Summary
Dette arbeidet beskriver protokoller for fremstilling av magnetiske nanopartikler, dets belegg med SiO2, etterfulgt av sin aminfunksjonalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens bøyning med deferoksamin ved hjelp av en succinyl moiety som linker. En dyp strukturell karakteriseringsbeskrivelse og en fangstbakterieranalyse ved hjelp av Y. enterocolitica for alle mellomliggende nanopartikler og den endelige konjugaten er også beskrevet i detalj.
Abstract
I det nåværende arbeidet, syntesen av magnetiske nanopartikler, dens belegg med SiO2, etterfulgt av sin aminfunksjonalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens konjugering med deferoxamin, en siderophore anerkjent av Yersinia enterolitica, ved hjelp av en succinyl moiety som en linker er beskrevet.
Magnetiske nanopartikler (MNP) av magnetitt (Fe3O4) ble utarbeidet av solvotermisk metode og belagt med SiO2 (MNP@SiO2) ved hjelp av Stöber-prosessen etterfulgt av funksjonalisering med APTES (MNP@SiO2@NH2). Deretter ble feroxamin konjugert med MNP@SiO2@NH2 av karboksodiimidekobling for å gi MNP@SiO2@NH2@Fa. Morfologien og egenskapene til konjugat og mellomprodukter ble undersøkt av åtte forskjellige metoder, inkludert pulver X-Ray diffraction (XRD), Fourier forvandle infrarød spektroskopi (FT-IR), Raman spektroskopi, røntgen fotoelektronspektroskopi (XPS), overføring elektronmikroskopi (TEM) og energidispergering X-Ray (EDX) kartlegging. Denne uttømmende karakteriseringen bekreftet dannelsen av konjugatet. Til slutt, for å evaluere kapasiteten og spesifisiteten til nanopartiklene, ble de testet i en fangstbakterianalyse ved hjelp av Yersinia enterocolitica.
Introduction
Bakteriedeteksjonsmetodene ved hjelp av MNP er basert på molekylær anerkjennelse av antistoffer, aptamers, bioprotein, karbohydrater konjugert til MNP av de patogene bakteriene1. Tatt i betraktning at siderophores er anerkjent av spesifikke reseptorer på den ytre membranen av bakterier, kan de også knyttet til MNP for å øke deres spesifisitet2. Siderophores er små organiske molekyler involvert i Fe3 + opptaket av bakterier3,4. Utarbeidelsen av konjugater mellom siderophores og MNP sammen med deres evaluering for fangst og isolering av bakterier er ennå ikke rapportert.
Et av de avgjørende trinnene i syntesen av konjugater av magnetiske nanopartikler med små molekyler er valg av type binding eller interaksjon mellom dem for å sikre at det lille molekylet er festet til overflaten av MNP. Av denne grunn var prosedyren for å forberede konjugaten mellom magnetiske nanopartikler og feroxamin – siderophore anerkjent av Yersinia enterocolitica– fokusert på generering av en modifiserbar overflate av MNP for å tillate å knytte den kovalent til siderophore av karmodiimidkjemi. For å få en jevn magnetitt nanopartikler (MNP) og for å forbedre kjernedannelse og størrelseskontroll, ble en solvolyse reaksjon med benzylalkohol båret i en termisk blokk uten å riste5. Deretter ble et silikabelegg generert av Stöber-metoden for å gi beskyttelse og forbedre stabiliteten til nanopartiklene suspensjon i vandige medier6. Med tanke på strukturen av feroxamin, er innføringen av amingrupper nødvendig for å produsere egnede nanopartikler (MNP@SiO2@NH2) som skal konjugeres med siderophore. Dette ble oppnådd ved kondens av (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) med alkoholgruppene tilstede på overflaten av silikamodifiserte nanopartikler (MNP@SiO2) ved hjelp av en sol-gel metode7.
Parallelt ble feroxaminjern(III)-komplekset utarbeidet ved kompleksisering av kommersielt tilgjengelig deferoksamin med jernacetylacetonat i vandig løsning. NN-succinylferoxamin, med ravngrupper som vil fungere som linkers, ble oppnådd ved reaksjonen av feroxamin med ravnanhydrid.
