Summary
Målet med dette arbeidet er å utvikle en metode for å reprodusere kardiomyocytter fra det voksne hjertet og måle DNA-innhold og kjerner.
Abstract
Det voksne pattedyrhjertet består av ulike celletyper, inkludert kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster. Siden det er vanskelig å pålitelig identifisere kjerner av kardiomyocytter på histologiske seksjoner, er mange grupper avhengige av å isolere levedyktige kardiomyocytter før fiksering for å utføre immunstaining. Imidlertid krever disse live kardiomyocyte isolasjonsteknikkene optimalisering for å maksimere utbyttet, levedyktigheten og kvaliteten på prøvene, med iboende svingninger fra prøve til prøve til tross for maksimal optimalisering. Her rapporterer vi en reproduserbar protokoll, som involverer fiksering før enzymatisk fordøyelse av hjertet, noe som fører til maksimal avkastning samtidig som in vivo morfologien til individuelle kardiomyocytter bevares. Vi videreutviklet en automatisert analyseplattform for å bestemme antall kjerner og DNA-innhold per kjerne for individuelle kardiomyocytter. Etter å ha avslørt brysthulen, ble hjertet arrestert i diastole ved perfusjon med 60 mM KCl i PBS. Deretter ble hjertet løst i 4% paraformaldehyd (PFA) løsning, og deretter fordøyd med 60 mg / ml collagenase løsning. Etter fordøyelsen ble cellene singularisert ved triturasjon, og kardiomyocyttfraksjonen ble beriket via differensial sentrifugering. Isolerte kardiomyocytter ble farget for Troponin T og α-actinin for å vurdere renheten til den oppnådde befolkningen. Videre utviklet vi en bildeanalyseplattform for å bestemme kardiomyocyte kjerner og ploidy status etter DAPI farging. Bildebaserte knepvurderinger førte til konsistente og reproduserbare resultater. Dermed, med denne protokollen, er det mulig å bevare innfødt morfologi av individuelle kardiomyocytter for å tillate immunocytochemistry og DNA innholdsanalyse samtidig som maksimal avkastning.
Introduction
Hjertesykdom har vært den ledende dødsårsaken i de fleste vestlige land i mange tiår1,2. Selv om mange forbedringer i behandlingen av kardiovaskulære sykdommer har forbedret overlevelse, er det for tiden ingen behandlinger som kan erstatte tapte kardiomyocytter. Derfor har studier relatert til kardiomyocyttfunksjon, spredning, apoptose og hypertrofi vært og fortsetter å være et stort fokus for det vitenskapelige samfunnet. Siden det voksne pattedyrhjertet har en svært begrenset regenerativ kapasitet, med en estimert kardiomyocyttfornyelsesrate på mindre enn 1% per år, er det avgjørende viktig å pålitelig identifisere kardiomyocytter proliferative hendelser3,4. De fleste strategier som måler proliferative hendelser er avhengige av enten flekker for inkorporerte DNA-nukleotidanaloger for å vurdere tidligere eller nåværende spredning, eller flekk for kjernefysiske markører for aktiv spredning5. Det er spesielt viktig å pålitelig identifisere kardiomyocytter proliferative hendelser siden det totale antallet proliferative kardiomyocytter er så lavt3,6. For eksempel, basert på en 1% fornyelsesrate av endogene kardiomyocytter per år, kan man forvente å finne mellom 25 og 50 kardiomyocytter å være proliferative til enhver tid i det voksnemushjertet 7,8. Eventuelle unøyaktigheter i identifisering av kardiomyocyttkjerner kan føre til falske positive resultater. Derfor er det viktig å pålitelig identifisere kardiomyocyttkjerner, noe som har vist seg vanskelig og upålitelig fra histologiske seksjoner9. Identifisering av kardiomyocytter er mye mer nøyaktig fra enkeltceller enn fra vevsseksjoner, da det kan være vanskelig å skille kardiomyocytter fra andre celletyper selv når du bruker markører som α-actinin, selv om PCM1 kan være en pålitelig markør for kardiomyocyttkjerner i histologiskeseksjoner 10.
Nåværende protokoller er avhengige av å isolere levende kardiomyocytter før fiksering, som er kjent for å forårsake død av minst 30% av kardiomyocytter, og kan føre til utilsiktet utvalg av spesifikke populasjoner av kardiomyocytter11. Videre er disse protokollene notorisk vanskelig å optimalisere for å gi reproduserbare resultater. Selv optimaliserte isolasjonsteknikker kan vanligvis ikke produsere mer enn 65% levende, stangformede kardiomyocytter med varierende utbytte12.
