beperking, als gevolg van de mechanische stress die via de pomp op het bloed wordt uitgeoefend, en de vernietiging van erytrocyten (d.w.z. hemolyse) kan optreden2. Dit ontstaat intrinsieke bloedschade vermindert de gevoeligheid van de methode en belemmert langdurige blootstelling aan het bloed21. Niettemin hebben verschillende studies het effectieve gebruik van het stroomlusmodel voor hemocompatibiliteitsevaluatie22,23,24aangetoond .
De belangrijkste kloof tussen alle in vitro modellen en de in vivo mechanismen omvat echter het ontbrekende endotheel, dat cytokinen, anti-trombotische componenten en adhesiemoleculen uitdrukt; daarom speelt deze component een cruciale rol in de interactie van het implantaat en circulerend bloed25. Kortom, het stroomlusmodel is verstelbaar, efficiënt, betrouwbaar en kosteneffectief om de hemocompatibiliteit van implantaten vóór klinisch gebruik te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Voor de uitvoering van scanning elektronenmicroscopie bedanken we Ernst Schweizer van de sectie Medical Materials Science and Technology van het Universitair Ziekenhuis Tuebingen. Het onderzoek werd ondersteund door het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport van de CR binnen National Sustainability Program II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) en door Czech Science Foundation project Nr. 18-01163S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W.
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
