Summary
Baanbrekende krommen (BBC's) zijn efficiënte instrumenten om het transport van bacteriën in poreuze media te bestuderen. Hier introduceren we tools op basis van vloeibare apparaten in combinatie met microscopie en flow cytometrische tellingen om BTC's te verkrijgen.
Abstract
Inzicht in het vervoer, de verspreiding en depositie van micro-organismen in poreuze media is een complexe wetenschappelijke taak die onderwerpen omvat die zo divers zijn als hydrodynamica, ecologie en milieutechniek. Het modelleren van bacterieel transport in poreuze omgevingen op verschillende ruimtelijke schalen is van cruciaal belang om de gevolgen van bacterieel vervoer beter te voorspellen, maar de huidige modellen slagen er vaak niet in om van laboratorium naar veldomstandigheden te worden opgeschaald. Hier introduceren we experimentele tools om bacterieel transport in poreuze media op twee ruimtelijke schalen te bestuderen. Het doel van deze instrumenten is om macroscopische observables (zoals doorbraakkrommen of afzettingsprofielen) van bacteriën geïnjecteerd in transparante poreuze matrices te verkrijgen. Op kleine schaal (10-1000 μm) worden microfluïde apparaten gecombineerd met optische videomicroscopie en beeldverwerking om baanbrekende krommen te verkrijgen en tegelijkertijd individuele bacteriële cellen op de porieschaal te volgen. Op grotere schaal wordt flow cytometrie gecombineerd met een zelfgemaakte robotdispenser om baanbrekende rondingen te verkrijgen. We illustreren het nut van deze hulpmiddelen om beter te begrijpen hoe bacteriën worden vervoerd in complexe poreuze media, zoals de hyporheïsche zone van stromen. Aangezien deze tools gelijktijdige metingen bieden op verschillende schalen, maken ze de weg vrij voor op mechanismen gebaseerde modellen, die van cruciaal belang zijn voor opschaling. Toepassing van deze instrumenten kan niet alleen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe bioremediatietoepassingen, maar ook nieuw licht werpen op de ecologische strategieën van micro-organismen die poreuze substraten koloniseren.
Introduction
Studies die gericht zijn op het begrijpen van het vervoer van microben via poreuze media zijn voornamelijk veroorzaakt door bezorgdheid over besmetting1, de overdracht van ziekte2 en bioremediatie3. In dit verband zijn bacteriën meestal behandeld als deeltjes in transportmodellen4 en zijn processen zoals filtratie, overbelasting, gravitatieregeling of hermobilisatie van biofilms geïdentificeerd als aanjagers van retentie of transport van microben5. Het bestuderen van het transport van bacteriën door poreuze landschappen kan ons echter ook informeren over de ecologische strategieën die hun succes in deze complexe omgevingen ondersteunen. Toch vereist dit nieuwe experimenten en wiskundige modellen die werken op het niveau van één cel, populatie of microbiële gemeenschap.
Natuurlijke poreuze omgevingen, zoals die gevonden in de hyporheïsche zone van beken en rivieren, zijn dicht gekoloniseerd door diverse gemeenschappen van biofilm-vormende microben6. Biofilms vormen structuren die de stroom wijzigen en dus het transport en de verspreiding van bacteriën in de vloeibare fase7,8. Het vervoer van bacteriën op porieschaal hangt af van de beperkte beschikbaarheid van ruimte in de poreuze matrix en beweeglijkheidsgerelateerde verspreiding kan een effectieve manier zijn om de individuele geschiktheid te vergroten door verminderde concurrentie om hulpbronnen in minder dichtbevolkte gebieden. Aan de andere kant kunnen motilebacteriën ook meer geïsoleerde gebieden van de poreuze matrix bereiken en de uitgebreide verkenning van dergelijke gebieden kan ecologische mogelijkheden bieden om motile populaties10. Bij grotere ruimtelijke schalen leidt biofilmgroei de stroompaden af die ook leiden tot (gedeeltelijke) verstopping van poriën en dus tot de vaststelling van nog meer gekanaliseerde en heterogene stromingsvoorwaarden11. Dit heeft gevolgen voor de toevoer van voedingsstoffen en de verspreidingscapaciteit, de frequentie en de afstand. Preferentiële stroom, bijvoorbeeld, kan genereren zogenaamde "fast-tracks" en motile bacteriën kunnen bereiken nog hogere snelheden dan de lokale stroom langs deze tracks12. Dit is een effectieve manier om de verkenning van nieuwe habitats te verhogen.
