Summary
Detta protokoll beskriver en metod för montering av Drosophila larver för att uppnå längre än 10 h oavbruten timelapse-avbildning hos intakta levande djur. Denna metod kan användas för att avbilda många biologiska processer nära larv kroppsväggen.
Abstract
Live imaging är ett värdefullt tillvägagångssätt för att undersöka cellbiologi frågor. Drosophila larven är särskilt lämpad för in vivo levande bildbehandling eftersom larv kroppsväggen och de flesta inre organ är transparenta. Kontinuerlig levande avbildning av intakta Drosophila larver längre än 30 min har dock varit utmanande eftersom det är svårt att noninvasively immobilismobilisera larver under lång tid. Här presenterar vi en larv monteringsmetod som kallas LarvaSPA som möjliggör kontinuerlig avbildning av levande Drosophila larver med hög tidsmässig och rumslig upplösning längre än 10 timmar. Denna metod innebär delvis fästa larver till täckslip med hjälp av en UV-reaktivt lim och dessutom hindra larv rörelse med hjälp av en polydimethylsiloxane (PDMS) block. Denna metod är kompatibel med larver i utvecklingsstadier från andra instar till vandrande tredje instar. Vi visar tillämpningar av denna metod för att studera dynamiska processer av Drosophila somatosensory nervceller, inklusive dendrit tillväxt och skada-inducerad dendrite degeneration. Denna metod kan också tillämpas för att studera många andra cellulära processer som händer nära larv kroppsväggen.
Introduction
Time-lapse live imaging är en kraftfull metod för att studera dynamiska cellulära processer. Den rumsliga och tidsmässiga information som tillhandahålls av time-lapse filmer kan avslöja viktiga detaljer för att svara cell biologi frågor. Den Drosophila larven har varit en populär in vivo modell för undersökningar med hjälp av levande bildbehandling eftersom dess genomskinliga kroppsvägg möjliggör noninvasive avbildning av interna strukturer1,2. Dessutom finns många genetiska verktyg i Drosophila för att fluorescerande märka anatomiska strukturer och makromolekyler3. Men långsiktig time-lapse imaging av Drosophila larver är utmanande. Till skillnad från stationära tidiga embryon eller pupae, Drosophila larver rör sig ständigt, vilket kräver immobilisering för levande avbildning. Effektiva sätt att immobilisera levande Drosophila larver inkluderar montering i halocarbon olja med kloroform4,anestesi med isofluran eller Dichlorvos lösning5, och komprimera mellan täckslip och mikroskop bild6. Även om vissa av dessa metoder har använts för mikroskopi, ingen av dem är effektiv för långsiktig live imaging. Andra metoder har utvecklats för att avbilda kroppsvägg si krypande larver med konventionell konfokal mikroskopi eller ljusarkmikroskopi7,8,9. Dessa metoder är dock inte idealiska för övervakning av cellulär dynamik på grund av larvernas rörelse.
Nya metoder har utvecklats för att uppnå långsiktig timelapse-avbildning av Drosophila larver. Med hjälp av en polydimetylsiloxan (PDMS) "larva chip", Drosophila larver kan effektivt immobiliseras genom vakuumgenererad sug i en specialiserad mikrokammare utan anestesi. Denna metod erbjuder dock inte hög tidsmässig upplösning för cellbiologi studier och det har strikta begränsningar för djurstorlek10. En annan metod med hjälp av en anestesienhet uppnått levande bildbehandling av Drosophila larver vid flera tidpunkter och har tillämpats för att studera neuromuskulära korsningar11,12,13,14,15,16. Emellertid, denna metod tillåter inte heller kontinuerlig avbildning längre än 30 min och kräver att använda desfluranupprepade gånger, vilket kan hämma neural aktivitet och påverka den biologiska processen studerade17,18. Nyligen har en ny metod som kombinerar mikrofluidisk enhet och kryonarthesi använts för att immobilisera larver av olika storlekar under korta tidsperioder (minuter)19. Denna metod kräver dock specialiserade enheter som ett kylsystem och längre perioder av immobilisering kräver upprepad kylning av larverna.