For å overvinne disse problemene utviklet vi en protokoll som gjør det mulig for forskere å isolere faste kardiomyocytter. Siden prøvene er faste før isolasjon, er utbyttet maksimert, og in vivo morfologi er godt bevart. Videre, med denne protokollen er det mulig å isolere kardiomyocytter fra kliniske prøver, som vanligvis løses umiddelbart etter innkjøp. Videre, for å identifisere nylig genererte kardiomyocytter, er det viktig å måle kjerne- og ploidystatusen til individuelle kardiomyocytter, siden bare diploid kardiomyocytter vanligvis antas å være nyopprettede. Flow cytometri kan ikke skille multinucleation fra polyploidy og er en relativt tid og ressurskrevende protokoll. Manuell skissering og måling av kjerner i bilder er svært lav gjennomstrømming og utsatt for menneskelig bias. Automatisert kvantifisering av bilder av faste, isolerte DAPI-farget kardiomyocytter løser begge disse problemene. Bildebasert bestemmelse av kjerne- og ploidy-distribusjoner kan oppnås med minst tid og reagenser ved hjelp av grunnleggende utstyr.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Retningslinjene for National Institutes of Health og godkjent av University of Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Utarbeidelse av løsninger og kirurgisk utstyr
- Før isolasjon steriliser kirurgisk utstyr ved hjelp av 70% etanolløsning.
- Tilsett 2,24 g KCl til 500 ml fosfatbufret saltvannsløsning (PBS) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 60 mM. Oppbevar KCl-PBS-oppløsning ved romtemperatur. Bruk 3 ml KCl-PBS-løsning per mus.
- Fortynn 32 % paraformaldehyd (PFA) oppløsning med PBS for å oppnå endelig konsentrasjon på 4 % PFA. Forbered 10 ml 4% PFA i PBS per mus. Fortynnet PFA-oppløsning kan oppbevares ved 4 °C i 2-3 uker i en glassbeholder.
MERK: Forberedt 4% PFA-oppløsning kan oppbevares ved -20 °C over lengre tid. - Forbered 1 ml kollagenaseløsning per mus ved å tilsette 60 mg kollagenase, type 2 per 1 ml PBS.
2. Perfusjon og fiksering av hjertet
- Bedøve dyret ved hjelp av 2-5% isofluran med en oksygenstrømningshastighet på 1 l / min. Bekreft anestesi ved å bekrefte mangel på bevegelse og lavere pustehastighet.
MERK: Injerende heparin (100-500 U/kg) før eutanasi kan øke cellekvaliteten og utbyttet ved å forhindre blodpropper, og dermed tillate mer effektiv perfusjon av hjertet med fikseringsmiddel. - Euthanize dyret i henhold til godkjente metoder.
MERK: Vi fulgte American Veterinary Medical Association retningslinjer for eutanasi av dyr, og fikk lokal IACUC godkjenning for eutanasi. - Plasser det eutaniserte dyret i liggende stilling, og tape ned utvidede lemmer.
- Skjær gjennom brystet for å eksponere hjertet ved hjelp av stump saks. Kutt synkende aorta og dårligere kavalerivene.
- Perfuse hjertet ved å injisere 3 ml KCl-PBS oppløsning gjennom venstre ventrikkel med en strømningshastighet på 3 ml / min ved hjelp av en peristaltisk pumpe festet til et infusjonssett med en 23 G butterfly nål (26 G for nyfødte). Pass på at du ikke pierce gjennom septum.
MERK: Bruk alternativt en kanyle festet til en sprøyte for å injisere oppløsninger. - Perfuse hjertet ved å injisere 10 ml 4% PFA løsning i 10 min ved hjelp av en peristaltisk pumpe med en hastighet på 1 ml / min.
- Fjern hele hjertet ved hjelp av saks. Etter å ha fjernet hjertet, er det mulig å isolere et bestemt område av hjertet ved å incising. Plasser hjertet, eller et segment av det i et 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder 1 ml 4% PFA-løsning. Inkuber hjertet på rocker ved romtemperatur med gyngehastighet mellom 20-30 rpm i 1 time.
3. Isolering av faste kardiomyocytter
- Legg hjertet i en petriskål som inneholder PBS-oppløsning. Klem hjertet for å kvitte seg med eventuelle PFA gjenværende i ventrikler, og vask i PBS.
- Sett det faste hjertet i et nytt 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder kollagenaseoppløsning (60 mg/ml). Plasser røret på rockeren (20-30 o/min) ved 37 °C for inkubasjon over natten.
MERK: Utvid inkubasjonstiden opptil 1 uke og etterfyll collagenaseløsningen annenhver dag for å redusere den mulige variasjonen i utbyttet hvis hjerter forventes å være fibrotiske, noe som kan kreve lengre tid med kollagen fordøyelsen for å fordøye ekstracellulært kollagen. - Sett kollagenaseløsning og hjertet i en 35 mm petriskål. Dissosier hjertet i 1 mm stykker ved hjelp av tang eller saks.
- Bruk en overføringspipette til ytterligere triturate det dissosierte vevet i 2 min. Hvis vevspartikler fortsatt forblir i parabolen, bruk en overføringspipette med smalere åpning og fortsett triturasjon. Fortsett til flertallet av vevet er brutt ned.