Een verscheidenheid van instrumenten maken gebruik voor de studie van het vervoer van motile en niet-motile bacteriën (en deeltjes) in poreuze media. Numerieke modellen hebben grote voorspellende capaciteiten die belangrijk zijn voor toepassingen, maar worden vaak beperkt door inherente aannames4. Laboratoriumexperimenten13,14 in combinatie met baanbrekende curve (BTC) modellering hebben belangrijke inzichten opgeleverd in het belang van bacteriële celoppervlakeigenschappen voor het vasthouden van efficiëntie15. BBC's (d.w.z. tijden reeks deeltjesconcentratie op een vaste locatie) worden meestal verkregen via constantere emissies en meting van celnummers bij de uitstroom van het experimentele apparaat. In deze context weerspiegelen BTC's de advection-dispersiedynamiek van bacteriën in de poreuze matrix en kunnen ze worden verlengd met een gootsteenterm die waarde hechting. Het modelleren van BBC's alleen lost echter niet de rol op van de ruimtelijke organisatie van het poreuze substraat of biofilm voor transportprocessen. Andere macroscopische waarneembare stoffen zoals dispersiviteit of afzettingsprofielen hebben bewezen belangrijke informatie te verschaffen over de ruimtelijke verdeling of de behouden deeltjes of groeiende gemeenschappen. Microfluidics is een technologie die het mogelijk maakt het bestuderen van transport in poreuze media door microscopie onderzoek9,12,16, en met uitzondering van een recent werk10, experimentele systemen zijn meestal beperkt tot een enkele lengte schaal van resolutie, dat wil zeggen, de porie schaal of de gehele vloeistofapparaat schaal.
Hier introduceren we een reeks gecombineerde methoden om het transport van motile- en niet-motilebacteriën in poreuze landschappen op verschillende schalen te bestuderen. We combineren waarnemingen van bacterieel transport op de porieschaal met informatie op grotere schaal, door middel van BTC-analyse. Microfluïde apparaten die zijn opgebouwd uit zachte lithografie met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS) zijn biocompatibel, bestand tegen een reeks chemicaliën, maken replicabiliteit tegen lage kosten mogelijk en bieden een uitstekende optische transparantie en een lage autofluorescentie die cruciaal is voor microscopische observatie. Microfluidics op basis van PDMS is eerder gebruikt om het transport van microben in eenvoudige kanalen17 of in complexere geometrieën te bestuderen12. Echter, meestal microfluidics experimenten richten zich op korte termijn horizonten en epi-fluorescentie microscopische observatie van levende cellen is vaak beperkt tot genetisch gemodificeerde stammen (bijvoorbeeld, GFP-gelabelde stammen). Hier presenteren we tools om bacterieel transport te bestuderen met behulp van PDMS-gebaseerde microfluïde apparaten in combinatie met microscopie en grotere apparaten vervaardigd uit poly (methylmethacrylaat) (PMMA, ook bekend als plexiglas) in combinatie met flow cytometrie. PDMS en PMMA verschillen in gaspermeabiliteit en oppervlakte-eigenschappen, waardoor complementaire mogelijkheden zijn om bacterieel transport te bestuderen. Terwijl het microfluidic apparaat een gecontroleerdere omgeving verstrekt, staat het grotere apparaat voor experimenten over langere periodes van tijd of gebruikend natuurlijke bacteriële gemeenschappen toe. Microscopie tellen op hoge temporele resolutie in een specifiek gebied wordt gebruikt om BTC te verkrijgen in de PDMS-gebaseerde microfluïde apparaat. Om celtellingen voor BTC-modellering te verkrijgen van het OP PMMA gebaseerde apparaat, introduceren we een zelfgebouwde geautomatiseerde vloeistofdispenser in combinatie met stroomcytometrie. In deze opstelling passeren cellen het vloeibare apparaat en worden achtereenvolgens in 96 putplaten afgegeven. De temporele resolutie wordt beperkt door het minimumvolume dat nauwkeurig kan worden afgegeven en dus de gemiddelde stroomsnelheid door het vloeibare apparaat. Fixatief in de putten voorkomt groei en vergemakkelijkt DNA-kleuring voor downstream flow-cytometrische opsoming. Om bacteriële groei tijdens transportexperimenten te voorkomen gebruiken we een minimaal medium (begroeide beweeglijkheidsbuffer).