Bøyningen mellom MNP@SiO2@NH2 og N-succinylferoxamine for å gi MNP@SiO2@NH@Fa ble utført gjennom karboksodiimidkjemi ved hjelp av som koblingsreagenser benzotriazol-1-yl-oxy -tris-(dimethylamino)-fosfonium heksafluorofosfat (BOP) og 1-hydroxybenzotriazol (HOBt) i et mykt grunnleggende media for å aktivere terminalsyregruppen i N-succinylferoxamine8.
Når parlamentsmedlemmene ble karakterisert, evaluerte vi egenskapene til nakne og funksjonaliserte magnetiske nanopartikler for å fange villtype (WC-A) og en mutant av Y. enterocolitica som mangler feroxaminreseptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Vanlige parlamentsmedlemmer, funksjonaliserte parlamentsmedlemmer og konjugere MNP@SiO2@NH@Fa fikk lov til å samhandle med hver Y. enterocolitica stamme. Bakteriekonjugat aggregater ble skilt fra bakteriesuspensjon ved påføring av et magnetfelt. De separerte aggregatene ble skyllet to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), re-suspendert i PBS for å forberede seriefortynninger og deretter ble de belagt for kolonitelling. Denne protokollen demonstrerer hvert trinn i syntesen av MNP@SiO2@NH@Fa, strukturell karakterisering av alle mellomliggende og konjugat, og en bakteriefangstanalyse som en enkel måte å evaluere konjugatens spesifisitet i forhold til mellomliggendene. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: For reaksjonene som ble utført under inerte atmosfæreforhold, ble alt glasset tidligere tørket i en ovn ved 65 °C, forseglet med en gummiseptum og renset med argon tre ganger.
1. Syntese av magnetiske nanopartikler konjugert med feroxamin
- Syntese av Fe3O4 magnetiske nanopartikler (parlamentsmedlemmer)
- Tilsett 0,5 g Fe(acac)3 i et 20 ml hetteglass i glass og bland deretter med 10 ml benzylalkohol.
- Sonicate denne blandingen i 2 min, deretter overføre til en varmeblokk og varme ved 180 °C for 72 h.
- Etter at reaksjonen er fullført, la hetteglassene avkjøles, skyll nanopartiklene med 96% etanol og sentrifuge ved 4000 x g i 30 min. Gjenta sentrifugeringen minst to ganger.
- Skill nanopartiklene fra supernatanten ved magnetisk tiltrekning ved hjelp av en neodymium (NdFeB) magnet og kast gjenværende løsningsmiddel.
- Skyll med 96% etanol gjenta trinn 1.1.4. og kast supernatanten alternerende med sonikering i et bad i 1 min ved 40 kHz til løsningsmidlet ser klart ut.
- Magnetiske nanopartikler SiO2 belegg (MNP@SiO2)
- Forbered en suspensjon på 2 g MNP i 80 ml isopropanol og tilsett deretter 4 ml ammoniakk på 2 g, 7,5 ml destillert vann og 0,56 ml tetraetylortosilikat (TEOS) (i denne rekkefølgen) i en rund bunnkolbe med magnetisk rørebar.
- Varm blandingen ved 40 °C i 2 timer med kontinuerlig omrøring og soniker deretter i 1 time.
- Skill MNP med en magnet, kast supernatanten og spre den i 30 ml isopropanol.
- Gjenta trinn 1.2.1. og 1.2.2.
- Fjern og vask den magnetiske rørestangen med 96% etanol for å gjenopprette alt materialet.
- Skill nanopartiklene fra supernatanten ved magnetisk tiltrekning ved hjelp av en magnet.
- Kast supernatanten og skyll nanopartiklene med 96% etanol tre ganger vekslende med sonikering.
- Tørk nanopartiklene under vakuum ved romtemperatur i 12 timer.
- Funksjonalisering av MNP@SiO2 med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
- Skyll 500 mg av MNP@SiO2 hentet fra forrige trinn med N, N-dimetylformamid (DMF) under inert atmosfære og deretter soniker i 1 min ved 40 kHz. Deretter kast supernatanten og gjenta denne prosessen tre ganger.
- Re-suspend partiklene i en rund bunnkolbe, under omrøring med en magnetisk røre bar og tilsett 9 ml APTES.
- Rør blandingen ved 60 °C i 12 timer.
- Kast supernatanten og skyll nanopartiklene med 96% etanol tre ganger vekslende med sonikering.