MERK: Over triturasjon fører til at individuelle kardiomyocytter brytes. Pass på at du ikke overtriturerer ved å sjekke regelmessig under et mikroskop. - Plasser et 200-600 μm nylonnett over åpningen av 15 ml sentrifugerør.
MERK: For hypertrofiede kardiomyocytter anbefales det å bruke 400 μm nylonnett i stedet for 200 μm. - Tilsett 5 ml PBS i petriskålen som inneholder dissosierte celler og filtrer løsningen gjennom nylonnett, inkludert vevspartikler. Vask nylonnettet ved å passere ytterligere 4 ml PBS.
- Sentrifuger den filtrerte oppløsningen ved 10-100 x g i 1 min.
MERK: 100 x g sentrifugering vil ikke gi 100% ren kardiomyocyttpopulasjon, og noen ikke-kardiomyocytterceller vil sannsynligvis bli inkludert. - Kast supernatant med mindre man ønsker å flekke / evaluere ikke-kardiomyocytter hjerteceller også. Gjenbruk pelleten i 10 ml PBS før farging.
4. Farging kardiomyocytter
- Samle cellene ved sentrifugering ved 100 x g i 1 min og tilsett 5 ml permeabiliseringsløsning (f.eks. 0,5 % Triton X-100 i PBS). Inkuber i 20 min ved romtemperatur på rocker.
MERK: For trinn 4.1, 4.2 og 4.4 bruk 15 ml sentrifugerør, da det er lettere å fjerne supernatanten uten å forstyrre cellepelleten sammenlignet med 1,5 ml mikrocentrifugerør. - Samle cellene ved sentrifugering på 100 x g i 1 min, tilsett 5 ml blokkeringsbuffer (f.eks. 3% storfe serumalbumin [BSA] i PBS) og inkuber i 30 min ved romtemperatur på en rocker.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 100 x g i 1 min og tilsett 1 ml primær antistoffløsning (i PBS) med riktig fortynningsforhold. Overfør oppløsningen til 1,5 ml mikrocentrifugerør og inkuber kardiomyocytter i primær antistoffløsning under optimaliserte forhold (f.eks. 4 °C over natten).
- Overfør kardiomyocytter med primær antistoffløsning til et 15 ml sentrifugerør og tilsett 9 ml PBS. Inkuber kardiomyocytene i 10 min ved romtemperatur på en rocker.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 100 x g i 1 min og tilsett 10 ml PBS. Inkuber kardiomyocytene i 10 min ved romtemperatur på en rocker. Gjenta dette trinnet en gang til.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 100 x g i 1 min og tilsett den sekundære antistoffløsningen som inneholder DAPI. Inkuber i 30 min ved romtemperatur på en rocker, etterfulgt av å gjenta trinn 4,5 to ganger for å vaske kardiomyocytter.
- Plasser cellene enten på dekkglass eller mikroskopkompatible plater og fortsett med bildebehandling.
MERK: Bilder som inngår i manuskriptet ble tatt med 10x og 40x mål. Lasere brukt var: 405 nm for DAPI, 561 nm for Alpha actinin og 640 nm for Edu.
5. Programvare for oppsett av bildebehandling
MERK: Følg med på disse trinnene ved hjelp av tilleggsfil 1-SoftwareScreenshots.pdf.
- Last ned Fiji-distribusjonen av ImageJ.
- Åpne Fiji. Klikk på Hjelp > Oppdater... > Behandle oppdateringsområder. Sjekk "IJPB-plugins" og "Biomedgroup" oppdatere nettsteder for å laste ned avhengigheter plugins Ellipse Split og Morpholibj.
- Klikk Lukk. Fiji bør begynne å laste ned avhengighetene. Start Fiji på nytt når du er ferdig.
- Last ned Rstudio og åpne den.
- Kopier install.packages(c("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "skinnende")) inn i R-konsollens kommandolinje og trykk på Enter nøkkel. Skriv inn "y" som svar på alle meldinger om å installere alle R-avhengigheter (Skjermbilde 1 i supplerende fil 1).
6. Bilde kvantifisering
- Åpne Fiji og dra "AnalyzeNucleation.py" (leveres som en supplerende kodefil) til Fijis statuslinje. Dette åpner et skriptredigeringsvindu. Klikk Kjør nederst til venstre for å starte det (Skjermbilde 2 i Supplerende fil 1).
- En dialogboks vil dukke opp (Supplerende fil 1: Skjermbilde 3), ber om plasseringen av utdatakatalogen. Alle analysedata, tall og andre data som brukes av denne programvaren, lagres i denne mappen. En annen, større dialogboks vil dukke opp, viser alle bildeanalyseinnstillinger (Supplerende Fil 1: Skjermbilde 4).
- Velg plasseringen av katalogen som inneholder bilder som skal analyseres.