Aangezien protocollen voor de bereiding van vloeistofapparaten op verschillende schalen direct beschikbaar zijn, introduceren we slechts kort de technieken om dergelijke apparaten te produceren en richten we ons eerder op de experimentele procedures om BBC's op te nemen. Op dezelfde manier bestaan er verschillende routines voor de stromingscytometrische opsoming van microben en gebruikers vereisen deskundige kennis om resultaten te interpreteren die zijn verkregen door flow cytometrie. We rapporteren het nieuwe gebruik van microfluïde apparaten in combinatie met microscopische beeldvorming om BTC's van fluorescerend getagde cellen vast te leggen. Op de porieschaal worden lokale snelheden en trajecten verkregen door middel van beeldverwerking. Verder tonen we het gebruik van een PMMA-gebaseerde fluidic apparaat in combinatie met flow-cytometrische tellen om bacteriële transport van motile en niet-motile cellen in poreuze omgevingen gekoloniseerd door een native stream biofilm te observeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bacteriële kweekomstandigheden
- Gebruik onder een laminaire stroomkap 100 μL van een glycerolvoorraad met GFP-label Pseudomonas putida KT2440 (1 ×10 7 mL-1, opgeslagen bij -80 °C) om 5 mL Luria-Bertani (LB) medium in te enten. Incubeer bij 30 °C terwijl u 's nachts schudt bij 250 tpm.
- De volgende dag, resuspend 100 μL van de nachtelijke cultuur in 5 mL LB medium en incubeer onder dezelfde omstandigheden voor 5h (exponentiële fase). Proef een aliquot van 1 mL in een buis van 2 mL, laat afkoelen tot kamertemperatuur (~ 15 min) en centrifuge (2300 x g gedurende 5 minuten).
- Verwijder de supernatant en voeg 1 mL beweeglijkheid buffer aan de pellet. Vortex kort om het monster te homogeniseren. Verdun om de gewenste celconcentratie te bereiken, bijvoorbeeld 5 x 105 mL-1.
- Voor experimenten met natuurlijke gemeenschappen, zoals die afkomstig van beken, bereiden een niet-selectief teeltmedium. Gebruik bijvoorbeeld steriel gefilterd en automatisch gefilterd stroomwater of een kunstmatig stroomwatermedium dat is gewijzigd met een complexe koolstofbron (LB-medium).
2. Bereiding van een microfluïdisch hulpmiddel in polydimethylsiloxaan (PDMS)
- Ontwerp de gewenste poreuze geometrie door middel van computer-aided drafting (CAD) software18, die bestaat uit een matrix van cirkels (dat is de ondoordringbare belemmering voor de stroom), beschreven door straalgrootte en centrum coördinaten.
OPMERKING: Een voorbeeld van een poreuze geometrie met gerandomiseerde korrel- en poriegroottes is opgenomen in figuur 1A. Een observatiekanaal zonder obstakels in de buurt van de uitgang vergemakkelijkt de aankoop van BTC's. - Op basis van de gekozen geometrie, bereiden een mal met behulp van standaard SU-8-fotolithografie18.
OPMERKING: Als alternatief kunnen mallen ook worden besteld bij speciale microfabricagefaciliteit. Om heterogene vloeistofstroom in het horizontale vlak te verkrijgen, is het belangrijk om de dikte van de microfluidics kamer van dezelfde orde van grootte als de gemiddelde porie keelgrootte te ontwerpen. Zorg er echter voor dat de afmetingen van het microfluïde apparaat geschikt zijn voor observatie onder de microscoop (bijvoorbeeld werken aan microscoopdia's). - Bereid 50 g PDMS voor door 10% van de kruis linker (dimethyl, methylwaterstof siloxaan copolymeer) toe te voegen aan 90% elastomeer in gewicht, met behulp van een spuit zonder naald. Werk onder schone omstandigheden en vermijd stof zoveel mogelijk. Meng de twee reagentia in een schone wegwerpcontainer en breng vacuüm (100 mbar) gedurende 30 minuten aan om opgeloste lucht en bellen uit het stroperige PDMS te verwijderen.
- Plaats de mal in een petrischaaltje met een diameter van 100 mm, 15 mm hoog). Giet de PDMS op de mal op de gewenste hoogte (bijvoorbeeld 2-5 mm). Bedek de petrischaal en bewaar deze 4 uur op 60 °C ('s nachts voor dikkere lagen) om te genezen.
OPMERKING: Voor visualisatiedoeleinden moet licht door het PDMS kunnen gaan, dus een dunne laag tussen 2 mm en 5 mm is wenselijk. Dikkere lagen (>5 mm) verminderen de transparantie van het apparaat en dunnere lagen worden tijdens het aanbrengen onderhevig aan vervormingen. - Haal de mal uit de oven en laat het microfluïde apparaat afkoelen tot kamertemperatuur. Zodra het is afgekoeld, voorzichtig verwijderen van de gewenste portie PDMS met een scalpel.