- Syntese av feroxamin
- Oppløs 100 mg (0,15 mmol) av deferoksamin mesylatsalt og 53,0 mg (0,15 mmol) fe(acac)3 i 5 ml destillert vann og rør blandingen over natten ved romtemperatur.
- Vask det resulterende produktet tre ganger med 20 ml EtOAc i en separasjonstrakt, og fjern deretter det organiske løsningsmidlet under vakuum ved hjelp av en roterende fordamper.
- Fryse-tørke vandig fase for å ha råd feroxamin som en rød fast.
- Syntese av N-succinylferoxamin
- Tilsett 350 mg (3,50 mmol) ravanhydrid til en oppløsning på 100 mg (0,17 mmol) feroxamin i 5 ml pyridin i en 50 ml rund bunnkolbe under inert atmosfære.
- Rør den resulterende blandingen ved romtemperatur i 16 timer. Etter den tiden, fjern overskuddet av pyridin under redusert trykk i en roterende fordamper for å gi en mørk rød fast.
- Oppløs reaksjonen rå i 3 ml metanol.
- Overfør den metaanolic løsningen til en Sephadex kolonne (20 cm av Sephadex i en 20 mm diameter kolonne) og elute på 0,5 ml / min.
- Samle den røde fraksjonen og fjern metanol under vakuum ved hjelp av en roterende fordamper.
- Syntese av konjugatet MNP@SiO2@NH@Fa
- Skyll 30 mg tørr MNP@SiO2@NH2 to ganger med DMF og soniker nanopartiklene i en 100 ml Erlenmeyer kolbe i 30 min under inert atmosfære.
- Forbered en løsning av N-succinylferoxamin (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfonium heksafluorofosfat (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hydroksybenzotriazol (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) og N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) i 10 ml DMF (Mix A) i en 50 ml rundbunnet flaske under inert atmosfære.
- Suspendere tidligere skyllet MNP@SiO2@NH2 i 3 ml DMF under sonikering i tørre under oksygenfrie forhold ved hjelp av en argongassatmosfære (Mix B).
- Tilsett mix A for å blande B dråpevis.
- Rist den endelige blandingen ved hjelp av en orbital shaker ved romtemperatur over natten.
- Skill den resulterende konjugaten (MNP@SiO2@NH@Fa) fra suspensjonen ved hjelp av en magnet.
- Skyll den resulterende faste og deretter soniker det fem ganger med 10 ml etanol.
- Tørk det faste under vakuum i 24 timer.
2. Bakteriell analyse med Y. enterokolitika stammer for å kvantifisere fangst av patogene bakterier med nanopartikler
- Forbered en suspensjon av alle mellomliggende nanopartikler og den endelige konjugaten i PBS ved 1 mg/ml i sterile 2 ml rør.
- Forbered en kultur av Y. enterocolitica i 5 ml Luria Bertani (LB) kjøttkraft over natten inkubering ved 37 °C.
- Forbered en 5 ml jern mangelfull tryptisk soyabuljong (TSB) ved å legge til 50 μL 10 mM 2,2′-bipyridyl.
- Inokuler 5 ml jernmangel TSB med 50 μL av nattens kultur av Y. enterocolitica og deretter inkuber ved 37 °C med agitasjon til en OD600 = 0,5\u20120,8 er nådd.
- Ta 100 μL av kulturen oppnådd i trinn 2.4 og fortynn i et 2,0 ml rør som inneholder 900 μL PBS for å oppnå en første 1/10 fortynning. Deretter forbereder du en 1/100 fortynning fra den første fortynningen ved hjelp av samme prosedyre for å få en konsentrasjon av bakterielle celler ved 1 x 106 koloniformingsenheter (CFU)/ml omtrent.
- Tilsett 100 μL nanopartikler suspensjon ved 1 mg/ml til 1 ml av 1/100 fortynning av bakteriell suspensjon i et 2,0 ml rør, og homogeniser med vortex.
- Inkuber kulturen ved 20 °C i 1 time.
- Skill MNP/bakteriene aggregater ved hjelp av en magnet og kast forsiktig supernatanten.
- Skyll de separerte nanopartiklene to ganger med 1 ml PBS ved hjelp av en vortex.
