Summary
생체 내에서 단백질의 빠른 광화학적 산화 (IV-FPOP)는 그들의 모국 환경에서 단백질 구조의 매핑을 허용하는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국 기술이다. 이 프로토콜은 IV-FPOP 미세유체 흐름 시스템의 조립 및 셋업을 설명합니다.
Abstract
단백질의 빠른 산화 (FPOP)는 단백질 구조, 단백질 리간드 상호 작용 및 단백질 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 하이드록실 라디칼 단백질 풋프린트 (HRPF) 방법입니다. FPOP는 248 nm의 KrF 엑시머 레이저를 사용하여 과산화수소의 광분해를 통해 하이드록실 라디칼을 생성하여 산화적으로 접근할 수 있는 아미노산 측사슬을 변형시합니다. 최근, 우리는 Iv-FPOP라는 제목의 예쁜꼬마선충 (C. elegans)에서생체 내 산화 라벨의 FPOP의 사용을 확대했습니다. 투명한 선충은 많은 인간 질병에 대한 모델 시스템으로 사용되어 왔다. IV-FPOP에 의한 C. elegans의 구조 연구는 과산화수소를 섭취하는 동물의 능력, 248 nm에서 레이저 조사에 대한 투명성 및 수정의 돌이킬 수없는 특성 때문에 가능합니다. IV-FPOP 라벨링, IV-FPOP 파라미터, 단백질 추출, LC-MS/MS 최적화 파라미터에 대한 미세유체 유동 시스템의 조립체는 본원에 기재되어 있다.
Introduction
질량 분석법(MS)에 결합된 단백질 발자국은 단백질 상호 작용 및 형태 변화를 연구하기 위해 최근 몇 년 동안 사용되어 왔다. 하이드록실 라디칼 단백질 풋프린트(HRPF) 방법은 단백질 아미노산 측사슬을 변형하여 단백질 용매 접근성을 조사합니다. HRPF 방법, 단백질(FPOP)의 빠른 광화학적산화는 1,시험관내 단백질 구조를 프로브하는데 사용되어 왔으며, 체외2, 세포내(IC-FPOP)3,가장 최근에는 생체내(IV-FPOP)4.2 FPOP는 248 nm 파장 엑시머 레이저를 사용하여 과산화수소의 광분해에 의해 하이드록실 라디칼을 빠르게 생성하여 하이드록실 라디칼을 형성합니다1. 차례로, 이러한 라디칼은 마이크로 초 시간 규모에 20 개의 아미노산 중 19 개에 라벨을 붙일 수 있으며 단백질이 전개 될 수있는 것보다 빠릅니다. 하이드록실 라디칼을 가진 각 아미노산의 반응성은 1000배 연장되지만, 보호인자(PF)5를계산하여 측연쇄 산화를 정상화할 수 있다.
FPOP는 크기 나 1 차 서열에 관계없이 단백질을 산화적으로 변형 시킬 수 있기 때문에 세포 내 및 생체 내 단백질 연구에 유리하다는 것이 입증되었습니다. IV-FPOP프로브 C. 예쁜꼬마선충의 단백질 구조는 시험관내 및 세포내연구4. C. 예쁜꼬마선충은 선충계의 일부이며 인간의 질병을 연구하는 모델로 널리 사용됩니다. 수동 및 활성 확산에 의해 과산화수소를 섭취하는 웜의 능력은 다른 신체 시스템에서 단백질 구조를 연구 할 수 있습니다. 또한, C. 예쁜꼬마선충은 FPOP6에필요한 248nm 레이저 파장의 투명성으로 인해 IV-FPOP에 적합합니다. 이 방법을 질량 분광법에 결합하면 기존의 상향식 프로테오믹스 접근법을 사용하여 여러 변형 된 단백질을 식별 할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 C. elegans에있는 단백질 구조의 분석을 위한 IV-FPOP를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 실험 프로토콜은 Konermann 외7에서적응된 IV-FPOP를 위한 미세 유체 흐름 시스템의 조립 및 설치를 요구합니다. IV-FPOP 후, 샘플은 단백질 추출을 위해 균질화됩니다. 단백질 샘플은 프로테오로이징되고 펩티드는 액체 크로마토그래피(LC) 탠덤 MS에 의해 분석되고, 그 다음에 정량화됩니다.
