Summary
우리는 우주 비행이 안구 구조물에 손상을 유도했는지 여부를 결정하기 위해 고해상도 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 영상을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜은 전 생체 설치류 안구 구조의 마이크로 CT 유래 측정을 나타낸다. 우리는 비파괴 삼차원 기술을 사용하여 우주 비행 다음 안구 형태 학적 변화를 평가하는 능력을 보여 주며 안구 손상을 평가합니다.
Abstract
보고서에 따르면 우주비행 환경에 장기간 노출되면 국제 우주 정거장(ISS) 임무 중과 후에 우주 비행사의 형태학적 및 기능적 안과 변화가 발생합니다. 그러나 이러한 우주비행으로 인한 변경의 기본 메커니즘은 현재 알려지지 않았습니다. 본 연구의 목적은 마이크로 CT 이미징을 사용하여 마우스 망막, 망막 색소 상피(RPE), 코로이드 및 clera 층의 두께를 평가함으로써 안구 구조에 대한 우주비행 환경의 영향을 결정하는 것이었습니다. 10주 된 C57BL/6 수컷 마우스는 35일 간의 임무를 위해 ISS에 탑승한 후 조직 분석을 위해 살아있는 지구로 돌아왔습니다. 비교를 위해, 지구상의 지상 제어(GC) 마우스는 동일한 환경 조건 및 하드웨어로 유지되었다. 안구 조직 샘플은 스플래시다운 후 38(±4) 시간 이내에 마이크로 CT 분석을 위해 수집되었다. 고정눈의 망막, RPE, 코로이드 및 경막층의 단면의 이미지는 마이크로 CT 이미징 획득 방법을 사용하여 축 및 처진 뷰로 기록되었다. 마이크로 CT 분석은 망막, RPE 및 choroid 층 두께의 단면 영역이 GC에 비해 우주 비행 샘플에서 변경되었으며, 우주 비행 샘플은 컨트롤에 비해 현저히 얇은 단면 및 층을 나타내는 것으로 나타났습니다. 이 연구 결과에서 사실 인정은 micro-CT 평가가 안구 구조 변경을 특성화하기 위하여 민감하고 신뢰할 수 있는 방법이다는 것을 표시합니다. 이러한 결과는 환경 스트레스가 글로벌 안구 구조물에 미치는 영향에 대한 이해를 향상시킬 것으로 예상됩니다.
Introduction
우주비행의 미세 중력 환경에서, 유체 변화에 의한 두개 내 압력(ICP)이 증가하면 우주비행 관련 신경안구 증후군(SANS)1,,2,,3,,4,,5에기여할 수 있다. 실제로, 우주 비행사의 40 % 이상이 NASA 쌍둥이 연구7의우주 비행 주제를 포함하여 국제 우주 정거장 (ISS) 임무6동안 과 후에 SANS를 경험했습니다. SANS의 현재 병리학은 광학 디스크 부종, 글로브 플러닝, 코로이드 및 망막 주름, 고과민 굴절 오차 교대 및 신경 섬유 층 경색 (즉, 면모 반점)과 같은 생리학적 변화를 포함하며 잘 문서화되어5,,8. 그러나 손상 의 발달에 기여하는 변경 및 요인의 근본적인 메커니즘은 불분명합니다. SANS를 더 잘 이해하기 위해 동물 모델은 망막 구조 및 기능에서 우주 비행 관련 변화를 특성화할 수 있습니다.
같은 동물에 대한 이전 조사에서, 우리는 마우스 망막에 우주 비행의 35 일의 영향을보고했다. 결과는 우주비행이 망막과 망막 혈관에 있는 중대한 손상을 유도하고, 세포 죽음, 염증 및 신진 대사 긴장과 관련되었던 몇몇 단백질/통로가 우주비행9에 따라 현저하게 변경되었다는 것을 해명하했습니다.
현재, 질병 발달 및 진행을 감시하기 위하여 확립된 각종 비침범성 화상 진찰 기술의 각종, 또한 작은 설치류 모형에서 널리 이용되는 각종 환경 스트레스에 대한 생리적 반응이 있습니다. 이러한 기술 중 하나는 해부학 적 구조와 병리학 적 과정을 평가하는 마이크로 CT이며, 마우스10과같은 작은 유기체에 성공적으로 사용되었습니다.