- Skriv inn formatet for bildefilnavn ved hjelp av regulære uttrykk. Skriv inn formatet for bildefilnavn, som angir hvilke deler av filnavnet som tilsvarer rad, kolonne, kanal og (eventuelt) område i klammeparenteser ved hjelp av regulære uttrykk. Ikke plasser i bukseseler. Surroundvariabeldeler av filnavnformatet i klammeparenteser {}. Måten filer lagres på, avhenger av bildeprogramvaren, og dette trinnet henter relevant informasjon fra bildefilnavnet.
MERK: For eksempel formatstrengen
r" Plate 1-(? P[A-Za-z]+)(? P [0-9]+)-(? P [A-Za-z]+).tif"
beskriver et filnavn som starter med "Plate 1-", som etterfølges av en eller flere alfabetiske bokstaver som indikerer raden, som etterfølges av ett eller flere sifre som indikerer kolonnen, som etterfølges av "-", som etterfølges av en eller flere bokstaver som indikerer kanalen, som etterfølges av ".tif". Bokstavene i vinkelparentesene som "<>" er variable navn og kopieres automatisk til dataene når de samles inn. Et av variabelnavnene må være "" - Angi navnet på kanaler der kjernefysisk flekk er synlig og hvor kardiomyocytter er synlige. Disse navnene må være nøyaktig slik de er i den delen som samsvarer med variabelen "
" i filnavnene for regulært uttrykk. - Angi hvordan bildene skal grupperes ved hjelp av kommadelte variabelnavn. Alle bildene i en gitt gruppe vil bli åpnet og analysert i ett parti. Hvis bildene for eksempel er delt inn i sett for hver brønn, og det er en brønn for hver unike kombinasjon av rad og kolonne, skriver du deretter "rad, kolonne" i dette feltet.
Merk: Disse grupperingsvariablene må være et delsett av variablene som brukes i formatstrengen. Ikke bruk "kanal" som en grupperingsvariabel, dette vil skille tilsvarende kanalbilder fra hverandre. - Angi om bilder er sydd sammen i ett brønnbilde eller er separate for hvert nettsted. I det tidligere tilfellet bør ikke området angis i filnavnformatstrengen.
- Velg hvilken terskelmetode som skal brukes til å skille kjerner fra bakgrunnen. Alle Fijis standard terskelmetoder er tilgjengelige. Test ulike terskelmetoder for å finne ut hvilke som fungerer best for bildesettet. I dette eksemplet velger du Otsu-metoden.
- Angi om terskelen skal beregnes på nytt for hvert områdebilde eller om den samme terskelen skal brukes for hvert bilde i gruppen. Angi om kardiomyocytebildene er brightfield eller bruker en fluorescerende markør.
- Angi kardiomyocytterterskelseringsmetoden. Hvis brightfield ble valgt i forrige trinn, vil denne terskelmetoden bli brukt på kantfiltrerte brightfield-bilder. Angi om terskelen skal beregnes på nytt for hvert områdebilde eller om den samme terskelen skal brukes for hvert bilde i gruppen.
- Angi antall rader med nettstedsbilder som dekker hver brønn. Angi antall kolonner med nettstedsbilder som dekker hver brønn. Angi minimumsområdet av kjerner i piksler. Bruk en sjenerøst lav minimumsstørrelse, en høyere og mer presis terskel beregnes i analysetrinnet. Angi minimumsområdet av kardiomyocytter.
- Når du har valgt ønskede innstillinger, klikker du OK.
- Bilder som ligner de som finnes i figur 3 og figur 4, vises på skjermen, og viser de ulike stadiene av analyserørledningen. Inspiser disse bildene for å sikre at tersklering og segmentering skjer riktig.
- Den valgte resultatmappen skal nå fylles med analysedata (Tilleggsfil 1: Skjermbilde 5). Andre filer enn analysedata kan trygt lagres i denne mappen så lenge navnene deres ikke begynner med "cm_", "nuclei_" eller "nucleilink_".
7. Dataanalyse
MERK: Csv-filene som produseres, kan analyseres manuelt. Hvert analyserte bildeundersett produserer en trilling av csv-filer med navnet "kjerner(metadata).csv", "nucleilink(metadata).csv" og "cardiomyocytes(metadata),csv", der (metadata) erstattes med en sekvens av navneverdipar i skjemaet "_(navn)=(verdi)", der (navn) og (verdi) er sekvenser av alfanumeriske tegn avledet fra strenger som er matchet i det vanlige uttrykket gitt tidligere. (Hvis for eksempel rad og kolonne ble angitt i filnavnene, vil strenger som "_row=F" og "_column=8" være til stede). Den ikke navngitte kolonnen lengst til venstre i hver kjerne- og kjernefil er et kjerne-ID-nummer. "Min" -kolonnen i nucleilink-filen er id-en til kardiomyocytten som inneholdt said nucleus helt eller 0 ellers. "Max" -kolonnen i kjernene er ID-en til den høyest nummererte kardiomyocytten som inneholdt said nucleus delvis, eller 0 ellers. "Mean" -kolonnen i cardiomyocytes-filen er cardiomyocyte-id-nummeret.