- Suspender nanopartiklene i 1 ml PBS for å telle mengden bakteriell fangst i CFU/ml.
- Forbered fire påfølgende 1/10 fortynninger fra den tidligere suspensjonen til en 1 x 10-4 fortynning er nådd.
- Plate 10 μL av hver fortynning på TS agarplater og inkuber dem ved 37 °C over natten.
- Fotografer platen med en gel digitalizer i epi hvit modus. Behandle bildet med en passende programvare for å forsterke et sted for å telle antall individuelle kolonier.
MERK: Hver MNP mellomliggende ble karakterisert for å følge opp fremdriften av syntesen. For det første ble bare parlamentsmedlemmer studert av XRD for å sjekke den krystallinske strukturen. Deretter ble FT-IR-spekteret for hvert mellomliggende løp for å kontrollere endringene som oppstod i den tilsvarende reaksjonen. Raman spektroskopi analyse av hvert mellomliggende ble også utført for å bekrefte konklusjonene utledet fra FT-IR spektra. TGA-analyse tillot oss å estimere tapsvekten til mellomliggendene som bærer organisk materiale i strukturen. Morfologien og størrelsen på hvert mellomliggende ble studert av TEM. Til slutt var XPS-analysen avgjørende for å bestemme atomoksidasjonstilstander på hver MNP mellomflate og for å bekrefte den kovalente bindingsformasjonen i konjugatet MNP@SiO2@NH@Fa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En uttømmende strukturell karakterisering utføres for å bestemme morfologien og egenskapene til hvert mellomliggende og den endelige konjugatet. For dette formålet brukes teknikkene XRD, FT-IR, Raman spektroskopi, TGA, TEM, EDX kartlegging og XPS for å demonstrere dannelsen av konjugeringen. Oksidasjonstilstander av atomer på overflaten av nanopartiklene ervervet av røntgenfosterspektroskopi (XPS) er de mest relevante dataene for å bekrefte dannelsen av kovalente bindinger mellom nanopartikkelen og siderophore. I samsvar med disse resultatene er denne protokollen reproduserbar.
Bare MNP, funksjonaliserte parlamentsmedlemmer og konjugering blandes med hver Y. enterocolitica stamme i PBS-oppløsning. Bakterie-parlamentsmedlemmer aggregater er skilt fra suspensjonen ved hjelp av en magnet. Etter skylling av aggregatene to ganger med PBS, blir de suspendert på nytt i PBS for å forberede seriefortynninger som er belagt for kolonitelling.
Mellomprodukter og den endelige konjugaten som ble utarbeidet ved hjelp av denne protokollen, ble sendt til flere teknikker for å vise endringene som finner sted i hvert trinn av syntesen. Infrarød og Raman spektroskopi utgjør en enkel og rask måte å overvåke hvert trinn av syntesen. Tilstedeværelsen av karakteristiske bånd som tilsvarer Si-O, C-Si-C, Fe-O, O = C midt vibrasjon, O = C-N hydroksamisk syre vibrasjon i FT-IR og Raman (se nedenfor) spektra var de første indikatorene på de kjemiske endringene som fant sted på overflaten av de magnetiske nanopartikler i hvert trinn av syntesen.
XRD diffractogram
Figur 1 viser XRD-analysen som brukes til å bekrefte sammensetningen og krystallinsk struktur av syntetiske magnetiske nanopartikler (MNP) av magnetitt sammenlignet med JCPDS fil 00-003-0863.
TEM-analyse
Figur 2C viser lyse flekker av elektrondifraksjonsmønsteret som samsvarer med (111), (220), (311), (400), (422), (511) og (440) diffraksjonsplan av magnetitt tilsvarende d-pacings på 4,9, 2.9, 2.4, 2.0, 1.7, 1.6 og 1.4 Å. Figur 2D og Figur 4E viser derimot TEM-bilder av MNP@SiO2@NH2@Fa tilsvarende dispergert MNP-partikler (~10 nm) innebygd i det amorfe uorganiske organiske materialet. Beleggtykkelsen er over ~ 10 nm.
EDX-analyse
EDX kart viser fordelingen av elementene Fe, O, Si og C på overflaten. Figur 3A viser tydelig tilstedeværelsen av Si på overflaten av MNP@SiO2. Etter aminfunksjonalisering og bøyning med feroxamin, er økning av C på overflaten av nanopartikler i MNP@SiO2@NH@Fa vist i figur 3B som bevis på en vellykket bøyning.
