Summary
Здесь мы представляем оптимизированный протокол для быстрого и полуквантитативного измерения взаимодействия лиганд-рецепторов в транс в гетерологозной клеточной системе с использованием микроскопии флуоресценции.
Abstract
Белковые взаимодействия в клеточных интерфейсах диктуют множество биологических исходов, начиная от развития тканей и прогрессирования рака до формирования и поддержания синапса. Многие из этих фундаментальных взаимодействий происходят в транс и, как правило, индуцированных гетерофильных или гомофильных взаимодействий между клетками, выражают мембраны якорь связывающих пар. Выяснение того, как соответствующие мутации болезни нарушают эти фундаментальные белковые взаимодействия, может дать представление о множестве областей клеточной биологии. Многие анализы взаимодействия белка и белка, как правило, не размягываются между cis и транс-взаимодействиями, что потенциально приводит к переоценке степени связывания, которая происходит in vivo и включает в себя трудоемкую очистку белка и/или специализированного оборудования мониторинга. Здесь мы представляем оптимизированный простой протокол, который позволяет осуществлять наблюдение и количественную оценку только транс-взаимодействий без необходимости длительной очистки белка или специализированного оборудования. Анализ агрегации клеток HEK включает в себя смешивание двух независимых популяций клеток HEK, каждая из которых выражает мембранные согнатные лиганды. После короткого инкубационного периода образец изображения и полученные агрегаты количественно.
Introduction
Синаптические взаимодействия, облегчаемые молекулами синаптической адгезии, являются основополагающими для развития, организации, спецификации, обслуживания и функции синапсов и генерации нейронных сетей. Идентификация этих транссинаптических молекул адгезии клеток быстро растет; Таким образом, принципиально важно определить связывающих партнеров и понять, как эти новые молекулы адгезии взаимодействуют друг с другом. Кроме того, секвенирование генома выявило мутации во многих из этих молекул адгезии, которые обычно связаны с множеством нейроразвития, нейропсихиатрических и пристрастийрасстройств 1. Мутации в генах, кодящие молекулы синаптической клеточной адгезии, могут пагубно изменять транс-взаимодействия и могут способствовать патофизиологическим изменениям в формировании и обслуживании синапса.
Существует несколько анализов для количественной оценки белково-белковых взаимодействий, таких как изотермальная калорийность, круговой дихроизм, поверхностныйплазмоновый резонанс 2 и, хотя количественный по своему характеру, они имеют несколько ограничений. Во-первых, они требуют рекомбинантного белка, иногда требуя длительных и утомительных шагов по очистке. Во-вторых, они требуют сложного специализированного оборудования и технических знаний. В-третьих, они могут переоценить степень связывания, поскольку они позволяют как cis, так и транс-взаимодействия между белками, которые естественным образом привязаны к мембране in vivo. Здесь мы предлагаем простой и относительно быстрый анализ, который исключительно тестирует транс-взаимодействия.
Чтобы обойти многие из осложнений, связанных с очищенными анализами белка, мы оптимизировали клеточное белковое взаимодействие, которое резюмирует транс-взаимодействия в уменьшенной гетерологио-клеточной системе. Этот анализ ранее использовался в различных формах для изучения трансклеточных взаимодействий. При этом подходе молекулы адгезии клеток-кандидатов трансфицированы в клетки HEK293T. В физиологических условиях клетки HEK293T не проявляют самоагрегации, что делает их образцовыми моделями для этого анализа. Однако, когда отдельные популяции клеток HEK, выражаюющих рецептор и лиганд, объединяются, связывание рецептора и лиганда заставляет агрегацию клеток HEK произойти. Эта агрегация опосредовано исключительно транс-взаимодействиями и обычно наблюдается в десятки минут. В этом методе не требуется никаких шагов по очистке белка, и эффективность метода зависит от парадигмы, что популяции клеток HEK, выражают молекулы адгезии cognate, объединяются, а затем образовываются только через десятки минут. Кроме того, этот метод является относительно недорогим, так как ни антител, ни дорогостоящее оборудование не требуется. Единственным оборудованием, необходимым для получения данных, является стандартный флуоресцентный микроскоп. Дополнительным преимуществом этого клеточного анализа является способность быстро проверять влияние соответствующих точечных мутаций заболевания на транс-взаимодействия. Это может быть выполнено путем трансфектирования клеток HEK с cDNAs мутантных вариантов белка интереса.