OPMERKING: Sterke druk op de mal resulteren in schimmelbreuken. Raak de PDMS niet met blote handen aan, omdat vingerafdrukken de optische transparantie beïnvloeden. - Verzegel de onderkant van het PDMS-kanaal (waar de gewenste geometrie is gegraveerd) tijdelijk met tape. Met een biopsie puncher met een diameter van 0,5 mm doorboort u een microfluïdisch kanaal om een inlaat en een uitlaat te creëren die past bij de 0,5 mm (binnendiameter) slang.
LET OP: Het zachte karakter van PDMS zorgt voor dichtheid zodra de slang wordt geplaatst. Inlaat- en uitlaatkanalen kunnen niet worden gemaakt nadat de PDMS aan het glas is verzegeld. - Verzegel het microfluïdische kanaal via zuurstofplasmabinatie met behulp van de hoogfrequente generator (plasmabindender, tabel van materialen). Maak hiervoor een silicaatglasplaat (25 mm x 75 mm) schoon met ethanol en laat deze drogen. Verwijder tape uit het PDMS-kanaal en plaats het kanaal met de poreuze kant naar boven. Behandel de silicaatglasplaat en PDMS-oppervlakken met plasma voor ongeveer 45 s bij kamertemperatuur.
- Plaats het PDMS-kanaal op de schuif van het silicaatglas en verwarm gedurende 30 minuten op 100 °C op een hete plaat.
- Haal het microfluïde apparaat van de kookplaat en koel het af tot kamertemperatuur. Sluit de PDMS-kanaalinlaat aan met buizen. Breng vacuüm gedurende 30 minuten aan om lucht uit PDMS te verwijderen, die bijna ondoordringbaar is voor vloeistoffen, maar doorlaatbaar voor gas.
- Bereid 100 mL beweegbaarheidsbuffer (10 mM kaliumfosfaat, 0,1 mM EDTA, aangevuld met 1% w/v glucose, pH 7.0) en injecteer 1 mL van het in het microfluïde apparaat met behulp van een spuitpomp die werkt op 10 μL min-1.
OPMERKING: Als de PDMS is onderverzadigd in gas (als gevolg van de vorige vacuüm stap), bubbels zal verdwijnen binnen ~ 30 min.
3. Bereiding van een vloeibaar apparaat in poly (methylmethacrylaat)
- Ontwerp de gewenste geometrie met de CAD-software. Zorg er indien van toepassing voor dat de afmetingen geschikt zijn voor observatie onder de microscoop (bijvoorbeeld afmetingen van een standaard 96 putplaat in combinatie met een geschikte houder). Het vloeibare apparaat bestaat uit een basis (127 × 127 × 12 mm) en een deksel (127 × 127 × 12 mm) van PMMA.
OPMERKING: Expertise met CAD-software wordt aanbevolen. Een voorbeeld technische tekening wordt geleverd in figuur 1A. - Verwijder 0,5 mm uit de onderste PMMA-laag en frees een groef (1,1 × 1,1 mm) voor een rubberen O-ring om het poriecompartiment te produceren en door middel van hoge precisie micromilling (WF31SA, Mikron) te produceren. Boor 12 schroefdraadgaten (M5). Dit zal dienen als de basis van het vloeibare apparaat.
OPMERKING: De afmetingen van het vloeibare apparaat moeten worden aangepast aan de microscoopfase en brandpuntsafstand. Een technische tekening wordt geleverd in figuur S1. - Boor twee schroefdraadgaten (type 1/4-28UNF) voor in- en uitlaat in het bovenste deel van het vloeistofapparaat en 12 gaten (5,5 mm) voor de schroeven. Dit zal dienen als het deksel van het vloeibare apparaat.
LET OP: Expertise in microfrezen is aan te raden; de auteurs gebruiken steun van een gespecialiseerde workshop. - Om het vloeibare apparaat voor en na elk gebruik schoon te maken en te steriliseren, week je de basis en het deksel van het vloeibare apparaat in HCl 7% en spoel je drie keer met gedeïoniseerd water.
- Schroef de basis en het deksel samen met behulp van de 12 schroefdraad gaten.
4. Installatie van geautomatiseerde dispenser
OPMERKING: Commercieel verkrijgbare vloeistofdispensers zijn duur en bieden vaak niet de flexibiliteit om rechtstreeks af te zien van de uitstroom van het vloeibare apparaat. Daarom wordt het monteren van een goedkoop en flexibel robotdispensersysteem van een XY Plotter Robot (Table of Materials) aanbevolen.
- Monteer de robotdispenser op een PMMA-plaat en molenholtes van 85,8 x 128 mm met een diepte van 1 mm om meerdere 96 putplaten vast te houden.
- Bevestig de uitstroombuis van het vloeistofapparaat aan de robotarm van de dispenser.