Här presenterar vi en mångsidig metod för att immobilisera Drosophila larver som är kompatibel med oavbruten time-lapse imaging längre än 10 h. Denna metod, som vi kallar "Larva stabilisering av partiell bilaga" (LarvaSPA), innebär att följa larv nagelband till en täckslip för bildbehandling i en specialbyggd bildkammare. Detta protokoll beskriver hur man gör bildkammaren och hur man monterar larver på en mängd olika utvecklingsstadier. I LarvaSPA-metoden fästs de önskade karosssegmenten på täckslipen med hjälp av ett UV-reaktivt lim. En PDMS cuboid applicerar dessutom tryck på larverna, vilket förhindrar flykt. Luften och fukten i bildkammaren säkerställer de delvis immobiliserade larvernas överlevnad under avbildningen. Fördelar med LarvaSPA jämfört med andra tekniker inkluderar följande: (1) Det är den första metoden som möjliggör kontinuerlig liveavbildning av intakta Drosophila larver i timmar med hög tidsmässig och rumslig upplösning; (2) Metoden har färre begränsningar av larvstorlek. (3) Bildkammaren och PDMS cuboids kan tillverkas till en minimal kostnad och kan återanvändas.
Förutom att beskriva larv monteringsmetod, ger vi flera exempel på dess tillämpning för att studera dendrit utveckling och dendrite degeneration av Drosophila dendritic arborization (da) nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Att göra bildkammaren
- Metallramen kan konstrueras från ett aluminiumblock i en typisk verkstad. Specifikationerna för ramen illustreras i figur 1A.
- För att konstruera bildkammaren, försegla botten av metallramen med ett långt täckslip (22 mm x 50 mm) och UV-lim(figur 1A). Bota UV-limmet med hjälp av en handhållen UV-lampa.
2. Göra PDMS cuboids
- Förbered formen för PDMS cuboids.
- Fäst lager av förpackningstejp på den inre ytan av en rektangulär (80 mm x 55 mm) Petriskål eller rund cellsodlingsplatta. Använd ett lager (0,063 mm tjock) för andra instar larver, 2 lager (0,126 mm tjock) för tidiga tredje instar larver, eller tre lager (0,189 mm tjock) för sena tredje instar larver (Figur 1B).
- Skär tejpen i remsor av specifik bredd med ett rakblad: 1,5 mm för 1-lagerstejp och 2 mm för 2-lagers eller 3-lagers tejp. Remsans bredd och tjocklek avgör storleken på de larver som den slutliga PDMS-kuben kan hålla. Lämna minst 5 mm utrymme mellan de två remsorna. Ta bort bandlagren som täcker utrymmet(bild 1B).
- Ta bort damm från plattans inre yta med tejp. Formen är klar för användning.
- Förbered PDMS-mixen.
- Blanda 7 g PDMS-bas och 0,7 g härdningsmedel (10:1-förhållande) noggrant i en liten behållare.
- Placera behållaren i en vakuumexsickator i minst 15 min för att avlägsna luft från blandningen.
- Häll långsamt ca 5,5 g PDMS blandning på formen för att nå en 1-2 mm tjocklek(figur 1B).
- Placera PDMS blandningen i vakuumuttorkare igen i minst 15 min för att avlägsna återstående luftbubblor från blandningen. Bryt de sista bubblorna med en pipettspets.
- Bota PDMS på en plan yta i en värmeinkubator vid 65 °C för 2 h.
- Använd ett rakblad för att lossa den härdade PDMS längs kanten av formen och lossa den från formen. Förvara PDMS mellan två bitar av stor tejp i rumstemperatur.
- För tidiga och sena tredje instar larver, skär PDMS i 8 mm x 2 mm x 1 mm cuboids (längs de streckade linjerna i figur 1B)genom att placera spåret som skapats av bandremsan (steg 2.1.2) i mitten av den långa sidan av kuben(figur 1B,C). För andra instar larver, skär kuben till 8 mm x 1 mm x 1 mm.