В этом протоколе мы представляем пример, в котором мы исследуем, изменяет ли мутация в Neurexin3(Neurexin3'A687T),выявленную у пациента с диагнозом глубокая интеллектуальная инвалидность и эпилепсия, взаимодействия в транс с богатым лейцином ретрансляторным трансмембранным белком 2 (LRRTM2). Neurexin3 является членом эволюционно сохраненного семейство пресинаптических молекул адгезии клеток и в то время как недавняя работа определила несколько ролей в синапсе3,4,5,6,7, наше синаптическое понимание этой молекулы и всех членов семьи неурексинов остается неполным. LRRTM2 является возбуждающей постсинаптической клеточной адгезии белка, который участвует в формировании и обслуживаниисинапса 8,9,10. Важно отметить, что LRRTM2 исключительно взаимодействует с изоформами неурексина, которые не имеют сращивания сайта 4 альтернативный экзон (SS4-), но не с neurexin изоформы, содержащие сращивание сайт 4 альтернативный экзон (SS4 "). Мутация человеческой миссенсе (A687T), выявленная в Neurexin3, находится в неизученной внеклеточной области, которая эволюционно сохраняется и сохраняется между всеми альфа-неврексинами7. Поскольку взаимодействие между этими двумя молекуламибыло установлено 8,9,11, мы поставили вопрос: является ли связывающая способность Neurexin3'SS4- к LRRTM2 изменена мутацией точки A687T? Этот анализ показал, что мутация точки A687T неожиданно усилила агрегацию Neurexin3 до LRRTM2, предполагая, что внеклеточная область, в которой находится точка мутации, играет определенную роль в посредничестве транссинаптических взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток и трансфекция
- Сделать HEK сотовых средств массовой информации с DMEM, 1x (Dulbecco Модификация среднего орла) дополняется 4,5 г / л глюкозы, L-глутамин и пируват натрия и 10% FBS. Стерильный фильтр.
- Предопределить подходящие лиганды и рецепторы для агрегирования анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Neurexin3'SS4/- и один из его известных лигандов, LRRTM2, были использованы в этом исследовании. Лиганды и рецепторы, представляющие интерес, были выражены от cDNAs в pcDNA3.1. Сборка Gibson была использована для вставки Neurexin3 в pcDNA3.112. Neurexin3' F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCGGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTCCCC/
GAGCGGCCGCCACTGTGGTTATCTGCAGAATTCTTACATAACTCCTTGTCCTTCCTTTT. - Подготовь ячейки HEK293T.
- Выращивайте клетки HEK293T до слияния в одной колбе Т-75.
- После слияния используйте 2 мл трипсина и поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 2 минут. Добавьте 6 мл средств HEK в колбу, чтобы повторно использовать клетки и перенести все 8 мл в коническую трубку 15 мл.
- Пеллет на 500 х г в течение 5 мин и повторно в HEK сотовых средств массовой информации в общей сложности 8 мл.
- Подсчитайте клетки и добавьте 735.000 клеток в каждый колодец плиты 6-наилучшим образом. Отрегулируйте конечный объем до 2 мл для каждой системы с использованием сотовых медиа HEK.
- Поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию и дайте клеткам расти в одночасье или до тех пор, пока они не достигнут 50-60% слияния.
- Трансфект HEK293T клетки с использованием фосфатного метода кальция13.
- Трансфект хорошо-1 с 3 мкг белка интереса и со-трансфект с 1 мкг флуоресцентного белка (3 мкг pcDNA3.1-Neurexin3'WT SS4- и 1 мкг mCherry).
- Transfect well-2 как в шаге 1.4.1. но с мутировавшим белком интереса (pcDNA3.1-Neurexin3-A687T SS4-).
- Трансфект хорошо-3 с 3 мкг лиганда интереса и со-трансфекта с 1 мкг другого флуоресцентного белка (3 мкг ППНА3.1 LRRTM2 и 1 мкг GFP).
- Transfect хорошо-4 и хорошо-5, чтобы служить в качестве отрицательного контроля: хорошо-4 с 1 мкг GFP и хорошо-5 с 1 мкг mCherry.
- Подготовь еще одну пластину (как в шаге 1.4.1-1.4.4), если требуется дополнительные условия или элементы управления(Neurexin3'WT/A687T SS4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность трансфекции анализируется через 24 ч после трансфекции под микроскопом эпифторесценции и количественно определяется как количество клеток, выражаюющих флуоресцентный белок, с помощью которого они были трансфицированы. Более рационализированный подход будет включать в себя трансфекцию клеток HEK с бицистратронным векторным кодированием флуоресцентного белка и лигандом интереса и настоятельно рекомендуется выше co-transfection. В случае этого исследования, альфа-нейролексины являются 4,3 кб и низкой интенсивности флуоресценции наблюдалось с помощью бицистрановой системы, требующие совместного трансфекции.