- Voor het bedienen van de robot dispenser download bCNC van github: https://github.com/vlachoudis/bCNC en volg de instructies om het programma te installeren.
- Download dispenser.py uit het ondersteunende materiaal van dit artikel.
OPMERKING: Deze python-code biedt een plug-in voor bCNC voor een eenvoudige robotdispenserlay-out. - Sluit de robotdispenser aan op de computer met bCNC en identificeer de juiste COM-poort.
- Klik in bCNC op de thuisknop om de robotdispenser terug te brengen naar de thuispositie.
LET OP: Homing brengt de robotdispenser terug naar een bekende positie (x=0, y=0) en verbetert daarom de nauwkeurigheid van de dispenser. - Bereid voorafgaand aan het experiment een voldoende aantal 96 putplaten voor, met putten met een passende hoeveelheid fixatief (bijvoorbeeld de uiteindelijke concentratie 3,7% formaldehyde).
OPMERKING: Bijvoorbeeld, bij een stroomsnelheid van 0,2 mL min-1, 100 μL worden afgegeven in elke put om de 30 s. Voeg daarom 10 μL van 37% formaldehyde toe aan elke put om een uiteindelijke concentratie van Formaldehyde tussen 2 en 4% te bereiken. Met behulp van acht 96 putplaten zal het mogelijk maken om het experiment te bedienen voor meer dan 6 uur met een totaal van 768 datapunten. Houd er bovendien rekening mee dat GFP-gelabelde cellen hun fluorescerende signaal na fixatie met formaldehyde kunnen verliezen.
5. Analyseer bacterieel vervoer met behulp van PDMS microfluïde apparaten
- Plaats het PDMS microfluïde apparaat dat eerder verzadigd was met de beweeglijkheidsbuffer op het microscoopstadium. Gebruik tape om de slang te repareren om verstoring van de stroom tijdens de beweging in het stadium te minimaliseren.
- Verplaats de microscoopfase naar het observatiekanaal dicht bij de uitlaat. Met behulp van heldere veldmicroscopie of fasecontrast, focus op het midden van het observatiekanaal en pas de vergroting aan om individuele bacteriële cellen te visualiseren.
- Schakel de lichtpadinstellingen over naar fluorescentiemicroscopie en pas de camerablootstellingstijd aan om individuele bacteriële cellen op te lossen (bijvoorbeeld 100 ms), of zodanig dat fluorescentiesignalen van cellen ten minste 3x sterker zijn dan achtergrondgeluid.
- Steek vervolgens de inlaatbuizen in een buis van 2 mL met de bacteriële suspensie. Draai de pomprichting om en trek de suspensie in met een doorstroomsnelheid van 1 μL min-1.
- Scan de dwarsdoorsnede van het gehele observatiekanaal met een samengesteld beeld om de 2 minuten, gedurende de gehele duur van het experiment.
6. Basisbeeldverwerking
OPMERKING: Het doel van deze basisbeeldverwerkingsroutines is om het aantal bacteriën in de opgenomen beelden te tellen. Optimale verwerkingsprocedures zijn afhankelijk van de technische specificaties van de microscoop en camera, evenals van de fluorescentie-eigenschappen van de bacteriestam die in het experiment wordt gebruikt en moeten daarom worden aangepast.
- Eerst afbeeldingen exporteren in .tiff formaat.
- Afbeeldingen importeren naar een gewenst softwareplatform (bijvoorbeeld MATLAB, ImageJ, R of Python).
- Verwijder cameraruis, dat is een willekeurige variatie van pixelintensiteit in beelden en correct voor optische aberratie. Dit kan worden gedaan het toepassen van een Gaussian filter op elke foto: de grootte van het filter is afhankelijk van de kwaliteit van de camera sensor (bijvoorbeeld CCD of CMOS). De optische aberratie kan worden verwijderd door elke afbeelding te normaliseren door een referentieafbeelding die wordt verzameld bij afwezigheid van het monster met dezelfde optische configuratie.
- Snijd de afbeeldingen bij in een gebied waar u van belang bent.
- Identificeer een drempelwaarde (pixelintensiteit), zodanig dat waarden boven de drempel bacteriële cellen omvatten.
OPMERKING: In het geval dat beelden ongelijk verlicht zijn (vanwege optische aberratie of ruis) kan het handig zijn om een adaptieve drempel toe te passen, die een drempelwaarde kiest op basis van lokale gemiddelde intensiteiten. - Trek van elke afbeelding de bovenaf gedefinieerde drempelwaarde af.
- Binarize het resulterende beeld, zodanig dat bacteriële cellen een waarde van 1 nemen, terwijl achtergrond neemt een waarde van 0.