Protocol
1. C. 예쁜꼬마선충 유지 보수 및 문화
- 성장하고 표준 실험실 절차 다음 자신의 네 번째 애벌레 (L4) 단계에 벌레 식민지를 동기화8.
- IV-FPOP 실험의 날, M9 완충액(0.02 M KH2PO 4, 0.08 M Na 2 HPO4,0.08 MNa2HPO4,0.08 M NaCl, 1 MM MgSO4)으로세균성 잔디(OP50 대장균)로부터L4 웜을 세척한다.
- IV-FPOP 샘플당 ~10,000개의 웜의 500 μL aliquots를 얻습니다.
2. 미세 유체 흐름 시스템 어셈블리
- 불소 에틸렌 프로필렌(FEP) 튜브(1/16in) 외경(o.d.) x 0.020 in. 내경(i.d.))의 2cm 조각을 절단하여 유동 시스템 조립을 시작합니다.
- 깨끗한 해부 바늘을 사용하여 FEP 튜브의 i.d.를 넓히면 한쪽 끝에서만 작은 분화구를 만들기 위해 ~ 50mm 길이로 만듭니다. 분화구는 융합 된 실리카 의 두 360 μm o.d. 조각에 맞게 충분히 커야한다.
참고: 이 끝은 출구 모세관에 맞게만 사용되기 때문에 반대쪽 끝을 넓이지 마십시오. - 세라믹 커터로 250 μm 즉, 융합 실리카의 두 15cm 조각을 잘라. 이 두 조각은 흐름 시스템의 주입 라인이 될 것입니다.
- 자체 점착 테이프를 사용하여 250 μm 즉, 모세 혈관을 서로 평행하게 하고 끝이 100% 플러시되도록 테이프를 붙입니다.
참고: 융합된 실리카 끝이 절단 후 분쇄되지 않고 직선이고 100% 서로 플러시되도록 하려면 돋보기 또는 스테레오 현미경으로 검사하는 것이 좋습니다. - 두 개의 테이핑된 모세혈관을 FEP 튜브의 수제 분화구에 삽입합니다. 모세 혈관을 수제 분화구의 가장자리까지 밀어 넣습니다.
주의: 유량 시스템의 효능을 유지하기 위해 수제 분화구를 지나밀어두지마십시오(그림 1a). - 깨끗한 표면에 에폭시 수지의 작은 점을 놓고 해부 바늘과 혼합.
- 신속하게 동일한 바늘을 사용하여 FEP 튜브와 연결하고 수지가 몇 분 동안 콘센트 쪽을 위로 매달려 건조 할 수있는 주입 모세 혈관의 끝에 작은 수지 한 방울을 놓습니다(그림 1a).
- 수지가 건조하는 동안, FEP 튜브와 두 개의 모세 혈관을 결합, 새로운 250 μm 즉, 모세관을 잘라. 새로운 모세관은 유동 계통의 출구 모세관이 될 것입니다. 모세관의 원하는 길이는 아래 방정식을 사용하여 계산할 수 있습니다.
l이 센티미터로 절단되는 모세관의 길이인 경우, t는 분에서 원하는 반응 시간, f는 mL/min의 유속이고, i.d.는 센티미터의 모세관의 내경이다.
참고: 출구 모세관을 절단한 후 끝이 곧고 부서지지 않도록 검사합니다. - 수지가 건조되면 FEP 튜브 배출구 끝을 통해 새로운 모세관을 삽입합니다. 출구 모세관의 내부 말단과 두 주입 모세관은 FEP 튜브 내부에서 서로 플러시되어야하며, 이것은 혼합-T(도 1b)를생성한다.
- 2.6 단계 및 2.7단계에서 설명된 바와 같이 출구 모세관 및 FEP 튜브를 신선한 에폭시 수지와 결합합니다.
- 수지가 유동 계통을 함께 결합하여 하룻밤 동안 건조시키십시오. 다음날 미세유체 유동 시스템을 설정합니다(그림1c).
3. 생체 내 FPOP용 미세 유체 흐름 시스템
- 5mL 주사기 1개에 4개의 자기 교반기를 삽입합니다. 이 주사기는 샘플 주사기가됩니다. 마그네틱 교반기는 IV-FPOP(그림2A)동안주사기 내부에 벌레가 침전되는 것을 방지합니다.
- M9로 두 개의 5mL 주사기를 채웁니다. 각 주사기 내부에 유속 및 혼합 효율에 영향을 줄 수 있는 기포가 없는지 확인합니다.