- Åpne "AnalyzeMultinucleatedServer.R" i Rstudio (angitt som supplerende kodefil).
- Øverst i denne filen er en variabel med navnet "mappenavn". Ved siden av det er en filsti. Her skriver du inn banen til utdatamappen som er valgt i det siste trinnet, uten den endelige skråstreken (Tilleggsfil 1: Skjermbilde 6).
- Øverst til venstre i skriptredigeringsvinduet skal det være en grønn pil merket Kjør app. Klikk på denne pilen. Det kan ta litt tid før dataene lastes inn og at appen dukker opp.
- I utgangspunktet vil tre gating grafer være synlige, en for å indikere minimum gyldig kjernefysisk område terskel, en for å indikere minimum gyldig kjernefysisk gjennomsnittlig intensitet terskel, og en for å indikere den maksimale gyldige minimum feret diameter for kardiomyocytter. Bruk glidebryterne til å angi disse terskler (Tilleggsfil 1: Skjermbilde 7).
MERK: I hver av disse grafene skal en stor, bred topp som tilsvarer gyldige kjerner eller kardiomyocytter være til stede, flankert av brede haler som representerer rusk eller feilaktige segmenterte kardiomyocytter. Bruk terskler for å kutte en hale av hver av toppene av. - Rull ned. Klikk på knappen Bruk valgte terskler (nederst i Tilleggsfil 1: Skjermbilde 7).
- Klikk knappen Plottintensitetsfordeling. Dette vil gjøre plott av kjernefysisk intensitet fordeling av både hele prøven og separate delplott for hver grupperingsvariabel.
MERK: Hvis for eksempelog grupperingsvariabler ble lagt inn i det vanlige uttrykket i Fiji-dialogboksen, vises plott som angir intensitetsfordelingen etter rad og etter kolonne vises her (Tilleggsfil 1: Skjermbilde 8). Hvis belysning og farging forhold var konstant over de ulike delene av prøven, disse plottene bør alle tydelig vise to intensitet topper, en dimmer, høyere en for diploid kjerner og en lysere, kortere en for tetraploid kjerner. - Intrasample variasjon vil resultere i at dette mønsteret ikke er synlig i hele prøveplottet, og det er stor variasjon i plasseringen av diploid og tetraploid topper etter rad, kolonne eller annen gruppering variabel. I sistnevnte tilfelle, bla ned merk av i boksen Normaliser separat etter gruppe for å ta hensyn til denne varianten (Supplerende fil 1: Skjermbilde 9).
- Klikk på knappen Beregn Ploidy (Tilleggsfil 1: Skjermbilde 9). Klikk på knappen Plot Beregnet Ploidy Distribution. Grafer vises i de tomme vinduene til høyre. I den normaliserte hele prøvegrafen skal totoppmønsteret være synlig hvis det ikke var før.
- Velg terskler for å isolere diploid og tetraploid topper fra både hverandre og outliers ved hjelp av glidebryterne (Supplerende Fil 1: Skjermbilde 9). Rull ned. Klikk på knappen Beregn Ploidy og Nucleation (Supplerende fil 1: Skjermbilde 10).
- Klikk knappen Plott og Lagre i resultatmappen. Plottet som er lagret i den valgte resultatmappen, vises også i dette interaktive vinduet (Tilleggsfil 1: Skjermbilde 10).
Representative Results
Kardiomyocytter ble isolert i henhold til protokollen beskrevet ovenfor. Ved hjelp av denne metoden får vi vanligvis ensartede kardiomyocytter som er relativt rene uten å forurense ikke-kardiomyocytterceller (figur 1A). Kardiomyocytter identifiseres lett under lys feltmikroskopi på grunn av deres karakteristiske størrelse og birefringence. Denne teknikken er enkel å implementere og gir konsistente resultater fra ulike isolasjoner med sammenlignbare kardiomyocytter utbytter og kvalitet (figur 1B). Isolerte kardiomyocytter kan oppbevares ved 4 °C i flere uker før videre bruk.
Kardiomyocytter som ble isolert i henhold til protokollen ovenfor kan brukes til ulike nedstrøms applikasjoner, for eksempel måling av kardiomyocyttstørrelse, kardiomyocytt ploidy og immunocytochemistry. Som et representativt resultat viser vi at kardiomyocytter isolert i henhold til denne protokollen kan farges ved hjelp av antistoffer og fluorokromkonjugerte azider for klikkkjemi for å oppdage lokalisering av spesifikke proteiner eller for å oppdage henholdsvis kardiomyocyte DNA-replikering. For eksempel farget vi kardiomyocytter med antistoffer som gjenkjenner α-actinin for å vise det karakteristiske z-line fargingsmønsteret til sarkomer (figur 2A). I et eget eksperiment administrerte vi tyromidonanalogen 5-Ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU) til mus før vi isolerer faste kardiomyocytter. Etter kardiomyocyttisolasjon farget vi for inkorporert EdU ved hjelp avstandardprotokoller 13, og var i stand til å oppdage kardiomyocytter som hadde gjennomgått S-fase i enten mononucleated, binucleated og trinucleated cardiomyocytes (Figur 2B).