- Через 48 часов после трансфекции, урожай клеток для агрегации.
- Вымойте каждый хорошо дважды с PBS.
- Добавьте 1 мл 10 мМ EDTA в PBS в каждый колодец, чтобы мягко разобщить взаимодействия клетки к клетке и инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин не рекомендуется для шага 1.5.2 из-за потенциального протеолитического расщепления молекул адгезии в исследовании. Кроме того, после добавления EDTA протокол не может быть остановлен до завершения, так как клетки теперь будут подвергаться воздействию окружающей среды. - Аккуратно нажмите пластины, чтобы отделить клетки, и урожай каждого хорошо в отдельные 15 мл конических труб.
- Центрифуга конические трубки при температуре 500 х г и комнатной температуре в течение 5 мин.
- В то время как клетки гранулирования, подготовить 6 инкубациовых трубок, помекая верхней части каждой микроцентрифуг трубки с каждым условием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая перестановка условий GFP и mCherry должна использоваться для охвата всех экспериментальных условий и надлежащего контроля. Например: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3-WT SS4--mCherry, 4. GFP/Neurexin3-A687T SS4 - -mCherry, 5. Neurexin3'WT SS4---mCherry/LRRTM2-GFP, 6. Neurexin3'A687T SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP. Сделайте дополнительные трубки для размещения дальнейших условий и элементов управления. - Удалите сверхнатантные и мизопенсные клетки в 500 МКЛ средств массовой информации HEK с 10 мМ CaCl2 и 10 мМ MgCl2 нагревается до 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление CaCl2 и MgCl2 позволяет молекулам адгезии восстановить связывание и требуется только в том случае, если партнеры по трансклеточному взаимодействию, о котором идет речь, требуют дивалентных катионов для адгезии. - Подсчитайте клетки в каждой конической трубке 15 мл с помощью гемоцитометра и aliquot 200,000 клеток каждого состояния в соответствующую трубку из шага 1.6.1 для смеси 1:1 в общем объеме 500 МКЛ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно занять всего 5 минут на условие, чтобы подсчитать и aliquot суммы. - Инкубационые трубки при комнатной температуре в медленном ротаторе трубки.
2. Приобретение изображений
- Оптимизация параметров приобретения микроскопа для конкретных образцов. В этом примере изображения были сделаны на широкое поле микроскопа. Используйте 5x воздушную цель (NA: 0.15; WD: 20000 мкм), чтобы получить достаточно большое поле для анализа.
- Оцените базовую агрегацию сразу после смешивания двух условий клеток HEK в шаге 1.8. Теперь это изображения "нулевого времени".
- Pipette 40 йл каждой образцовой смеси на заряженный слайд микроскопа и изображение под флуоресценцией в обоих 488 и 561 каналов.
- Приобрети три различных поля зрения на одной плоскости фокусировки на каплю выборки.
- Приобрети окончательные изображения на 60 мин, как "время 60" изображение.
- Чтобы получить изображение смеси «время 60» после инкубации за 60 минут, возьмите еще 40 йл образца каждого состояния из вращающихся трубок и пипетки каждый образец на заряженный слайд. Изображение как в шаге 2.2.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агрегация клеток должна проверяться каждые 15 минут до тех пор, пока не произойдет насыщение. Сроки агрегации будут зависеть от белков, тестируются.
- Чтобы получить изображение смеси «время 60» после инкубации за 60 минут, возьмите еще 40 йл образца каждого состояния из вращающихся трубок и пипетки каждый образец на заряженный слайд. Изображение как в шаге 2.2.2.
3. ImageJ/Фиджи Анализ
- Для количественной оценки масштабов агрегирования с использованием Фиджи/ImageJ сохраните файлы анализа.
- Сохраните предоставленные дополнительные файлы кодирования в папке макросов imageJ на компьютере.
- Установите предоставленный макрос агрегации (Plugins, Macros, Install и выберите файл "AggregationAssay.txt" ).
- Определите пороговые значения.
- Загрузите "нулевой" .tif файл в imageJ и разделите каналы(Image | Цвет | Сплит каналы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение "нулевой времени" используется для определения порогового и малейшего размера puncta для всего эксперимента. - Маска каждого канала (Плагины | Макрос | AggregationAssay_MakeMask). Появится окно Mask From Image. Проверьте коробки рядом, чтобы определить порог для изображения и определить кластерные парамы из гистограммы и нажмите OK.