- Verwijder clusters met een gebied kleiner dan de kleinste bacteriële celgrootte.
- Som de binarized afbeelding op om het totale aantal pixels van de resterende clusters te verkrijgen. Verdeel het aantal pixels door de gemiddelde grootte (in pixels) van een bacteriële cel: dit geeft een schatting van het totale aantal cellen.
- Het kennen van diepte van mening en gebied van onderzoek, zet tellingen in concentratie (deeltjes mL-1).
- Het is van fundamenteel belang om de concentratie van de geïnjecteerde bacteriën suspensie te identificeren. Om dit te doen, injecteren met een spuit 1 mL van bacteriën cultuur suspensie in het observatiekanaal van een schoon microfluïde apparaat. Nota van de afbeelding en bereken de fluent bacteriële concentratie (C0) zoals hierboven beschreven (6,1 tot 6,10).
- Analyseer BTC's door de bacteriële concentratie (C) te normaliseren met een fluent bacteriële concentratie (C0)en c/c0 versus tijd te plotten.
7. Analyseer bacterieel transport op de porieschaal
- Om lokale snelheden en trajecten van bacteriën die door de poreuze matrix worden getransporteerd te analyseren, verplaatst u het microscoopstadium naar het gebied van belang en past u de focus aan het midden van het microfluïde apparaat aan.
- Stel microscoop in op helder veld- of fasecontrast.
OPMERKING: Dit alleen in het geval dat het fluorescentiesignaal van bacteriële cel het opnemen van beelden bij blootstellingstijd niet korter dan de gemiddelde bacteriële tijd toestaat, anders gebruik maken van fluorescentiemicroscopie. - Neem time-lapse-beelden op, bij blootstellingstijd die de verplaatsing van bacteriën vastlegt (korter dan de gemiddelde verplaatsing over een aantal pixels kleiner dan de objectgrootte), en dat optimaliseert bacteriële celdetectie (bijvoorbeeld blootstelling van 20 ms en beelden die elke 50 ms worden opgenomen). Noteren van foto's over een voldoende hoeveelheid tijd om genoeg (statistisch representatief) van de langzaamste trajecten (bijvoorbeeld 3 min) vast te leggen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de computer voldoende schijfruimte heeft. - Als u achtergrondgeluid wilt verwijderen, trekt u van elke afbeelding het gemiddelde van alle opgenomen afbeeldingen af. Om dat te doen, maak je een matrix waarvan het resultaat de som van intensiteit van alle afbeeldingen is, voor elke pixel, en deel deze door het aantal afbeeldingen.
- Bepaal aan de verwerkte afbeelding (Im) de modulus van het numerieke verloop
en normaliseer deze met de maximale waarde(max).
- Binarize de matrix B via intensiteit thresholding, zie stappen 6.7-6.8.
- Voor elk tijdspunt worden bacteriëncoördinaten (x, y in pixel of mm) en het tijdstip van beeldverwerving in een bestand met drie kolommen opgenomen.
- Ten slotte past u een deeltjestrackingscript toe om de geregistreerde gegevens te verwerken en de trajecten van de bacteriën te berekenen. Gebruik bijvoorbeeld het vastgestelde protocol19en de vrij beschikbare Matlab Particle Tracking Code: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
en normaliseer deze met de maximale waarde(max).
8. Onderzoek bacteriële filtratie door middel van depositieprofielen
- Om depositieprofielen van GFP-tagged P. putida KT2440 cellen te verkrijgen door fluorescentiemicroscopie, registreert u een samengesteld beeld van het gehele poreuze kanaal vóór, dat is de achtergrond, en na injectie van bacteriële suspensie door het microfluïde apparaat. Gebruik een belichtingstijd die het mogelijk maakt om een bacterieel fluorescerend signaal (bijvoorbeeld 100 ms) te verkrijgen, zonder het signaal te bleken.
- Afbeeldingen exporteren en importeren in het gewenste softwareplatform (zie 6.1-6.2).
- Verwijder de achtergrond van de beelden die zijn opgenomen na bacteriële injectie.
- Integreer het totale fluorescentiesignaal van bewaarde bacteriën langs transversale delen van het poreuze kanaal.
- Om het depositieprofiel te berekenen, plott u het geïntegreerde florescentiesignaal versus de poreuze kanaallengte.
9. Analyseer bacterieel transport met behulp van PMMA-vloeistofapparaten en stroomcytometrie
- Sluit de peristaltische pomp aan met de inlaat met behulp van buizen met een binnendiameter van 50 cm (1 mm binnendiameter) en de uitstroom met de automatische dispenser met dezelfde slang (50 cm, zie sectie 4).