3. Montering av larver för långvarig timelapse-avbildning
- Förbered den övre täckslipen för montering.
- Välj sex PDMS cuboids med spår som matchar larvernas storlekar. Följ det rekommenderade spåret och storleken på PDMS baserat på steg 2.1.1, 2.1.2 och 2.2.7.
- Ta bort damm från PDMS yta med tejp.
- Fäst fyra bitar dubbelsidig tejp (12 mm x 5 mm) på ett långt följesedel (22 mm x 50 mm) för fixering av PDMS cuboids senare. Utrymmena mellan de två delarna av dubbelhäftande tejp bör vara desamma som bredden på PDMS spåret.
- Applicera en liten droppe (~1,2 μL) UV-lim i spåret på varje PDMS cuboid och tillsätt sex små droppar UV-lim i utrymmet mellan dubbelhäftande tejp på täckslipen.
- Förbered larverna för montering.
- Rengör larverna i vatten med hjälp av ett par pincett för att avlägsna mat från kroppsytan.
- Placera rena larver på en liten bit fuktat mjukpapper i en liten (35 mm) Petriskål utan lock. Placera den lilla Petriskålen i en stor (60 mm) Petri-skålen som innehåller en bit torrt vävnadspapper. I en kemisk huva, applicera 8–12 droppar (160–240 μL) isofluran på det torra mjukpapperspapperet med hjälp av en plastöverföring av pipett och stäng locket på den stora petriskålen.
- Vänta 2–3 min medan du övervakar larverna. Ta ut larverna från den stora Petriskålen när deras munkrokar slutar röra sig.
- Montera djuren.
- För att bilda strukturer på djurets dorsala sida placerar du de immobiliserade larverna på UV-limmet mellan den dubbelsidiga tejpen på täckslipen med den dorsala nagelbanden vänd mot täckslipen.
- Täck varje larv med ett PDMS-block och montera larvens bagageutrymme i PDMS spår. Lämna huvudet och svansen på larven utanför PDMS spåret. Undvik att blockera larvens spiracles av limmet.
- Tryck nedåt på ändarna av PDMS-blocket på dubbelsidig tejp utan att använda kraft på spåret. Dra försiktigt i larvens svans för att platta nagelbanden under PDMS.
- Cure UV-limmet i 4 min med hjälp av en handhållen UV-lampa vid den höga inställningen (ca 0,07 mW/mm2).
VARNING: Skydda ögonen med skyddsglasögon när du använder UV-lampan. - Vänd täckslipen upp och ner och upprepa steg 3.3.4.
- Fukta ett litet glaspapper (15 mm x 30 mm) med 20 μL–30 μl vatten. Placera det fuktade linspapperet längst ner i bildkammaren(bild 1A,D).
- Placera täckslipen på kammaren så att larverna är vända mot insidan av kammaren. Håll båda ändarna av täckslipen till metallytan med UV-lim(figur 1A,D). Larvernas dorsala sida är klar för avbildning under konfokalmikroskop(figur 1E).
4. Bildbehandling
- Bildlarver med lämpligt mikroskop. Alla resultat som visas i detta protokoll(figur 2, figur 3, Video S2, Video S3och Video S4) förvärvades med hjälp av ett konfokalsystem med ett 40x (1,30 NA) oljemål.
5. Återvinning av bildkammare och PDMS cuboids
- Efter avbildning, ta bort oljan på den övre täckslip med hjälp av ett linspapper. Ta bort det övre täckslipen från metallramen genom att skära i utrymmet mellan täckslipen och metallramen med ett rakblad. Bildkammaren är klar för återanvändning.