마이크로CT는 마이크로사이즈 분해능을 달성할,수 있으며, 적절한 조영제(10,,11,1012,13,14)를첨가하여 연조직의 체적 분석을 위한 높은 콘트라스트를 제공할 수 있다.,, 마이크로 CT 기술은 표본의 기하학적 프로파일에 대한 물리적 손상을 최소화하고 구조 간의 공간 관계를 변경하지 않기 때문에 총 해부학, 경 현미경 검사 및 조직학 검사와 같은 전통적인 방법에 비해 유리합니다. 또한, 구조의 3차원(3D) 모델은 마이크로 CT영상(12,,14)으로부터재구성될 수 있다. 현재까지 우주 환경에 노출된 후 시력 장애를 보여주는 증거에도 불구하고 동물 모델의 몇 가지 데이터를 통해 망막 구조와 기능의 우주 비행 관련 변화를 더 잘 이해할 수 있습니다. 현재 연구에서는, 마우스는 현미경 CT를 사용하여 망막, RPE 및 choroid 층의 미세 구조를 정량화하여 안구 조직 구조에 우주 비행 환경의 충격을 결정하기 위하여 ISS를 타고 35 일 임무에 비행했습니다.
Protocol
연구 결과는 건강의 국가 학회 (NIH)의 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 설명된 권고를 따랐고 로마 린다 대학 (LLU)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 국립 항공 우주 행정 (NASA)에 의해 승인되었습니다. 이 비행 실험에 관한 자세한 정보는9,15에서찾을 수 있습니다.
1. 비행 및 제어 조건
참고: 12번째 상업 재보급 서비스(CRS-12) 탑재하중은 2017년 8월 케네디 우주센터(KSC)에서 스페이스엑스에 의해 발사되었으며, 여기에는 NASA의 9번째 설치류 연구 실험(RR-9)에 10주된 남성 C57BL/6 마우스(n=20)가 포함되어 있습니다.
- 스페이스 엑스의 드래곤 캡슐을 통해 지구로 돌아오기 전에, 마우스는 비행 내내 12 시간 빛 / 어두운 주기와 26-28 °C의 주변 온도에서 35 일 동안 ISS를 타고 NASA의 설치류 서식지 (RH)에 살고있다.
- 지상 제어(GC) 마우스를 비행에 사용되는 것과 동일한 하우징 하드웨어에 배치하고 원격 분석 데이터를 기반으로 온도 및이산화탄소(CO2)수준과 같은 환경 파라미터를 가능한 한 가깝게 일치시십시오.
- GC 마우스에게 우주 기반 식단과 동일한 NASA 푸드 바 다이어트를 공급합니다. 물과 음식에 동일한 광고 리비도 액세스를 우주 비행과 GC 마우스를 모두 제공합니다.
2. 생쥐의 비행 후 평가
- 지구상에서 28시간 이내에 마우스를 로마 린다 대학(LLU)으로 이송합니다. 일단 거기, 동물 인클로저 하드웨어에서 마우스를 제거 하 고 생존 및 건강에 대 한 평가.
참고: 관찰 시, 검사 직원은 모든 마우스가 35 일 간의 우주 임무에서 살아남았으며 양호한 상태, 즉 눈에 띄는 결함 / 이상이 없다고 보고했습니다.
3. 우주 비행 후 마우스 눈의 해부 및 보존
- 38(±4) 스플래시다운(n=20/group) 시간 내에 마우스를 100% CO2로 안락사시키고 눈을 수집합니다.
- 오른쪽 눈 망막을 해부하고 멸균 극저온에 개별적으로 놓고 액체 질소의 스냅 동결을 방지하고 사용하기 전에 -80 °C에서 보관하십시오.
- 24시간 동안 인산염 완충식식염(PBS)의 4% 파라포름알데히드로 전체 왼쪽 눈을 고정한 다음 마이크로 CT 분석용 인산염 완충식식염(PBS)으로 헹구는다.