- Luer 어댑터를 각 5mL 주사기에 연결하여 손가락이 단단하고 제자리에 고정되도록 합니다.
- 각 주사기를 단일 3-2 밸브에 부착합니다. 주사기는 밸브의 중간 포트에 부착해야합니다(그림 2B).
- 각 5mL 주사기를 듀얼 주사기 펌프에 고정하고 기계식 스톱 칼라를 조정하여 푸셔 블록에서 주사기에 대한 과압을 방지합니다. 스톱 칼라를 설정할 때 마그네틱 스터러를 추가하십시오.
- 수제 미세 유체 유량 계통의 각 주입 모세관 단부는 슈퍼 플란체 너트, FEP 슬리브 및 슈퍼 플란체 페룰을 사용하여 각 3-2 밸브의 상단 포트에 부착합니다(그림2B).
- 3-2 밸브(하단 포트)의 나머지 개방된 포트에, 10 cm 450 μm i.d. 모세관을 슈퍼 플랑체 너트, FEP 슬리브 및 슈퍼 플랑체 페룰을 사용하여 부착한다(도2B). 이 모세 혈관은 철회 견본 모세 혈관이 됩니다.
- 펌프 흐름을 시작하고 미세 유체 유량 시스템의 모든 연결부에서 시각적 누출을 확인합니다. 실험 유량을 사용하여 적어도 3개의 주사기 부피를 흐르게 한다. 최종 유량은 레이저 조사 창, 레이저 주파수 및 제로 배제 분획 체적에 따라 달라집니다.
참고: 이 프로토콜의 경우, 375.52 μL/min의 최종 유량은 2.55 mm, 250 μm i.d. 융합 실리카, 제로 배제 분획 및 50 Hz 주파수의 레이저 조사 창에서 계산되었습니다.- 유동 경로는 3-2 밸브 핸들의 화살표로 표시됩니다. 각 주사기는 밸브 핸들을 추방 위치에서 인출 위치로 이동하여 수동으로 리필할 수 있습니다.
참고: 3-2 밸브의 누출은 슈퍼 플란소 너트를 다시 나사로 조이거나 밸브 연결부(슈퍼 플란젤 너트, FEP 슬리브 또는 슈퍼 플랑글레스 페룰)를 교체하여 고정할 수 있습니다. 혼합-T에서의 누수는 미세 유체 유동 시스템의 재조립이 필요합니다(단계 2.1 ~ 2.11).
- 유동 경로는 3-2 밸브 핸들의 화살표로 표시됩니다. 각 주사기는 밸브 핸들을 추방 위치에서 인출 위치로 이동하여 수동으로 리필할 수 있습니다.
- 미세 유체 흐름 시스템을 실험 벤치로 옮기고 360 μm 의 스테인레스 스틸 유니온을 사용하여 방사 단계에 출구 모세관을 고정합니다(그림 2C,D).
- 긴 리치 라이터를 사용하여 레이저 조사 창에서 융합 실리카 코팅을 구울 수 있습니다. 보풀이없는 조직과 메탄올을 사용하여 연소 된 코팅을 청소하십시오.
참고: 과도한 열이 모세관을 녹이거나 파손할 수 있기 때문에 모세관을 과열하지 않도록 연소 주기와 메탄올 세척 주기를 번갈아 가며 피하십시오. - 자기 교반기를 포함하는 5 mL 주사기 위에 자기 교반기 블록을 놓습니다. 5mL 주사기 내부의 자기 교반기가 천천히 그리고 지속적으로 회전되도록 자기 교반기 블록의 속도와 위치를 조정합니다.
4. 생체 내 FPOP
- KrF 엑시머 레이저를 켜고 티라트론이 워밍업되도록 합니다.
주의: 레이저는 눈을 손상시킬 수 있는 248nm 파장에서 가시광선과 보이지 않는 방사선을 방출합니다. 레이저를 켜고 빔 출구 창을 열기 전에 적절한 눈 보호 기능을 착용해야 합니다. - 빔 출구 창에 광학 센서를 배치하여 최소 100펄스동안 50Hz의 주파수에서 레이저 에너지를 측정합니다.
참고: 이 프로토콜의 경우, 150±2.32 mJ의 레이저 에너지와 함께 2.55 mm 조사 창을 사용하였다. - 약 10,000개의 웜(500 μL)을 얻고 샘플을 샘플 주사기로 수동으로 인출합니다.