- Lossa PDMS cuboids från den övre täckslip med pincett. Rulla PDMS cuboids på tejp för att ta bort limrester och damm. PDMS cuboids är redo för återanvändning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Larven imaging kammaren är konstruerad genom limning en skräddarsydd metallram och två coverslips tillsammans. Utformningen av metallramen anges i figur 1A. Drosophila larver inne i kammaren följs den övre täckslip med hjälp av UV-lim och PDMS cuboids. Spåret på PDMS cuboid och dubbelsidig tejp kuben är fäst för att skapa utrymme för att hålla larverna(figur 1B,C). PDMS tillämpar också lätt tryck för att platta larv kroppsväggen och fysiskt begränsa larv rörelse. Slutligen placeras en liten bit våtlinspapper längst ner i kammaren för att ge fukt. Denna inställning kan immobilisera Drosophila larver längre än 10 h för kontinuerlig avbildning. De flesta av djuren lever efter 10 h och kan återvinnas för att växa in i pupal scenen. Bildkammaren rymmer upp till nio larver samtidigt. Figur 1D visar sex sena tredje instar larver monterade i kammaren. Larvernas stammar är fasta medan deras huvuden och svansar är fria att röra sig (figur 1E och Video S1). Denna metod har framgångsrikt använts för att avbilda andra instar till vandrande tredje instar larver med kontinuerlig högupplöst bildbehandling för upp till 15 h. Kammaren är utformad för avbildning med upprätt mikroskop, men installationen fungerar också för inverterade mikroskop genom att helt enkelt vända kammaren.
Här visar vi tillämpningen av LarvaSPA i att studera neuronal dendrite dynamik och dendrite degeneration med klass IV da (C4 da) nervceller som modell(Figur 2, Figur 3, Videos S2-S4). C4 da nervceller är somatosensory nociceptors ligger på larv kroppsväggen, vars dendriter innervate larv epidermis1,20,21,22. C4 da dendriter uppvisar mycket dynamiska tillväxtbeteenden under hela larvutveckling, vilket resulterar i fullständig täckning av kroppsytan eller utrymmesfyllning23. C4 da nervceller har också framgångsrikt använts för att studera dendrit degeneration och förnyelse efter fysisk skada24,25,26,27.
För bildavbildningsdynamik monterades larver från 48 timmar efter äggläggning (AEL) vid andra instar till 120 h AEL vid vandrande tredje instar i bildkammaren för timelapse-avbildning med hjälp av punktskanning av konfokalmikroskopi. Time-lapse filmer togs med en 3 min intervall för att fånga tillväxt beteenden av C4 da dendriter märkt av ppk-CD4-tdTom eller UAS-CD4-tdTom drivs av ppk-Gal46. Under hela bildperioden (upp till 12 h), den höga ordningen dendrit grenar av C4 da nervceller uppvisade komplexa tillväxtbeteenden, inklusive förlängning, upprullning, grenbildning, och gren eliminering (Figur 2A-2F), vilket indikerar hälsan hos nervceller. Våra filmer fångade också homotypic dendro-dendro-dendro mothänder där dendrite tips dras tillbaka efter att ha kontaktat andra dendriter(Figur 2F). Sammantaget visar dessa resultat att time-lapse imaging med LarvaSPA är effektiv för att studera neuroutveckling.
För att avbilda dendritdegeneration använde vi en MaiTai-laser för att bryta primära dendriter nära C4 da neuronal cell organ. Larverna återfanns och monterades i kammaren för bildbehandling från 1,5 h efter skada (AI) (Figur 3, Video S4). Filmerna spelade in viktiga händelser under dendrite degeneration, inklusive dendrite svullnad, dendrit fragmentering, och clearance av dendrite skräp. I samma experiment var larvfettkroppen också konstruerad för att utsöndra Annexin V-GFP (AV-GFP), en sensor som etiketter externalized fosfatidylserin (PS) på cellytan27. Vi observerade specifik märkning av de urartade dendriterna av AV-GFP(figur 3), vilket tyder på att PS exponerades på ytan av degenererande dendriter att fungera som en eat-me signal för efterföljande clearance av phagocytosis27.