4. 마이크로 CT 스캐닝을 위한 샘플 준비
- 고정 후, 에탄올에서 마우스의 눈을 탈수. 고정 시료의 추가 또는 갑작스러운 수축을 포리스트화하려면 등급이 매겨진 일련의 에탄올 용액을 1시간 동안 50% 에탄올로 시작한 다음 에탄올 용액의 농도를 각각 70, 80, 90, 96 및 100%로 증가시합니다.
참고: 마우스의 눈은 후드 챔버에서 처리되어야 합니다. - 인산(PMA) 염색
주의: PMA가 부식성, 발암성 및 장기에 독성이 있다는 이유로 연기 후드 사용을 포함하여 적절한 보호 개인 장비가 필요합니다.- 염색 용액을 준비하십시오: 절대 에탄올 100mL에서 PMA 10 mg.
- 6일 동안 마우스의 눈(10wt. % 인산 -절대 에탄올에 용해된 PMA)을 염색한다.
- 스캔하기 전에 먼저 눈 샘플을 절대 에탄올로 씻은 다음 각 눈을 100 % 절대 에탄올로 채워진 개별 2 mL 플라스틱 용기에 놓습니다. 면 패드를 추가하여 스캔 중에 안정된 시료에 추가합니다.
5. 마이크로 CT 스캐닝 및 분석
참고: 데스크탑 X선 마이크로 CT 시스템인 SkyScan 1272 스캐너는 마우스의 눈에 망막 손상 평가를 위해 사용되었습니다.
- 소프트 티슈 샘플을 적절한 샘플 홀더에 장착합니다. X선 CT 측정 중에 임의의 움직임을 방지하기 위해 홀더에 있는 시료의 단단한 적합성을 보장한다(그림1).
- 각 샘플의 세심한 정렬에 따라 X 선을 통해 샘플을 개별적으로 스캔합니다.
- 소프트웨어를 연 후 프레임의 샘플을 중심으로 합니다. 프로토콜에서 필터를 사용하지 않고 행렬을 설정하여 픽셀을 4μm에서 늘립니다. 마이크로 포지셔닝을 사용하여 샘플 중심을 프레임에 유지합니다.
- 그런 다음 매개 변수를 확인하여 콘트라스트 에이전트를 최대화합니다. 교정을 수행하려면 샘플을 제거하고 플랫 필드 보정이 80 % 이상인지 확인하십시오.
- 보정 후 샘플을 스캐닝 챔버에 다시 삽입합니다. 스캐닝의 경우 0.400의 회전 단계, 프레임 평균 4, 무작위 이동 30을 사용하고 샘플을 180°로 회전시사용합니다.
- 반복 측정을 위해 위치 지정 지그를 사용합니다. 설명된 바와 같이 수행된 위상 대비 향상으로 인해, 4μm의 작은 물체 세부 정보는 통합 시간 90분인 50keV 및 80mA에서 밀폐된 마이크로 포커스 X선 튜브(텅스텐 양극)에 의해 생성된 엑스레이로부터 검출될 수 있다.
참고: 가장 높은 이미지 품질로 개요 CT 스캔을 생성하기 위해 이 섹션에 배치된 획득 매개 변수입니다. - 스캔 후 소프트웨어를 사용하여(예: NRecon)을 사용하여 데이터를 재구성합니다.
- 히스토그램을 조정하고 모든 샘플에 대해 동일한 범위(0 – 0.24)를 사용합니다. 관심 영역을 재구성하는 것은 원이었으며 비늘이나 레이블이 사용되지 않았습니다.
- 스캔 중에 아티팩트를 줄이려면 빔 경화 보정 20, 1의 스무딩 보정, 6의 링 아티팩트 감소, 정렬 불량 보정에 변경되지 않습니다. 재건 후, 샘플이 관심 영역 내에 있는 것으로 확인되었다.
- 눈의 시신경과 렌즈와 평행한 평면을 사용하여 이미지를 재배치합니다.
- 스캔 후 소프트웨어를 사용하여(예: DataViewer)을 사용하여 세 뷰 모두에 재구성된 이미지를 시각화합니다.