IR-analyse
FTIR spektra av bare MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa er vist i figur 4. Alle FTIR spectra viser begynnelsen på et bånd innenfor spektralområdet av analysen på 600 cm-1 som var relatert til Fe-O vibrasjoner. Tilstedeværelsen av et bredt bånd på 1050 cm-1-tilskrives Si-O-Si strekker vibrasjon- i FTIR spektra av MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa bekreftet silika belegget.
FTIR-spekteret av MNP@SiO2 (Figur 4) viser et bredt bånd mellom 830 og 1275 cm-1 (Si-O-bånd); det blir mer intens etter sin funksjonalisering med APTES i FTIR spekteret av MNP@SiO2@NH2, sannsynligvis på grunn av Si-C obligasjon (forventet mellom 1175 og 1250 cm-1). Til slutt, båndene på 2995 cm-1 (C-H stretching obligasjoner), 1640 cm-1 (O = C-NH midt i II vibrasjon) og 1577 cm-1 (O = C-N hydroksamisk syre vibrasjon) observert i FTIR spekteret av MNP@SiO2@NH@Fa bekreftet bøyning av feroxamin med nanopartikler10.
Termogravimetry analyse
Termogravimetry data er vist i figur 5, som viser vekttap på grunn av tilsetning av organisk materiale og vann.
Raman analyse
Silikabelegget og funksjonaliseringen av den nakne MNP ble også bekreftet av Raman-analyse av hver mellomliggende og MNP@SiO2@NH@Fa (Figur 6). Alle Raman spectra viser topper på 305,8, 537,2 og 665,6 cm-1, tilsvarende Fe-O vibrasjoner (Figur 6A)11, og en skulder på toppen på 713,5 cm-1, relatert til Si-O-Si vibrasjoner (Figur 6B)12. Etter APTES funksjonalisering viser Raman-spekteret av MNP@SiO2@NH2 intense topper på 1001,5 og 1027,4 cm-1, tilsvarende tilstedeværelsen av SiO2, og på 1578,6 og 1597,9 cm-1, som bekrefter dannelsen av Si-C-obligasjoner. Videre bekreftet tilstedeværelsen av en skulder av toppen på 703,0 cm-1 også tilstedeværelsen av APTES (Figur 6C)13,14. Til slutt, den brede toppen mellom 1490 og 1700 cm-1 (sentrert på ~ 1581 cm-1), tilsvarende Si-C obligasjoner og amide grupper i Raman spekteret av MNP@SiO2@NH@Fa, er i samsvar med dannelsen av konjuga (Figur 6D)14.
XPS-analyse
Studien av oksidasjonstilstanden til atomer på overflaten ble utført av XPS-analyse og bekreftet bindingsdannelsen i strukturene. Figur 7 viser XPS-spektraen til de nakne og ulike funksjonaliserte parlamentsmedlemmene. For MNP kan en smal topp i C1 skyldes urenheter i håndteringen av prøven under syntesen. Innføringen av karbon observeres som C-C- og C-H-bindinger i MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa spectra. Analysen av toppen på 399 eV i N1s spektra sammen med sin demping observert for MNP@SiO2@NH@Fa bekrefter dannelsen av midtbindinger mellom MNP@SiO2@NH2 og feroxamin. Videre er eksistensen av N-O-binding av hydroksamiske moieties enig med tilstedeværelsen av en topp på 402 eV. Tilstedeværelsen av en topp på 102 eV i Si2p smal spektra i alle mellomprodukter og konjugeringen er i samsvar med bindende energi for siloxane gruppe15,16.
Z Potensial
Z potensielle verdier vises i tabell 1. Resultatene er negative, -25,21 og -29,35 mV, for henholdsvis MNP og MNP@SiO2. Funksjonalisering med APTES for å gi MNP@SiO2@NH2 endret overflateladningen fra negativ til positiv. Dette faktum ble tilskrevet amingruppene, og overflateladningen er fortsatt positiv for MNP@SiO2@NH@Fa. Den positive overflaten Z potensialet kan forklare samspillet mellom bakterier (hvis overflaten er negativ) og konjugat17,18,19.