- 3 mL의 최종 샘플 볼륨에 대한 M9 버퍼의 2.5 mL로 샘플 주사기를 채웁니다. 샘플 주사기에 기포가 유입되지 않았는지 확인합니다.
- 200 mM H2O2의3 mL로 두 번째 주사기를 채우고 다시 주사기에 기포가 유입되지 않도록하십시오.
- 출구 모세관의 끝에, 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-α-phenylnitrone (PBN) 및 1 % 디메틸 설옥사이드 를 포함하는 알루미늄 호일에 싸여 15 mL 원추형 튜브를 배치, 과잉 H2O, 라디악을 담급질 수로, 라디칼2O. 메티오닌 설폭사이드 환원효소 활성을 각각 억제한다.
- 소프트웨어 창에서 엑시머 레이저를 시작하고 첫 번째 펄스를 기다린 다음 이중 주사기에서 샘플 흐름을 시작합니다.
참고 : 샘플은 3 샘플 조건하에서 생물학적 중복으로 실행되어야합니다 : H2O2 (샘플)를 사용한 레이저 조사, H2O2를 사용한 레이저 조사 없음 및 레이저 조사 없음 H2O2 (컨트롤), 생물학적 세트 당 9 개의 샘플로 합산됩니다. - 15 mL 튜브에서 전체 샘플을 수집하는 동시에 시료 주사기의 일부 배압이 때때로 축적될 수 있기 때문에 시각적 누출에 대한 샘플 흐름을 능동적으로 모니터링합니다.
- IV-FPOP에 이어, 805 x g에서 원심분리에 의한 펠릿 웜을 2분 동안 2분 동안 담금질 용액을 제거하고, 용해 완충액 250 μL(8M 우레아, 0.5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EDTA, 1 mm 페닐틸설론 플루오라이드)을 추가한다. 샘플을 깨끗한 미세원심지 튜브로 옮기고, 플래시 동결하고, 시료가 소화될 때까지 -80°C에서 보관한다.
5. 단백질 추출, 정제 및 단백질 용해
- 얼음에 냉동 샘플을 해동하고 10 초 동안 초음파 처리로 균질화한 다음 60 초의 얼음 배양을 합니다. 초음파 처리의 다중 라운드가 요구될 수 있고, 균질은 현미경 슬라이드에 2 μL 샘플 aliquot를 배치하여 입체 현미경 하에서 관찰될 수 있다. 샘플 균질화는 작은 벌레 조각이 보이지 않는 경우 완료됩니다.
- 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 균질화된 웜을 깨끗한 미세원심지 튜브로 포집한다.
- 제조업체의 지침을 사용하여 비신콘닌산 분석법(BCA 분석)을 사용하여 샘플 단백질 농도를 결정합니다.
참고: 시료 농도는 임의의 생화학적 단백질 농도 분석측정을 사용하여 결정될 수 있다. 용해 완충제 (8 M 요소, 0.5 % SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF)와의 시약 호환성을 염두에 두십시오. 또한 버퍼 희석이 필요할 수 있습니다. - 각 샘플에서 100 μg의 단백질을 얻고 깨끗한 미세 원심 분리튜브에 놓습니다.
- 디티오트레이톨(DTT)을 10 mM 최종 농도에 첨가하여 모든 시료에서 이황화 결합을 감소시소. 소용돌이, 스핀다운, 50°C에서 45분 동안 시료를 배양한다.
- 샘플을 실온으로 10분 동안 식힙니다.
- 이오도아세타미드(IAA)를 50 mM 의 최종 농도에 추가하여 감소된 잔기를 알킬레이트합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 소용돌이, 스핀다운 및 20분 동안 샘플을 배양합니다.
- 알킬화 직후, 100% 미리 냉각된 아세톤의 4부량을 첨가하여 단백질 샘플을 침전시키고 -20°C에서 밤새 배양한다.
- 다음날, 펠릿 단백질은 10분 동안 16,000 x g에서 원심분리하여 침전합니다.
- 단백질 펠릿을 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL)에 다시 일시 중단합니다. 마지막 프로테아제에서 1:50(w/w)의 단백질 비에 트립신을 넣고 밤새 37°C에서 샘플을 소화합니다.
- 다음날 5% 포산산을 첨가하여 트립신 소화 반응을 담금질한다.