Bild 1: Bildkammaren för LarvaSPA montering. (A)Diagram över bildkammaren med detaljerade specifikationer, som visar både den övre vyn och sidovyn. Den ljusblå skuggningen i den övre vyn indikerar det fuktade linspapperet. Kammaren är förseglad med ett överst täckslip och ett bottentäcke. Positionen för en monterad larv illustreras. (B)Diagram över PDMS mögel (den övre vyn) och formen efter fyllning med PDMS blandningen (sidovy). Remsor i grått indikerar två 1-lager, två 2-lagers respektive två bandremsor med tre lager. Den gula skuggningen i sidovyn indikerar PDMS-blandningen i formen. De streckade linjerna anger var de härdade PDMS ska klippas. Sidan vyn i diagrammet ritas inte för att skalas. (C)Fotografier som visar en överstavoch en sidobild av en PDMS cuboid. Skala bar = 1 mm. (D) Fotografier som visar en bildkammare före montering, och en bildkammare med sex immobiliserade sena tredje instar Drosophila larver monterade ryggsida upp. Skalstång = 10 mm. (E) En närmare bild av en larv i (D). Skala bar = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Time-lapse imaging av dendritdynamik. (A-F) Valda ramar från timelapse-filmer av klass IV da neuron dendriter vid specifika tidpunkter efter starten av bildbehandling. Bilder av larverna togs 48 h AEL (A och F), 72 h AEL (B), 96 h AEL (C) och 120 h AEL (D). Nervcellerna är märkta med ppk>CD4-tdTom (A, D, Eoch F) eller ppk >CD4-tdTom (B och C). Blå pilar indikerar dendrit tillbakadragningar jämfört med föregående tidpunkt. Gula pilar indikerar dendrittillägg jämfört med föregående tidpunkt. (E)Dendrite morfologi i slutet av 12 h av bildbehandling. (F)På varandra följande ramar med 3 min intervall er i en film som illustrerar hur en dendritgren i en andra instar larva extended (gula pilar) och därefter dras tillbaka (blå pilar) efter att den tagit kontakt med en annan dendrite. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Time-lapse imaging av dendrite degeneration och exponering av en eat-me signal. Utvalda ramar från en time-lapse film av degenererande dendriter av en klass IV da neuron efter laserskada. Dendriter var märkta med ppk>CD4-tdTom. Eat-me-signalen PS om degenererande dendriter upptäcktes av Annexin-GFP (AV-GFP), som utsöndras av fettkroppen. Gula pilar pekar på grenarna som visar AV-GFP-märkning. Blå pilar pekar på dendriter som genomgår fragmentering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video S1: En tredje instar larva är immobiliserad i skåran av en PDMS cuboid. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video S2: Dendriter sträcker sig och drar sig tillbaka dynamiskt i en andra instar larva. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video S3: Dendriter sträcker sig och drar sig tillbaka dynamiskt i en vandrande tredje instar larva. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video S4: Dendriter urarta och exponera fosfatidylserin efter laserskada i en tredje instar larva. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi LarvaSPA, en mångsidig metod för montering av levande Drosophila larver för långsiktig time-lapse imaging. Denna metod kräver inte att larver återhämtas eller återmonteras, vilket möjliggör oavbruten bildbehandling. Det är därför idealiskt för att spåra biologiska processer som tar timmar att slutföra, såsom dendrite degeneration och förnyelse. Denna metod kan också användas för att avbilda intracellulär kalciumdynamik och subcellulära händelser såsom mikrotubuli tillväxt. Eftersom larvkroppsväggen är stabil under avbildningen kan den rumsliga och tidsmässiga upplösningen justeras så att den passar bildåtergivningsapplikationen till hands (t.ex. för att spåra snabb subcellulära vesicle-rörelse eller för att övervaka långsamma globala förändringar av neuronala grenmönster). Dessutom är denna metod kompatibel med larver i olika utvecklingsstadier och kräver inte speciell utrustning. Således kan LarvaSPA potentiellt användas av många Drosophila labs för att ta itu med olika frågor.
