LarvaSPA, une méthode pour monter la larve de Drosophila pour l’imagerie à long terme de time-lapse

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour monter les larves de Drosophila pour atteindre plus de 10 h d’imagerie ininterrompue en accéléré chez des animaux vivants intacts. Cette méthode peut être utilisée pour l’image de nombreux processus biologiques près de la paroi du corps larvaire.

Résumé

L’imagerie en direct est une approche précieuse pour étudier les questions de biologie cellulaire. La larve Drosophila est particulièrement adaptée à l’imagerie vivante in vivo parce que la paroi du corps larvaire et la plupart des organes internes sont transparents. Cependant, l’imagerie vivante continue des larves intactes de Drosophila pendant plus de 30 min a été difficile parce qu’il est difficile d’immobiliser les larves non invasivement immobilisant pendant une longue période. Ici, nous présentons une méthode de montage larvaire appelée LarvaSPA qui permet l’imagerie continue des larves vivantes de Drosophila avec une résolution temporelle et spatiale élevée pendant plus de 10 heures. Cette méthode consiste à attacher partiellement les larves à la glissière à l’aide d’une colle réactive aux UV et à retenir le mouvement larvaire à l’aide d’un bloc de polydiméthylsiloxane (PDMS). Cette méthode est compatible avec les larves à des stades de développement de la deuxième étoile à la troisième étoile errante. Nous démontrons des applications de cette méthode en étudiant des processus dynamiques des neurones somatosensory de Drosophila, y compris la croissance de dendrite et la dendrite de dendrite des dommages-induits. Cette méthode peut également être appliquée pour étudier de nombreux autres processus cellulaires qui se produisent près de la paroi du corps larvaire.

Introduction

L’imagerie en direct en accéléré est une méthode puissante pour étudier les processus cellulaires dynamiques. L’information spatiale et temporelle fournie par les films en time-lapse peut révéler des détails importants pour répondre aux questions de biologie cellulaire. La larve Drosophila a été un modèle in vivo populaire pour les enquêtes utilisant l’imagerie en direct parce que sa paroi transparente du corps permet l’imagerie non invasive des structures internes^1,2. En outre, de nombreux outils génétiques sont disponibles dans Drosophila pour étiqueter fluorescentement les structures anato....

Protocole

1. Fabrication de la chambre d’imagerie

1. Le cadre métallique peut être construit à partir d’un bloc d’aluminium dans un atelier de machinerie typique. Les spécifications du cadre sont illustrées dans la figure 1A.
2. Pour construire la chambre d’imagerie, sceller le fond du cadre métallique à l’aide d’une longue glissade (22 mm x 50 mm) et de colle UV (Figure 1A). Cure de la colle UV à l’aide d’une lampe UV à main.

2. Fabrication de cuboïdes PDMS

1. Préparer le moule pour les cuboïdes PDMS.
   1. Fixez des couches de ....

Résultats

La chambre d’imagerie de larve est construite en collant un cadre en métal sur mesure et deux couvertures ensemble. La conception du cadre métallique est spécifiée dans la figure 1A. Les larves de Drosophila à l’intérieur de la chambre sont adhérées à la couverture supérieure à l’aide de colle UV et de cuboïdes PDMS. La rainure sur le cuboïde PDMS et le ruban à double face le cuboïde est attaché pour créer l’espace pour tenir les larves (Figure 1B,C

Discussion

Ici nous décrivons LarvaSPA, une méthode polyvalente de montage des larves vivantes de Drosophila pour l’imagerie à long terme de time-lapse. Cette méthode ne nécessite pas de récupération ou de remontage des larves, ce qui permet une imagerie ininterrompue. Il est donc idéal pour le suivi des processus biologiques qui prennent des heures à compléter, tels que la dégénérescence et la régénération dendrite. Cette méthode peut également être utilisée pour l’imagerie de la dynamique du calcium intracellulaire et de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
6061 Barres d’aluminium	McMaster-Carr	9246K421
Ruban adhésif double face 3M	Ted Pella, Inc.	16093
3M Scotch Ruban d’emballage	3M		1.88"W x 22.2 Yards
DUMONT #3 Forceps	Fisher Scientific	50-241-34
Couverture en verre	Azer Scientific	1152250
Isoflurane	Midwest Veterinary Supply	193.33161.3
Microscope confocal Leica		Leica SP8 équipé d’un résonant scanner
Lentille papier	Berkshire	LN90.0406.24
Boîtes de Pétri (moyennes)	VWR	25373-085
Boîtes de Pétri (petites)	VWR	10799-192
Lame de rasoir	Ted Pella, Inc.	121-20
Boîte de Pétri rectangulaire	VWR	25384-322
Kit SYLGARD 184 (kit PBMS)	Electron Microscopy Sciences	24236-10
Pipette de transfert	Thermo Fisher Scientific	1371126
Colle UV	Norland products	#6106, NOA 61 Indice de	réfraction 1,56
Lampe UV (Workstar 2003)	Maxxeon
Dessiccateur sous vide	Microscopie électronique Sciences	71232
Lingettes	Kimberly-Clark	Kimwipes

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