참고: LC-MS/MS 분석(단계 6.1-6.5)에는 샘플당 최소 0.5 μg의 펩티드가 필요합니다. 제조업체의 프로토콜에 의해 설명된 바와 같이 정량적 배색 펩티드 분석법(재료 표참조)을 사용하여 샘플 펩티드 농도를 결정합니다.
6. 고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)
- 다음 LC 이월 단계를 사용하십시오: 0.1% FA(A)의 물 과 0.1% FA(B)에서 ACN.
- 0.5 μg의 펩티드를 C18(5 μm, 100 Å)을 함유한 트랩 컬럼(180 μm × 20mm)에 적재하고 15 μL/min 유량에서 99% 용매 A 및 1% B로 시료를 세척합니다.
- C18 역상 물질(5 μm, 125 Å)을 가진 사내 포장 컬럼(0.075 mm i.d. × 20 mm)을 사용하여 분리된 펩타이드.
- 다음 분석 분리 방법을 사용: 그라데이션은 120 분 동안 300 nL / min에서 펌핑되었다 : 0-1 분, 3 % B; 2-90 분, 10-45 % B; 100-105 분, 100 % B; 106-120 분, 3 % B.
- 고분해능 질량 분석계를 사용하여 양성 이온 모드 나노 전기 분무 이온화(nESI)에서 펩타이드의 데이터 수집을 수행합니다.
참고: 이 프로토콜의 경우 고해상도 질량 분석기와 초고성능 LC(UPLC) 계측기 커플을 활용했습니다. 데이터 종속 수집이 활용되었습니다. MS1의 m/z 스캔 범위는 60,000 해상도에서 3750-1500이고 60s 동적 제외입니다. 충전 상태가 +1 및 >6인 이온은 제외되었습니다. 5.5e5의 자동 게인 제어(AGC) 타겟을 최대 주입 시간 50ms및 강도 임계값 5.5e4로 사용하였다. MS2에 대해 선택된 이온은 32% 정규화된 충돌 에너지를 사용하여 고에너지 충돌 해리(HCD) 단편화를 행하였다. 분광계에서 15,000개의 분해능과 5.0e4 AGC 표적을 가진 이온이 검출되었습니다.
7. 데이터 분석
- C. elegans 데이터베이스에 대한 상향식 프로테오믹스 분석 소프트웨어와 함께 MS 파일을 검색합니다.
- 다음과 같이 단백질 분석 검색 매개 변수를 설정: 하나의 트립신 놓친 절단, 375-1500 m/z 펩티드 질량 범위, 0.02의 단편 질량 허용 오차, 10 ppm의 전구체 질량 허용 오차. 카르바미도메틸화는 정적 변형으로 설정되고 모두 하이드록실 라디칼 측체인 변형9,,10을 동적으로 알고 있다. 펩타이드 식별은 95% 신뢰도(중간) 및 잔류물 99% 신뢰도(높음)로 확립됩니다. 거짓 발견 률(FDR)은 1%로 설정됩니다.
- 전자 데이터베이스로 데이터를 내보내고11이하의 방정식을 사용하여 펩타이드 또는 잔류물당 산화 정도를 요약합니다.
참고: EIC 영역이 변형된 경우 산화 변형을 가진 펩티드 또는 잔기의 추출된 이온 크로마토그래피 영역(EIC)이며, EIC 영역은 산화 변형유무에 관계없이 동일한 펩티드 또는 잔기의 총 면적이다.
Representative Results
IV-FPOP에 사용되는 미세 유체 흐름 시스템에서,H2O2 및 웜은 레이저 조사 직전까지 분리되어 유지됩니다. 이러한 분리는 내인성 카랄라아제 및 기타 세포메커니즘(12)에의한H2O2의 분해를 제거한다. 250 μm i.d. 모세관의 사용은 2개의 생물학적 복제에 걸쳐 63-89% 사이 총 샘플 회수를 보여주고, 반면 150 μm i.d. 모세관은 단지 21-31% 회복을 나타낸다(그림 3A). 더 큰 i.d. 모세관(250 μm)의 사용은 IV-FPOP 및 단일 웜 흐름 동안 더 나은 웜 흐름을 유도한다(그림3B)는작은 i.d. 모세관(150 μm)과 비교했을때(도 3C). 150 μm i.d. 모세관은 단일 웜 흐름을 허용하지 않습니다(그림 3C)여러 웜은 단일 웜 당 레이저 노출의 양을 감소 레이저 조사 창에서 함께 흐르는 볼 수 있습니다.