Faktorer som påverkar metodens framgång, inklusive PDMS-kubens natur och larvernas utvecklingsstadium
Storleken på PDMS cuboid och djupet av spåret måste matcha storleken på larverna. En PDMS cuboid för bred för larverna kan täcka huvudet och svansen och orsaka hypoxi. En smal PDMS-kub kanske inte är effektiv för att förhindra att larverna rör sig. Ett för djupt spår på samma sätt skulle inte generera tillräckligt med tryck för att begränsa larvernas rörelse. Ett för grunt spår skulle inte hålla tillräckligt med lim för att fästa larverna till täckslipen. Baserat på vår erfarenhet rekommenderas följande dimensioner av PDMS och spåret för olika stadier av larver: 8 mm x 1 mm x 1 mm PDMS cuboids med 1,5 mm x 1 mm x 0,063 mm spår för andra instar larver (~48 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS cuboids med 2 mm x 2 mm x 0,126 mm spår för tidiga tredje instar larver (~72 h AEL); 8 mm x 2 mm x 1 mm PDMS cuboids med 2 mm x 2 mm x 0,189 mm spår för sena tredje instar larver (~96 h AEL eller äldre).
Vandrande tredje instar larver (vid eller äldre än 120 h AEL) flytta mindre jämfört med yngre och kräver mindre fukt för att överleva en gång monterad i kammaren. De har också en tjockare nagelband och kan uthärda mer fysisk stress. Därför har experiment med vandrande tredje instar larver den högsta framgångsfrekvensen. I våra händer överlevde mer än 80% av vandrande tredje instar larver och förblev orörliga 12 h efter montering. För att förhindra att larver pupariateras under avbildningrekommenderar vi att larverna monteras mellan 96 timmar till 120 h AEL. Yngre tredje instar larver har en större chans att fly eller död under bildbehandling. Normalt skulle minst 2 av 6 unga tredje instar larver monterade i samma kammare överleva och förbli orörlig 10 h efter montering. Vår erfarenhet av andra instar larver är begränsad och överlevnaden är svår att uppskatta. Ändå har vi framgångsrikt avbildat andra instar larver för 7 h med hjälp av denna metod.
Potentiella problem med långsiktig bildbehandling
Även LarvaSPA har varit mycket användbart för imaging dendrit tillväxtdynamik och degeneration, det finns några potentiella varningar att överväga. Först, i vår nuvarande metod, larverna berövas mat under hela avbildningen, vilket kan leda till svält-inducerad svar i många vävnader. Vi har observerat bildandet av granulat strukturer i epidermala celler runt 10 h efter montering, vilket kan bero på autofagi. Därför bör de resultat som erhållits under de första timmarna av avbildning vara mer fysiologiskt relevanta. Resultat över längre tidsskalor kräver mer försiktig tolkning. För att minimera denna oro, skulle vårt förfarande potentiellt anpassas för att möjliggöra larv utfodring. För det andra kan vår metod störa den snabba tillväxten av yngre larver på grund av den fysiska begränsningen och bristen på näringsintag. Denna oro får dock inte gälla äldre djur. Till exempel kan vandrande tredje instar larver förvandlas till puppae även efter 12 h kontinuerlig avbildning, vilket gör denna metod idealisk för undersökningar av tidig metamorfos. För det tredje, bildbehandling av djupare strukturer som fett kroppen och tarmen innebär vissa utmaningar. En huvudorsak är att djupare vävnader ofta rör sig under bildbehandling och därför kräver rörelsekorrigering i efterbehandling. Dessutom kan obalanser av brytningsindex i ljusbanan orsaka sfärisk avvikelse vid avbildning av djupare vävnader. Medan oljemålen är lämpliga för avbildning da nervceller eftersom deras dendriter är inom 15 μm från kroppsytan, kan vatten nedsänkning mål vara bättre val för att korrigera brytning-index missmatchningar för bildbehandling djupare inuti larverna. Fjärde, eftersom C4 da nervceller kan aktiveras av UV-ljus28, med HJÄLP AV UV-ljus under larv montering kan potentiellt ändra C4 da neuron fysiologi. Även om ljusintensiteten vi rekommenderar är långt under de nivåer som robust aktivera C4da nervceller28, resultat relaterade till C4da neuronal aktivitet måste försiktigt tolkas. UV-limmet har använts för att avbilda en mängd olika biologiska prover29,30,31 och orsakar inte uppenbar toxicitet för larverna i våra händer. Slutligen bör man överväga rätt mikroskop setup för in vivo live imaging. Till exempel, resonansskannrar och spinning skiva konfokalmikroskop är bättre alternativ för långsiktig live imaging eftersom de orsakar mindre fototoxicitet och photobleaching; multifotonmikroskopi är effektivare för bildbehandling av djupare inre strukturer i larverna; långsiktig bildbehandling kan vara benägna att prov eller fokus drifting, som potentiellt skulle kunna korrigeras genom efterbildning bearbetning.