For ytterligere å utvide nytten av isolasjonsmetoden, utviklet vi en rørledning som tillater kvantifisering av kardiomyocyte ploidy basert på integrert DNA-farging. For å kunne måle ploidy status for celler eller kjerner, måtte vi segmentere kjerner og kardiomyocytter. Figur 3 viser en representasjon av strategien vi brukte til å identifisere individuelle kjerner. For det første er det opprinnelige bildet DNA farget bilde (figur 3A) terskelet basert på intensitet (figur 3B). Her brukte vi DAPI til å farge etter DNA, men alle andre kjernefysiske fargestoffer som viser en lineær korrelasjon med DNA-innhold ville fungere. Programmet gjør det mulig for noen av Fijis intensitetsterskelseringsmetoder som skal velges, men i dette eksemplet ble Otsus metode brukt. Kjernefysiske masker som berører kanten av bildet eller er mindre enn den angitte minste terskelen for pikselområde, er utelukket. Deretter er ellipser egnet til atommaskene, og segmenterer individuelle kjerner. Figur 3C viser disse ellipsene som er lagt over det opprinnelige bildet. Deretter fylles hullene i maskene, og bildepunktene på bildet partisjoneres deretter i territorier basert på hvilken ellipse de er mest proksimale til (figur 3D). Grensene til disse områdene brukes deretter til å trekke linjer gjennom kjernefysiske klynger, og fullfører kjernefysisk segmenteringsprosess (figur 3E).
Det neste trinnet innebærer påvisning av kardiomyocytter. For kardiomyocytterbilder som oppnås basert på fluorescerende beisede celler (figur 4A),er prosessen svært lik den for kjerner. Bildet er terskelet basert på en intensitetsverdi beregnet av den valgte terskelmetoden, i dette tilfellet trekantmetoden. Identifiserte kardiomyocytter masker som berører grensen av bildet eller er under en viss størrelse er utelukket og hull er fylt ut maskene for å gi riktig segmenterte kardiomyocytter (figur 4B). Fordi kardiomyocytter har en mer uregelmessig form enn kjerner, er det ikke gjort forsøk på å segmentere kardiomyocytterklynger. I stedet er disse klyngene utelukket basert på deres høye minimum Feret diameter under analysetrinnet. Segmentering fra lyse feltbilder fortsetter litt annerledes. Først behandles det opprinnelige lyse feltbildet (figur 4C) med et Sobel-kantfilter. Dette filteret beregner den absolutte verdien for graderingen for hver piksel i bildet. Piksler i områder med raske endringer får høye verdier og piksler i jevne områder av bildet får lave verdier. Dette kantfiltrerte bildet blir deretter tersklert etter intensitet ved hjelp av Trekant-metoden, noe som resulterer i maskerte kardiomyocytter (figur 4D). Disse svært uregelmessige maskene blir deretter glattet og koblet sammen via morfologisk lukking ved hjelp av en sirkel med en radius på 2 piksler, som fyller ut alle hvite områder i bildet der sirkelen ikke får plass uten å overlappe et svart område (figur 4E). Til slutt fylles hull i maskene, områder som berører grensen er utelukket, og små partikler fjernes, etterbehandling av kardiomyocyttsegmenteringsprosessen (figur 4F).
Ved hjelp av den skisserte segmenteringsstrategien kan vi deretter bestemme kjernestatusen til individuelle kardiomyocytter. Ved hjelp av denne tilnærmingen bestemte vi kjernestatusen til kardiomyocytter isolert fra hjerter av utavlede CD-1-mus tidlig postnatal tidspunkter. Hjerter av nyfødte mus (første dag i livet) viste at flertallet av kardiomyocytter på det tidspunktet er mononucleated (Figur 5: neonatal). Denne høye frekvensen av mononukleerte kardiomyocytter er mye lavere hos juvenile mus (2 uker gammel), hvor mononukleated kardiomyocytter utgjør ca 25% av den totale kardiomyocytepopulasjonen (figur 5: juvenil). Til slutt kan vi måle ploidy status for individuelle kjerner i kardiomyocytter, og avgjøre om de er diploid eller tetraploid. Disse resultatene viser høyere frekvens av tetraploidkjerner hos unge mus (figur 6).