IV-FPOP은 C. elegans에서용매 접근성을 조사하는 공유 라벨 링 기술입니다. 도 4A는 FPOP 변형 및 변형되지 않은 펩티드의 대표적인 추출된 이온 크로마토그램(EIC)을 나타낸다. 하이드록실 라디칼 라벨은 산화적으로 변형된 펩티드의 화학을 변화시켜 FPOP 변형 펩티드를 더 극성으로 만듭니다. 역상 크로마토그래피에서, IV-FPOP 변형 펩티드는 수정되지 않은 펩티드보다 더 일찍 보유 시간을 가미한다. 분리된 펩티드의 MS/MS 단편화는 산화적으로 변형된 잔기의 동정을 허용한다(도4B).
IV-FPOP은 C. elegans 내의 2개의 생물학적 복제에 걸쳐 총 545개의 단백질을 산화적으로 변형시키는 것으로나타났다(그림 5A,B). 단백질 풋프린트 방법으로 IV-FPOP의 장점은 벌레 내의 다양한 신체 시스템에서 단백질을 수정하는 기술의 능력에의존한다(도 5C). 이 방법은 벌레 내의 바디 조직 또는 기관에 관계없이 단백질 구조 및 단백질 상호 작용을 탐구하는 것을 허용할 것입니다. 또한, 탠덤 MS 분석은 생체 내에서 IV-FPOP 프로브 용매 접근성을 확인한다. 미오신 샤페론 단백질을 복합적으로 복합적으로 하는 열충격 단백질 90(Hsp90)의 산화 패턴을 UNC-45로 분석하였다(도6). Hsp90에 대한 MS/MS 분석은 4개의 산화 변형 잔기(도 6C,D)FPOP 변형(ln(PF))의 정규화된 정도를 나타내며,5는 Hsp90의 잔류물 M698이 잔류물 R697, E699 및 E70에 결합될 때 UNC-45에 결합될 때 보다 덜 용매에 접근할 수 있음을 나타낸다(그림Figure 66C,D). 산화의 이러한 차이는 문헌 용매 접근 표면적(SASA) 계산(PDB 4I2Z13)에의해 검증된다. 잔류물 M698은 SASA 값이 0.03이며, 잔류물 R697, E699 및 E700과 비교하여 SASA 값이 높은 것으로 간주됩니다(그림6C). 14세
그림 1. 생체 내 FPOP 미세 유체 흐름 시스템 도식. (a)IV-FPOP 유동 시스템의 2개의 주입 선(주황색)은 FEP 튜브(yellow) 내부에 도시되며, 에폭시 수지의 올바른 결합 위치는 연한 청색 원으로 표현된다. (B)3개의 250 μm i.d. 모세혈관에 의해 형성된 조립된 혼합-T를 완성한다. FEP 튜브에 대한 출구 모세관의 올바른 수지 결합 위치는 연한 파란색 원으로 표현된다. (C) C. 예쁜꼬마선충의생체 내 공유 라벨링을 위한 완전한 조립플로우 시스템. FPOP 이전에는, 벌레는 라벨링 직전까지H2O2로부터 분리된 채 보관된다; 레이저 조사 창은 연한 파란색으로 표시되고 레이저 빔은 보라색 번개 볼트로 표시됩니다. 수치는 확장할 수 없습니다. 이 수치는 에스피노 외4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. IV-FPOP 동안 미세 유체 시스템. (A)5 mL 주사기 내부의 C. 예쁜꼬마선충의 대표적인 사진. 교반하지 않고, 벌레는 주사기의 바닥에 정착 (왼쪽). 자기 교반기 및 교반기 블록은 IV-FPOP 실험 동안 웜을 현탁액으로 유지합니다(오른쪽). (B)5 mL 주사기의 대표적인 사진, 모세관을 주입하고, 3-2 밸브에 연결된 모세관을 철회. 3-2 밸브 핸들은 철회 위치에 표시됩니다. (C)IV-FPOP 동안 미세 유체 흐름 시스템은, 자기 교반기 블록은 웜의 5 mL 주사기 위의 위치이다. (D)배출구 모세관을 방사 단계에 고정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 두 개의 모세 혈관을 사용하여 C. 예쁜 꼬마 의 흐름과 회복의 비교. (A)250(회색) 및 150(검정) μm i.d. 모세혈관을 가진 2개의 생물학적 복제체(BR)에 대한 IV-FPOP 후 웜의 백분율 회복. 오류 막대는 기술 삼중범위의 표준 편차에서 계산됩니다. C. 250 μm(B)및 150 μm(C)i.d. 모세 혈관을 통해 레이저 조사 창을 통해 흐르는 엘간. 