참고: 필요한 경우 이 소프트웨어를 사용하면 표준화된 분석을 수행하기 위해 눈의 시신경 및 렌즈와 평행한 평면을 사용하여 이미지를 다시 배치할 수 있습니다. - 설명 분석
- 소프트웨어의 측정 도구(예: CTAn)를 사용하여 구조를 측정합니다. 광학 신경을 사용하여 분석을 위해 관심 영역을 구분합니다. 계산에 의해, 프로토콜은 측정을 수행하기 위해 중간 조각을 사용했다. 이 평가는 설명분석(도 2 및 도 3)에의해 수행되었다.
- 회막, 망막 색소 상피(RPE), 코로이드 및 경막층(도2)및 축보기(도3)의측정을 수행한다. 평균을 계산하기 위해 각 구조의 세 가지 측정을 수행합니다.
Representative Results
망막, RPE, choroid 및 clera 층의 평균 두께는 위의 프로토콜을 따르는 후 마이크로 CT 스캔을 사용하여 기록되었다(도1). 이 기술은 세 가지 다른 관점에서 눈의 다중 평면 재구성을 보여 주었다. 분석 중에 관찰자는 전체 샘플을 스크롤하여 샘플 중간에 있는 분석을 표준화할 수 있었습니다.
마이크로 CT 분석은 선형 측정을 수행한 처탈 및 축보기(도2 및 도 3)에서눈의 단면 영역을 나타냈다. RPE 및 choroid 층은 GC 그룹과 비교했을 때 우주비행 군에서 현저히 또는 추세가 낮았다(도3).
그림 1: 연조직의 마이크로 CT 절차. (A)연조직 샘플(마우스 눈). (B)시료는 인산염 완충액(PBS)에서 포름알데히드4%로 고정하였다. 고정 후, 마우스의 눈은 에탄올에서 탈수되었다. 고정 시료의 추가 및 갑작스러운 수축을 방지하기 위해 등급이 매겨진 일련의 에탄올 용액이 1h에 대해 50% 에탄올로 시작하여 나열된 농도의 다음 에탄올 용액을 각각 70, 80, 90, 96 및 100%로 사용하였다. (C)마우스의 눈은 6일 동안 포스포몰리비드산(PMA)에 염색되어 절대 에탄올로 세척한 다음 절대 에탄올로 채워진 개별 2mL 플라스틱 용기에 넣었다. (D)데스크탑 X선 마이크로 CT 시스템 스캐너를 사용하여 쥐 눈의 망막 손상을 평가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 지상 제어 마우스의 적시보기. 이미지의 오른쪽에 있는 눈의 층은 상하, 망막(0.077mm), 망막 안료 층(RPE, 0.038 mm), 코로이드(0.041 mm), 스클레라(0.059 mm)에 음부가 추가됩니다. 이 수치는 Overbey 외15에서촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 접지 제어 마우스의 축 보기입니다. 이미지의 오른쪽에 있는 눈의 층은 상하, 망막(0.144mm), 망막 안료 층(RPE, 0.051 mm), 코로이드(0.041 mm), 점막(0.073 mm)에 음장된다. 이 수치는 Overbey 외15에서촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 우주비행 및 제어 군에서 마이크로 CT로 측정된 망막 층, RPE 층 및 초로이드 층의 평균 두께. 카운트는 그룹당 5개의 망막에 걸쳐 평균되었습니다. 값은 표준 오류(SEM)± 평균 두께로 표현되었습니다. 평균의 SEM에는 오류 막대가 표시됩니다. 지상 제어(GC) 그룹에 비해 우주비행(FLT) 그룹의 단면 두께가 현저히 낮을 때 '*'(p&05)로 표시된다. 이 수치는 Overbey 외15에서촬영되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 연구의 결과는 GC 단, 특히 망막, RPE 및 눈의 choroid 층의 GC 단과 비교될 때 마이크로 CT 기술을 사용하여 우주 비행 마우스 눈의 구조적 변화가 있었다는 것을 보여주었습니다, 그들의 감소된 두께에 의해 입증된 바와 같이. Micro-CT는 조작할 필요 없이 변화를 특성화하는 효율적이고 비파괴적인 기술을 제공합니다. PMA 염색의 사용은 마이크로 CT 이미지의 품질을 향상시켰으며, 재구성 후 명확한 3D 단습 영상을 성공적으로 확보하여 시편의 구조를 물리적으로 변경할 필요가 있다고 예측했습니다. 이러한 이미지의 추가 이점은 전체 관심 영역을 디지털방식으로 표시하여 접근성과 결과 재현성을 증가시키는 것입니다. 이 연구 기간 동안 생성된 마이크로 CT 영상을 통해 표적 시편은 각 층의 두께를 측정하기 위해 망막, RPE, choroid 및 clera 층과 같은 다중 구조물의 분화를 보여주었습니다.