De vanligaste orsakerna till misslyckandeför LarvaSPA och de rekommenderade lösningarna för att ta itu med dem
- Larver rör sig för mycket eller fly: Två vanliga orsaker kan bidra till detta problem. Den första är att PDMS spåret kan vara för grunt eller för djupt för larverna. Försöker en annan PDMS cuboid med ett annat spår djup kan lösa problemet. Den andra anledningen är att det finns för mycket fukt i kammaren, försvagar UV-limmet. Att minska volymen vatten som tillsätts linspapperet i kammaren kan hjälpa till att immobilisera larverna. Dessutom, försök att bild bara de segment som omfattas av PDMS cuboid, eftersom huvudet och svansen är fria att flytta.
- Larver dör under avbildning: Om en larv dör strax efter avbildning, är det troligt att det utsattes för för mycket bedövningsmedel. Ordentligt sövda larver bör vakna upp efter montering och visa rörelser inklusive munkrok förlängning och upprullning och dorsala fartyg kontraktion. För att lösa detta problem kan mindre isofluran användas för att södinra larver. Överför en larva ur anestesipetriskålen omedelbart efter att munkroken slutar röra sig. Om larven dör ungefär en timme efter avbildning, är det oftast på grund av uttorkning. Kom ihåg att placera en bit fuktat linspapper i bildkammaren innan du sealing. En annan vanlig orsak till dödlighet är att UV-limmet blockerar spiracles. Försök att begränsa UV-lim till de mellersta segmenten av larven och undvika att täcka huvudet och svansen. En alltför bred PDMS cuboid kan också lätt orsaka UV-lim met att blockera spiracles.
- Veck på kroppsväggen stör avbildning: För att undvika att generera veck under monteringär det viktigt att helt immobilisera larverna under anestesisteget. När en larv är förlamad är det lättare att räta ut och sträcka kroppen. För djur äldre än 96 h AEL, försiktigt dra svansarna innan härdning AV UV-limmet effektivt kan minska vikbildning. Att dra i svansarna på unga larver rekommenderas inte eftersom deras kroppsväggar är ömtåliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Lingfeng Tang för att upprätta en tidigare version av LarvaSPA metoden; Glenn Swan på Cornell Olin Hall Machine shop för att göra tidigare prototyper av bildkammaren; Philipp Isermann för att konstruera metallramar och ge förslag på att göra PDMS cuboids; Cornell BRC Imaging anläggning för tillgång till mikroskop (finansieras av NIH bevilja S10OD018516); Maria Sapar för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av en Cornell Fellowship tilldelas H.J.; En Cornell startfond och NIH bidrag (R01NS099125 och R21OD023824) tilldelas C.H. H.J. och C.H. tänkt ut projektet och utformade experimenten. H.J. utförde experimenten. H.J och C.H. skrev manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