벌레는 더 작은 모세관에서 더 단단히 압축됩니다. 150 μm 즉. 모세관은 벌레의 응집을 보여줍니다. 이 수치는 에스피노 외4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 대표적인 LC-MS/MS 결과는 IV-FPOP에 따른다. (a)FPOP 변형 펩티드(적색)의 EIC 및 변형되지 않은(파랑). 선택된 펩티드는 액틴-1 단백질에 속한다. (B)MS/MS 스펙트럼의 이중 전하 변형되지 않은 액틴-1 펩티드 317-327. (C)MS/MS 스펙트럼이 이중 충전된 FPOP 변형 액틴-1 펩티드(317-327)를, 이 예에서 P323은 산화적으로 변형되었다(y5+ 이온, 적색).5+ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. IV-FPOP은 C. 예쁜꼬마선충 내 단백질을 산화적으로 수정합니다. (a)2개의 생물학적 복제물(BR)에 걸쳐 50Hz에서 200 mM의 과산화수소가 존재할 때 산화적으로 변형된 단백질의 벤 도면은, BR1은 청색이고 BR2는 노란색이다. (B)조사된 샘플, 과산화수소 제어 및 BR2의 웜 전용 제어에서 확인된 산화 변형 단백질의 벤 다이어그램은 기술적 삼중체에 걸쳐 있다. (C)다른 C. elegans 바디 시스템 내의 산화로 변형된 단백질의 파이 차트. 이 수치는 에스피노 외4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 용매 접근성에 IV-FPOP 수정을 상관. (A)미오신 샤페론 단백질 UNC-45 (회색) (PDB ID 4I2Z13)LC/MS/MS 분석에 의해 확인된 2개의 변형된 펩티드, 669-680 및 698-706(녹색, 왼쪽 인세트)을 강조한다. UNC-45는 Hsp90 펩티드 단편(청색)에 결합된다. 이 단편 내에서 산화적으로 변형된 잔기는 스틱(빨간색)으로 표시되고 UNC-45는 표면(오른쪽 인세트)으로 렌더링됩니다. (B)UNC-45 펩티드 669-680(상단) 및 698-706(하단)의 탠덤 MS 스펙트럼은CO2의손실에 대한 b-및 y-이온을 나타내며, FPOP 변형이다. (C)Hsp90 산화변형 잔기, R697, M698, E699 및 E700에 대해 계산된 ln(PF). Hsp90에 대한 계산된 SASA 값은 각 잔류물 위에 표시됩니다. (D)R697, M698, E699 및 E700에 대한 탠덤 MS 스펙트럼은 +16 FPOP 수정을 나타냈다. 이 수치는 에스피노 외4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
생체 내 단백질-단백질 상호 작용(PPI)의 연구를 위한 현재 벤치마크는 형광 공명 에너지 전달(FRET)이다. 가장 간단한 형태로,이 기술은 서로15에근접할 때 두 분자 사이의 에너지 전달에 의해 PPI를 연구합니다. MS 기술과는 달리, FRET는 아미노산 수준에서 형태 변화 및 상호 작용 부위를 특성화하는 분해능을 갖지 못한다. MS 기반 기술은 PPI16의연구에 점점 더 많이 활용되고 있다. IV-FPOP은 C. 예쁜꼬마선충에서 생체내 단백질 구조 분석을 가능하게 하는 HRPF 방법이다. IV-FPOP에 의해 C. elegans를 성공적으로 라벨링하기 위해서는 시료 손실을 줄이기 위해 미세 유체 유량 시스템을 적절하게 조립하는 것이 중요합니다. 250 μm i.d. 모세관은 작은 i.d. 모세 혈관4에비해 시료 회수를 최대화하는 것으로 나타났습니다. 더 큰 i.d. 모세혈관은 시험되지 않았지만, 미세 유체 흐름 시스템은 C. elegans의선별을 위해 시판되는 유동 세포 측정 시스템과 동일한 i.d.를 가진 모세관을 사용하여 설계되었습니다. 17 웜 샘플 크기도 중요하며, FPOP 이전에 샘플당 ~10,000 미만의 샘플 크기는 LC-MS/MS 분석을 위해 충분히 높은 단백질 농도를 산출하지 않습니다. 초기 시작 볼륨을 조정하여 더 높은 샘플 크기(>10,000 웜)를 사용할 수도 있습니다(단계 4.5).