Bakterier fange analyse
Antall celler av Y. enterocolitica WC-A og FoxA WC-A 12-8 fanget med MNP mellomprodukter og MNP@SiO2@NH@Fa ble kvantifisert i de fortynninger der 40\u201260 kolonier ble skilt og lett visualisert. Antall fangede celler med bare, MNP@SiO2og MNP@SiO2@NH2 viser ingen signifikante forskjeller blant dem (figur 8). De elektrostatiske kreftene på grunn av frie amingrupper i MNP@SiO2@NH2, og den lave konsentrasjonen av feroxaminmembranreseptor hos bakterier kan rettferdiggjøre mangelen på forventet bindende spesifisitet.
Denne protokollen kan brukes i syntesen av ulike typer konjugater, hovedsakelig de som bruker karboksodiimid kjemi. Det er allsidig nok til å innføre modifikasjoner for å oppnå bedre resultater. Den fullstendige karakteriseringen av alle mellomprodukter og den endelige konjugaten, ved hjelp av de beskrevne teknikkene, gjør det mulig å følge hvert trinn i syntesen og bekrefte dannelsen av ønsket bånd. Tellingen av kolonier i bakteriene fanger opp analysen, ved hjelp av en 10 μL-dråpe, gjør det mulig å teste alle prøvene samtidig i en plate som gjør det lettere å få replikere og utføre analyser under forskjellige forhold.
Figur 1: Sammenligning av MNP (Fe3O4) (lilla) og magnetittmønster (svart) diffractoprammer.
Dette tallet er endret fra Martínez-Matamoros et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Bright felt TEM og elektron diffraksjon bilder av nakne MNP (A, B og C), og av MNP@SiO2@NH@Fa (D, E og F).
Bildene har middels og høy oppløsning. Dette tallet er endret fra Martínez-Matamoros et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: EDX-kart over MNP@SiO2: HAADF-bilde og tilsvarende Fe-, Si-, O- og C-kart over A. MNP@SiO2 og B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Dette tallet er endret fra Martínez-Matamoros et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: FT-IR spektra av bart jernoksid (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Dette tallet er endret fra Martínez-Matamoros et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Termogravimetrisk analyse av MNP, MNP@SiO2@NH2og MNP@SiO2@NH@Fa.
Dette tallet er endret fra Martínez-Matamoros et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Raman spektra med bart jernoksid (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) og MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (**) Andre jernoksid faser, sannsynligvis dannet fra transformasjon av magnetitt av laserkraft. Dette tallet er endret fra Martínez-Matamoros et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: XPS smale spektra av MNP, MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa. Dette tallet er endret fra Martínez-Matamoros et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: CFU av Y. enterocolitica fanget per 100 μg magnetiske nanopartikler: bare, MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa.
(A)WC-A (vill type) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutant mangler feroxamin reseptor FoxA) og SEM bilde av MNP@SiO2@NH@Fa i samspill med Y. enterocolitica. Dette tallet er endret fra Martínez-Matamoros et al.9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel | Z Potensial |
| Mnp | -25.21 |
| MNP@SiO2 | -29.35 |
| MNP@SiO2@NH2 | 17.03 |
| MNP@SiO2@NH@Fa | 22.14 |
| MNP@SiO2@NHBoc@Fa | 19.16 |
| MNP@SiO2@NHCOOH@Fa | 10.96 |
Tabell 1: Z potensielle målinger. Denne tabellen er hentet fra Martínez-Matamoros et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver syntesen av en konjugat mellom magnetiske nanopartikler og siderophore feroxamin ved kovalent binding. Syntesen av magnetitt ble utført ved hjelp av protokollen rapportert av Pinna et al.5 etterfulgt av silikabelegg for å beskytte den magnetiske kjernen av korrosjon i vandige systemer, for å minimere aggregeringen og for å gi en passende overflate for funksjonalisering6. Silikabeleggprosessen ble endret. I stedet for å utføre tre belegg som rapportert av Li et al.6,ble parlamentsmedlemmene belagt med to silikalag i denne metoden (Figur 2D) som var nok til å fortsette med funksjonaliseringstrinnet med APTES7.