LET OP: Gebruik de pomp om teeltmedia af te geven en bacteriële cellen te injecteren. Gebruik Luer-lock connectors en driewegkleppen om te schakelen tussen medium en bacteriële suspensie tijdens de constante snelheid release. - Pompteeltmedium in het vloeibare apparaat. Let op de komst van medium bij de uitlaatbuizen die aan de robotautomaat zijn bevestigd.
- Begin met het injecteren van de bacteriële suspensie via het PMMA-vloeistofapparaat met een stroomsnelheid van 0,2 mL min-1,
- Wanneer bacteriën de vloeistofapparaat inlaat bereiken zet de automatische dispenser.
- Om een pulsinjectie te maken, injecteer bacteriële suspensie voor sommige porievolumes (bijvoorbeeld 30), en schakel vervolgens de injectie over naar teeltmedia tot het einde van het experiment.
LET OP: het porievolume van het vloeibare apparaat is ongeveer 0,2 mL, dus bij de geproseerde stroomsnelheid wordt elke minuut een volledig porievolume uitgewisseld. - Zodra een 96 put plaat is voltooid, dek de plaat om verdamping te verminderen en bewaar het op 4 °C.
- Analyseer bacteriële overvloed via flow cytometrie, volgens vastgestelde protocollen20.
OPMERKING: Voeg bijvoorbeeld 25 μL van de groen-fluorescerende nucleïnezuurvlek (Tabel van Materialen) op 0,025 mM (in ultrazuiver water) toe aan elke put. Het vlekken bacteriële DNA, waardoor te kwantificeren door de stroom cytometrie de bacteriële overvloed. Incubeer monsters gedurende 15 minuten in het donker en vervolgens analyseren met behulp van een flow cytometer uitgerust met een 488 nm laser en detectoren op 515 nm. - Voorafgaand aan BTC-analyse, overwegen de verdunning van het monster als gevolg van de toevoeging van fixatieve en vlek. Juiste bacteriële overvloed met een factor 1,35 om rekening te houden met fixatieve en vlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de functionaliteit van de gepresenteerde workflow te illustreren, voerden we experimenten uit met genetisch gemodificeerde Pseudomonas putida KT2440, een gram negatieve motile bacterie die belangrijk is voor bioremediatie en biotechnologie. Genetisch gemodificeerde versies van deze stam die de GFP-productie uitdrukken zijn commercieel beschikbaar. Een niet-motile stam van P. putida KT2440 die niet de relevante structurele en regulerende genen voor beweeglijkheid is ook beschikbaar. Met behulp van zowel motile als niet-motile GFP gelabeld P. putida KT2440, voerden we sequentiële experimenten in PDMS microfluïde apparaten met een willekeurige array van pijlers (Figuur 1B) en opgenomen BTC's (Figuur 2A). BtC's zijn genormaliseerd tot de concentratie van geïnjecteerde cellen (C0). Tegelijkertijd werden bacteriële trajecten op de porieschaal gevisualiseerd via beeldverwerking en deeltjestracking zoals hierboven beschreven (figuur 2B).
Vervolgens hebben we experimenten uitgevoerd met grootschalige vloeistofapparaten gefreesd van PMMA(figuur 1A). Motile en niet-motile P. putida KT2440 (niet-fluorescerend) werden geïnjecteerd in een regelmatig gespoelde poreuze matrix en BBC's werden verkregen met behulp van de vloeibare dispenser en flow cytometrie tellen zoals hierboven beschreven (Figuur 3A). Opvallend, in een poreuze omgeving verstoken van biofilm, motile en niet-motile P. putida KT2440 toonde een duidelijk ander transport gedrag. In een poreuze matrix gekoloniseerd voor 48h met een complexe stroom biofilm gemeenschap, deze verschillen in BTC tussen motile en niet-motile P. putida KT2440 verdwenen (Figuur 3B.)