미세 유체 유량 시스템의 적절한 조립이 중요합니다. 샘플 경로에서 누출되면 웜 또는H2O2의일관된 흐름이 발생합니다. 각 실험 후에 제대로 세척하면 여러 IV-FPOP 실험에서 페룰, 슬리브 및 3-2 밸브를 재사용할 수 있습니다. 그러나 모든 생물학적 복제에 대한 새로운 미세 유체 흐름 시스템을 조립하는 것이 좋습니다. 미세 유체가 제대로 조립되면 웜과H2O2는 최소한의 배압으로 혼합-T에서 혼합됩니다. 미세 유체 유량 시스템의 품질 관리(QC)는 착색 염료를 사용하여 혼합 효율을 테스트하는 것이 좋습니다. IV-FPOP 동안 웜 주사기 내부의 자기 교반기의 움직임을 모니터링하는 것이 중요하며, 웜 주사기 또는 혼합-T에서 부적절한 샘플 혼합은 누수를 유발하는 역압을 초래할 수 있습니다. 또한, 가난한 혼합 조건은 큰 샘플 손실, 레이저 창에서 웜의 가난한 레이저 노출, 막힘으로 이어질.
C. 예쁜꼬마선충 유지는 배경 산화를 감소시키기 위해 중요하다. 고온이 전체 배경 산화에 영향을 줄 수 있으므로 낮은 응력 조건에서 웜을 저온에서 키우는 것이 좋습니다. H2 O2및 레이저 조사가2 없는 벌레의 제어 샘플 세트는 실험실 유지 보수로 인한 배경 산화를 고려하기 위해 모든 IV-FPOP 실험에 권장됩니다. 이 기술의 현재 한계 중 하나는 더 높은 단백질 구조 정보를 얻기 위해 펩티드 당 산화 된 총 산화 변형 펩티드 의 총 수및 총 수입니다. 권장 하지 는 않지만, 산화 수정의 증가 과산화수소의 높은 농도를 사용 하 여 달성 될 수 있다. 과산화수소의 증가는 중요한 생물학적 경로를 크게 변화시킬 뿐만 아니라 산화로 인한 전개로 이어질 수 있습니다. IV-FPOP에 대한 과산화수소 농도가 증가하면 200 mM 이상의 농도가 테스트되지 않았기 때문에 웜 생존 가능성과 배경 산화를 테스트하는 것이 좋습니다.
설명된 LC-MS/MS 프로토콜은 다른 실험실의 MS QC를 충족하도록 최적화및 수정할 수 있습니다. 2D 크로마토그래피 기술의 사용은 이전에 산화적으로 변형된 펩티드 및단백질(18)의식별을 증가시키는 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고, 관심 있는 특정 단백질을 표적으로 하는 단백질 농축 기술은 항체 침전 또는 풀다운 아세법을 포함하되 이에 국한되지 않는 것이 좋습니다. 이 기술은 단백질의 에피토프/결합 부위가 IV-FPOP에 의해 산화적으로 변형된 경우 하나의 단백질 컨포머를 향하게 할 수 있다. 설페이트 라디칼 음이온10 또는 삼류로메틸화19와 같은 라디칼 시약의 발자국 에 대한 새로운 개발은 IV-FPOP의 다양성을 증가시킬 수 있다. 지금까지 생체 내에서 테스트된 유일한 라벨링 시약은 과산화수소이지만, 다른 레이저 활성화 라디칼은 최적화될 수 있습니다. 다른 라디칼의 사용은 웜 생존가능성, 세포 투과성 및 248 nm 레이저 파장과 호환되는 것으로 입증되어야 합니다. 많은 인간 질병을 위한 모형 시스템으로 C. elegans의 사용 때문에, IV-FPOP는 질병 병인에서 단백질 구조의 역할을 공부에 강한 충격이 있을 가능성이 있습니다.
Disclosures
이 출판물은 JAE 박사 학위 의 일부 성취로 작성되었습니다. 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 메릴랜드 대학에서 시작 자금에 의해 지원되었다, 볼티모어와 NIH 1R01 GM 127595 LMJ에 수여. 저자들은 원고 편집에 도움을 준 다니엘 데레지 박사에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
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