Figur 1: Effektivitet av kardiomyocyttisolering etter fiksering. (A)Representativt bilde av isolerte kardiomyocytter farget med DAPI for å vise kjerner. (DAPI (blå), Brightfield (grå)) (B) Utbytte av kardiomyocytter isolert fra forskjellige mus ved 3 måneders alder. Skala barer = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Immunocytochemistry av isolerte kardiomyocytter. (A) Representativt bilde av kardiomyocytter farget for α-actinin (α-actinin (rød) og DAPI (blå)). (B) Kardiomyocytter farget for inkorporert EdU (rød) og DAPI (blå). Representative kardiomyocytter som er mononukleated (venstre), binucleated (midten) og trinucleated (høyre) og EdU positive er vist. Skala barer = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Strategi for kjernefysisk segmentering. (A)Original DAPI kanalbilde. (B) Thresholded bilde (i dette eksemplet ble Otsu metode brukt). (C) Masker som ble identifisert fra de tersklerte bildene lagt over det opprinnelige DAPI-farget bilde. (D)Voronoi tessellation basert på kjernefysiske masker. (E) Endelig segmentert kjerner, med delte klynger uthevet. Skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Strategi for kardiomyocyttsegmentering. (A)Original fluorescerende Troponin Jeg farget kardiomyocyte bilde. (B) Trekantsterskeled bilde, etter å ha fylt hull og unntatt små gjenstander og de som berører grensen. (C) Originalt lysfelt kardiomyocytebilde (D) Kantfiltrert og trekanttersklert kardiomyocytebilde (E) Kantfiltrert bilde etter morfologisk lukking med en radius på to piksler (F) Samme bilde etter å ha fylt hull og unntatt små gjenstander og de som berører grensen. Skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Klassifisering av kardiomyocytter basert på antall kjerner. Neonatal hjerter (1 dag gammel) inneholder flere mononukleated kardiomyocytter enn ungdomshjerter (14 dager gammel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Fordeling av kardiomyocytt DNA-innhold per kjerne. I nyfødte (venstre) er 13,5 % av mononukleerte CM-kjerner tetraploid og 11,9 % av binucleated CM-kjerner er tetraploid. Hos juveniles (høyre), 33,9% av mononukleated CM kjerner er tetraploid og 31,2% av binucleated CM kjerner er tetraploid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Programvare skjermbilder. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 2: AnalyzeNucleation.py. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Tilleggsfil 3: AnalyserMultinucleatedServer.R. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Discussion
Siden kardiomyocytter ikke kan opprettholdes i kultur, er det viktig å isolere primære kardiomyocytter for å kunne studere arkitektur og funksjon11. Derfor har kardiomyocyte isolasjonsteknikker blitt mye brukt i hjertefeltet. Hvis målet er å bestemme funksjonelle aspekter av kardiomyocytter, er det viktig å isolere levedyktige kardiomyocytter. Disse levende kardiomyocytter kan også brukes til å utføre immunstaining på isolerte kardiomyocytter. Men, optimalisere teknikken for å isolere levende kardiomyocytter er teknisk utfordrende, og selv de beste teknikkene vanligvis bare gi 60-65% levende stang-formet kardiomyocytter, og de resterende kardiomyocytter er alle balled opp og døende ellerdød 11,12. Her utviklet vi en teknikk som vil tillate forskere å først fikse hjertet, og deretter isolere kardiomyocytter effektivt. Denne nye protokollen gir mye høyere utbytte av stangformede kardiomyocytter sammenlignet med tidligere publiserte protokoller. Videre utviklet vi en bildeanalyseplattform for å kategorisere kardiomyocytter automatisk basert på kjerner og ploidy. Med disse nye metodene kan grupper flekke kardiomyocytter for forskjellige proteiner, og studere kardiomyocyte ploidy og nucleation status som surrogater for det regenerative potensialet i hjertet.
Protokollen som er beskrevet her er relativt grei, og kan utføres uten avansert utstyr. Mengden collagenase og inkubasjonstid for fordøyelsen kan variere avhengig av collagenase mye, og selskapet som gir den. Vi brukte collagenase type 2, siden dette er mest brukt til å fordøye hjertet for å skaffe levende kardiomyocytter. Basert på våre observasjoner, bestemte vi oss for at inkubasjon over natten med 60 mg / ml kollagenase type 2 er optimal for nesten alle musehjerter uavhengig av nivået av fibrose. Vi har aldri hatt et problem med overbesvær som intracellulære proteiner er løst og ikke så tilgjengelig som ekstracellulært kollagen. Men hvis hjertet ikke fordøyes riktig, kan det være behov for kraftigere triturasjon, noe som forårsaker cellefragmentering på grunn av skjærstress. Dermed er det avgjørende å sørge for at hjertet fordøyes riktig før du går videre til triturasjon. Stivhet i hjertet kan testes ved å klemme med tang for å vurdere graden av fordøyelsen. Etter inkubasjon med kollagenase, bør hjerter være mindre stive og enkle å rive fra hverandre. Andre typer kollagenase kan også brukes. En tidligere rapport brukte en kombinasjon av kollagenaser B og D14.