Figuur 1: Vloeibare hulpmiddelen om microbiële transporten in poreuze media te bestuderen (A) Illustratie van een vloeibaar apparaat dat is gefreesd uit PMMA. De poreuze matrix wordt gefreesd in de basislaag van het apparaat, het deksel wordt gesloten met behulp van schroeven. Een dwarsdoorsnede toont de opstelling van de pilaren in het vloeibare apparaat. De insert toont een poreuze matrix met een regelmatig gesprede raster van pilaren en de respectieve snelheid stroom veld. (B) Het PDMS-apparaat is gemonteerd op een microscopieglasplaat. Getoond zijn de in- en uitstroom, aangesloten op respectievelijk het medium reservoir en de spuitpomp. De observatiekamer voor microscopisch tellen wordt als aparte kamer zonder poreuze matrix op dezelfde microscoopdia geplaatst. De insert toont een poreuze matrix met een willekeurige array van pilaren (in diameter en afstand). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Bacterietransport op kanaal- en porieschaal in het PDMS-vloeistofapparaat (A) BTC's van motile en niet-motile P. putida KT2440 (GFP-label) verkregen met een PDMS-microfluïdisch apparaat en microscopisch tellen. (B) Trajecten van niet-motile cellen op de porieschaal. Kleuren worden gekozen om de differentiatie van trajecten te verbeteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Bacterietransport op kanaal- en porieschaal in het PMMA-vloeistofapparaat (A) BTC's van motile en niet-motile P. putida KT2440 (niet-gelabeld) verkregen met behulp van een PMMA-vloeistofapparaat en het tellen van stroomcytritrie. (B) Het vloeibare apparaat werd gekoloniseerd door een natuurlijke stroomgemeenschap gedurende 2 dagen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Technische tekeningen van het PMMA-vloeistofapparaat. Het apparaat bestaat uit een basiseenheid met de poreuze matrix en een deksel-eenheid met de gaten voor de inlaat en uitlaat. Het apparaat is verzegeld met behulp van 12 schroeven en een O-ring. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier stellen we twee middelen voor om het vervoer van microben door poreuze systemen op eencellig en populatieniveau te bestuderen. Hoewel de studie van transportverschijnselen met BTC-modellering waardevolle inzichten heeft opgeleverd in de verspreiding van ziekteverwekkers of verontreinigingen op de ecosysteemschalen, bestaan er nog steeds moeilijkheden om te variëren van laboratoriumexperimenten tot veldomstandigheden. De hier beschreven tools stellen onderzoekers in staat om de ruimtelijke en temporele schalen experimenteel op te lossen om de ecologische strategieën van microben die relevant zijn voor transport in poreuze omgevingen beter te begrijpen. Experimenteerders kunnen deze systemen gebruiken of wijzigen om andere microbiële eigenschappen dan beweeglijkheid te bestuderen, zoals chemotaxi's of quorumsensing of de geometrie of andere habitatkenmerken van de poreuze matrix wijzigen. Bovendien kan het bacteriële transportgedrag met behulp van deze systemen gemakkelijk worden gekoppeld aan depositieprofielen, die belangrijke inzichten bieden in kolonisatiepatronen en van cruciaal belang zijn om te begrijpen hoe biofilms lokale stroomvelden wijzigen. We verwachten dat een beter begrip van microbiële strategieën om poreuze media te verspreiden en te koloniseren modelvoorspellingen zal verbeteren en zo zal bijdragen aan het beheer van pathogene verspreiding of verontreinigingsbeheersing. Verdere wijzigingen van het systeem kunnen ook bijdragen tot de ontwikkeling van nieuwe filtratie-apparaten of biotechnologie-instrumenten waarin cellen fysiek moeten worden gescheiden.
We raden PMMA-gebaseerde apparaten aan voor grote en langdurige experimenten en PDMS-gebaseerde apparaten voor kleinere experimenten op kortere termijn of wanneer een hoge temporele resolutie van cruciaal belang is. Er moet rekening mee worden gehouden dat de twee materialen verschillende eigenschappen hebben. PdMS is bijvoorbeeld doorlatend voor gas zoals zuurstof, terwijl PMMA gasdicht is. Dit verschil kan worden gebruikt om het gasverbruik in het PMMA-scenario te bestuderen, terwijl PDMS wellicht geschikter is voor experimenten waarbij zuurstofbeperkingen in verband met bacteriële ademhaling ongewenst zijn.
In het algemeen zijn de hier beschreven protocollen gemakkelijk reproduceerbaar en de gegevens die met deze hulpmiddelen worden verkregen, onthullen consequent verschillen in het vervoer van motile- en niet-motilebacteriën. De zelfgemaakte vloeistofdispenser kan worden vervangen door een commercieel verkrijgbaar alternatief. Echter, om redenen van veelzijdigheid en kosteneffectiviteit raden we de hier beschreven. De kritieke stappen in het protocol betreffen hoofdzakelijk de behandeling van de vloeibare apparaten en ervaring met beeldverwerking. De kwaliteit van de gegevens verkregen door middel van beeldanalyse hangt kritisch af van de beeldkwaliteit (voornamelijk bepaald door focus en belichtingstijd) en een passende thresholding strategie. De kwaliteit van de gegevens die wordt verkregen door flow-cytometrische telling hangt sterk af van effectieve bevestiging en kleuring van de cellen en expertise bij de interpretatie van stroomcytometrieresultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We erkennen de hulp van Antoine Wiedmer met de opstelling van de robotdispenser en het dispenser.py script.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