Deferoksamin ble komplekst med jern (III) fordi det er utsatt for nedbrytning innen få timer ved romtemperatur. Den beste måten å oppnå jernkomplekset er å bruke jernacetylacetonat fordi rensingen ved flytende væskeutvinning er veldig enkel og feroxamin oppnås i et kvantitativt utbytte. Feroxamin er stabil og kan endres for å gi N-succinylferoxamine ved hjelp av ravnanhydrid for å legge til en terminal sur gruppe som linker. Rensingen av størrelse eksklusjon kromatografi tillater fjerning av overflødig ravanhydrid og ravsyre fra N-succinylferoxamine.
Aminetanokomposittet ble brukt Ntil å knytte N-succinylferoxamin kovalent på overflaten. Nukleær magnetisk resonans (NMR) kan ikke brukes til strukturell belysning av produktene på grunn av den paramagnetiske oppførselen til jernoksid. Av denne grunn ble hvert reaksjonstrinn overvåket av FT-IR og deretter bekreftet av Raman spektroskopi. Topper dekonvolution og montering ble gjort med en praktisk programvare tar hensyn til at Raman spectra inkludert ti mål på 300 s med en total måltid på 3000 s. Morfologi og størrelse ble målt ved TEM observere pseudosfærisk form magnetitt med en homogen størrelse distribusjon av 10 nm (Figur 2A,B). Konjugatbeleggtykkelsen viser et 10 nm homogent lag (Figur 2D,E).
Det er svært vanskelig å få et TEM-felt hvor nanopartikler kan observeres individuelt på grunn av sin magnetiske karakter og dens tendens til å agglomerere. EDX-kartlegging ble brukt til å innhente informasjon om sammensetningen av hvert element på overflaten (Figur 3A). Karbontettheten ble tydelig økt i konjugatet MNP@SiO2@NH@Fa (Figur 3B) i forhold til mellomliggende MNP@SiO2.
Bakteriefangstanalysen ble designet for å teste konjugatens evne til å fange bakterier gjennom feroxaminens ytre membranproteinreseptor. Yersinia enterocolitica WC-A stamme ble valgt fordi den uttrykker FoxA feroxamin reseptor og er lett å vokse. Det kritiske trinnet i denne prosedyren var fjerning av ikke-fangede bakterier. Dette ble oppnådd ved skylling og vortexing med steril pbs to ganger etterfulgt av å gjenopprette bakterier-konjugat aggregater ved hjelp av en magnet. Antallet fanget celler av hver av MNP mellomliggende, brukt som kontroll, og konjugat MNP@SiO2@NH@Fa ble bestemt av kolonitelling fra fortynningsmetode. Ved hjelp av 10 μL dråper forenkler eksperimentell prosedyre og gjør det mulig å håndtere mer enn fire prøver redusere kostnadene for testen i form av tid og materiale i forhold til den klassiske metoden for plakk telling kolonier.
Den viktigste begrensningen av syntesen av MNP@SiO2@NH@Fa konjugere er at det ikke er mulig å bekrefte obligasjonsdannelsen av NMR. Selv om utarbeidelsen av MNP@SiO2@NH@Fa virker enkel, er bruken av de strukturelle karakteriseringsteknikkene avgjørende for å bekrefte koblingen mellom siderophore og MNP gjennom et covalent bånd.
Etter den nåværende protokollen er det mulig å generere konjugater ved hjelp av karmododiimidkjemi. For å oppnå dette er det nødvendig med tilstedeværelse av aminogrupper på parlamentsmedlemmenes overflate og en karboksylsyrefunksjonalitet i interesseforbindelsen. Testing av ulike linkers og belegg parlamentsmedlemmene overflaten med andre funksjonelle grupper for å unngå å skape positive kostnader på det kan forbedre bakteriell fangst diskriminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig professor Klaus Hantke (Universitetet i Tübingen, Tyskland) for vennlig å levere Yersinia enterocolitica stammer som brukes i dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd AGL2015-63740-C2-1/2-R og RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) fra State Agency for Research (AEI) i Spania, co-finansiert av FEDER-programmet fra EU. Arbeidet ved Universitetet i Santiago de Compostela og Universitetet i La Coruña ble også støttet av tilskudd GRC2018/018, GRC2018/039 og ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC strategisk gruppe) fra Xunta de Galicia. Til slutt vil vi takke Nuria Calvo for hennes store samarbeid med å gjøre av denne videoprotokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X.
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