프로토콜 내에서 중요한 단계는 크기와 텍스처로 인해 샘플을 조작하는 것입니다. 시편의 처리는 준비 중에 시편에 압력을 가하지 않고 신중하게 수행해야 합니다. 마이크로 CT에는 해상도와 매개 변수에 대한 표준화된 값의 부족이라는 몇 가지 제한이 있습니다. 스캔 하는 동안, 다른 마이크로 CT 스캐너 다양 한 이미지 처리 알고리즘을 가질 수 있습니다.; 그러나 어떤 문제를 극복하기 위해 회색 스케일에 대한 보정을 추구 할 수 있습니다. 스캔 후, 이미지의 재구성은 수행 될 조직과 분석을 기반으로해야합니다. 화질은 토모그래피 시스템, 설정, 표본 크기뿐만 아니라 준비방법(16,,17)에따라 다르기 때문에 매우 중요할 수 있다.
여러 유형의 정상 및 병리학 조직을 연구하는 데 성공한 응용 으로 인해 Micro-CT 이미징 기능을 사용하여 향후 연구에서 다른 분석을 위한 체적 데이터를 컴파일해야 합니다. 따라서, 본 연구의 목적에 기초하여, 이중 차원 측정을 사용하는 것이 허용되었지만, 총 3D 구조의 세분화는 또한 전체 시편의 정확한 윤곽을 제공하는 데 도움이 될 수 있다. 비파괴 기술의 모든 장점에도 불구하고 마이크로 CT는 면역 조직 화학과 같은 다른 방법을 대체하지 않지만 원하는 경우 후속 조직학 분석을 보완하고 허용할 것입니다.
장기간 우주 비행 상태는 SANS로 정의 된 우주 임무 중 과 후에 우주 비행사의 구조적 및 기능적 안구 변화의 시리즈를 생성합니다. 연구 결과는 고초 변화, 지구 평탄화, choroidal/망막 접기 및 면울 반점19를포함합니다. 망막 신경 섬유 층의 발견 우주 비행사의 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)과는 달리, 망막과 choroidal 층의 숱이이 동물 마이크로 CT 연구에서 문서화되었다. 이러한 결과는 예상치 못한 결과를 초래했습니다. 이러한 불일치는 혼란스러운 요인으로 인해 발생할 수 있습니다. 마우스는 인간에 비해 세팔라드 유체 이동이 제한되어 있습니다. 유체 교대의 이 부족은 중력 변화에 다른 반응을 불러 일으켰을 지도 모릅니다. 둘째, 마우스는 스플래시다운 후 38시간 이내에 해부되었고, 재적응을 위한 급성 반응은 또한 망막과 코로이드의 형태학적 변화에 기여할 수 있다. 이러한 가능성을 확인하려면 우주비행 중과 임무 후 장기에 대한 추가 측정이 필요합니다.
이 연구의 결과는 우주 비행 조건, 특히 중력 변화가 눈에 급성 및 단기 반응을 유도할 수 있음을 나타냅니다. 망막 기능 및 우주 비행 유도 구조 변화의 메커니즘에 안구에 급성 변화의 결과를 결정하기 위해 추가 조사가 필요합니다.
Disclosures
모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NASA 우주 생물학 보조금 # NNX15AB41G 및 LLU 기본 과학부에 의해 지원되었다. 최성신, 데니스 레베슨, 레베카 클로츠는 우주비행 연구의 성공에 크게 기여했으며, 그들의 지원에 큰 감사를 표했습니다. 저자는 또한 그들의 큰 도움에 대 한 전체 NASA 바이오 시그래마 공유 프로그램 그룹에 감사 하 고 싶습니다.
저자는 또한 마이크로 CT 서비스를 위한 치과 연구를 위한 센터를 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
| Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
| X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |
References
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