Videre tror vi at denne protokollen kan brukes til å vurdere totalt antall kardiomyocytter i hjertet15. Men hvis målet er å oppnå og kvantifisere alle kardiomyocytter fra hjertet, er det viktig å inkubere hjertene i lengre perioder i kollagenaseløsningen (f.eks. 3-7 dager), hvor kollagenaseløsningen skal etterfylles en gang om dagen. Dette vil minimere uoverensstemmelser i isolasjonseffektivitet ved å eliminere virkningen av graden av triturasjon på kardiomyocyttutbytte.
Bruken av DNA-innhold for å måle ploidy er ikke nytt, og har blitt brukt i strømningscytometri i flere tiår. Nylig ble det vist at mikroskopi på samme måte kan brukes til å estimere DNA-innhold per kjerne16. Her implementerte vi denne strategien for å måle ploidy av kardiomyocyttkjerner, som et surrogat for nydannede kardiomyocytter. Dogmet innen hjerteregenerering er at bare mononukleerte, diploid kardiomyocytter kan gjennomgå cytokinese og gi opphav til nye kardiomyocytter. Siden det er svært utfordrende å måle ny kardiomyocyttdannelse in vivo, har isolerende kardiomyocytter som har blitt jaget etter administrering av en DNA-nukleotidanalog og bestemme nivået av mononukleated, diploid kardiomyocytter blitt brukt som en tilnærming av hjertets evne til å generere nye kardiomyocytter17. Her gir vi en makro for ImageJ som gjør det enkelt å kvantifisere kardiomyocyte ploidy. I det minste må 500 kjerner måles for å oppnå et nøyaktig estimat av plasseringen av G1-toppen. Hvis det tas hensyn til at farging og bildeforhold er konsistente på tvers av hver brønn av den avbildede platen, må bare 500 kjerner over hele prøven avbildes, ellers må det være 500 kjerner per bildegruppe18,,19. Begrensninger av bildebasert måling av kjerner og ploidy inkluderer vanskeligheter med å skille kjerner fra tilhengerceller fra faktiske kardiomyocyttkjerner, ved bruk av todimensjonale bilder. Slike tilslutningsceller kan føre til overvurdering av mengden av multinukleated celler og redusere nøyaktigheten av målinger av tetraploid kardiomyocytt kjernepopulasjonen. En mulig strategi for å løse dette problemet ville være å bruke cardiomyocyte kjernefysisk markør PCM16,20. Vi har imidlertid hatt problemer med å oppnå pålitelig PCM1 farging på riktig faste celler eller vev.
En annen potensiell begrensning er at noen kjernefysiske flekkbilder kan ha betydelig bakgrunn cytoplasmatisk farging, og forhindrer riktig tersklering ved hjelp av Fijis innebygde metoder uten omfattende forbehandling. I tillegg reduserer det uregelmessige bidraget fra denne bakgrunnsfluorescen til ploidy estimater nøyaktigheten. Videre, hvis cellene ikke er igjen i DNA-farging løsning for tilstrekkelig tid, fluorescerende fargestoff vil ikke binde seg til metning i kjernene og antagelsen om en lineær sammenheng mellom kjernefysisk integrert intensitet og DNA-innhold vil ikke lenger være nøyaktig.
Det bør bemerkes at programvaren ikke kan segmentere kardiomyocytter klynger og i stedet fjerner dem fra analyse. Derfor er det kritisk viktig å frø kardiomyocytter med relativt lav tetthet (f.eks. 1000 celler/cm2). Videre kan programvaren ikke skille mellom to kardiomyocytter stilt opp ende-til-ende og lange, entall kardiomyocytter. Slike klynger kan feilaktig blåse opp multinucleation estimater.
Selv om den beskrevne metoden ikke tillater å oppnå levedyktige kardiomyocytter og dermed ikke kan brukes til å måle dynamiske cellulære prosesser, hvis målet er å utføre immunstaining, tror vi at den beskrevne metoden er bedre enn eksisterende protokoller med høyere utbytte av kardiomyocytter og bedre kvalitet når det gjelder morfologi og protein lokalisering. Til slutt kan den beskrevne metoden brukes til å isolere kardiomyocytter fra kliniske prøver14,21. Vi tror den beskrevne metodikken kan hjelpe ulike forskere med å oppnå kardiomyocytter av høy kvalitet og måle kjerner og ploidy som surrogater for ny kardiomyocyttdannelse.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
JHvB støttes av tilskudd fra NIH, Regenerative Medicine Minnesota og en individuell Biomedical Research Award fra The Hartwell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
| Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
| Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
| Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
| Cytation3 | BioTek | - | Used for automated imaging for DNA analysis |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
| donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
| Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
| ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | - | Used for analyzing images |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
| Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
| Nikon A1R HD25 | Nikon | - | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
| Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
| Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
| Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
| R | r-project.org | - | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146 (2017).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
- Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
- Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657 (2018).
- Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
- Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
- Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6 (2018).
- Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
- Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