- Определите порог изображения с помощью слайд-бара, завездьте номер справа от слайд-бара и нажмите OK.
- Появится гистограмма размера кластера. Выберите размер кластера из гистограммы, которая подходит эксперименту, ввените это число в размере кластера Min: поле и нажмите OK. Кластеры ниже этого размера анализироваться не будут.
- Загрузите "нулевой" .tif файл в imageJ и разделите каналы(Image | Цвет | Сплит каналы).
- Вы запустите анализ.
- Откройте изображение "время 60" состояния 1 в imageJ и разделите каналы как шаг 3.2.1.
- Маска каждого канала (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Используйте тот же порог и размер, определяемый в шаге 3.2.3 и шаге 3.2.4. Неизбирать коробки рядом с определением порога для изображения и определить кластерные парамы из гистограммы и вручную ввести размер и пороги в соответствующие поля, а затем нажмите OK.
- Рассчитайте индекс агрегации(Plugins | Макрос | AggregationAssay_CalculateOverlap). Выберите каналы в масках, которые можно сравнить, и каталог, в котором будут экономить полученные файлы.
- Повторите шаги 3.3.1-3.3.3 для каждого изображения 'время 60' в каждом состоянии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс агрегации определяется как общая площадь перекрытия, разделенная на сумму двух областей канала за вычетом области перекрытия, умноженной на 100 (индекс агрегации - область перекрытия/область канала 1 - область канала 2 - область перекрытия х 100). Эта нормализация является операцией «ИЛИ» между двумя каналами в масках, представляющими общие пиксели в любой маске.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мутация A687T увеличивает привязку Neurexin3'SS4 к LRRTM27
Чтобы исследовать, как межклеточное взаимодействие двух известных синаптических белков зависит от введения точечных мутаций, обнаруженных у пациента с умственной неполноценности и эпилепсией, мы использовали вышеуказанный анализ агрегации клеток HEK(рисунок 1). Клетки были трансфицированы в соответствии с разделом 1 и подготовлены для визуализации в соответствии с разделами 1 и 2 протокола. Клетки были изображены на базовом уровне, где не наблюдалось агрегации, как ожидалось (не показано). Изображения, полученные за 60 минут, были проанализированы как в разделе 3 протокола. Чтобы свести к минимуму предвзятость выбора, условия были рандомизированы, чтобы ослепить экспериментатора. По аналогичным причинам в качестве рентабельности инвестиций было выбрано целое поле зрения каждого изображения.
Условия, при которых клетки не выражали никаких синаптических лигандов (GFP/mCherry), показали минимальную агрегацию после 60-минутной инкубации(рисунок 2). Аналогичным образом, условия, в которых только одна из двух популяций клеток выражала синаптические лиганды (mCherry/LRRTM2-GFP или GFP/Neurexin3'WT/A687T SS4 - -mCherry), продемонстрировали минимальную агрегацию после инкубации 60 минут(рисунок 2). Как и ожидалось, условия, которые содержали две популяции клеток с несовместимыми молекулами клея(Neurexin3'WT/A687T SS4'-mCherry/LRRTM2-GFP), не продемонстрировали агрегации на 60 минут(рисунок 2B). Эти условия служили критическим негативным контролем, поскольку LRRTM2, как известно, связывается исключительно с SS4, не имеющими изоформ (SS4-) Neurexins, и подчеркивает специфику этого анализа агрегации.
Условия с совместимыми молекулами адгезии8,9,10 (Neurexin3'WT SS4 - -mCherry/LRRTM2-GFP) продемонстрировали значительную агрегацию после инкубации 60 мин(рисунок 2C). Агрегация может быть визуализирована как желтая и присутствует в перекрытии между ячейками(рисунок 1 и рисунок 2). Удивительно, но состояние, при котором Neurexin3'A687T SS4- был совместно инкубирован с LRRTM2 (Neurexin3'A687T SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP), продемонстрировали значительно большую агрегацию по сравнению с его аналогом wildtype (Neurexin3-WT SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP; положительный контроль). Это говорит о том, что мутация точки A687T в Neurexin3' повышает связывающие возможности Neurexin3'SS4- к LRRTM2.
Рисунок 1. Рабочий процесс анализа агрегации. (A) HEK293T клетки трансфицированы с помощью белка-1/mCherry, или белка-2/GFP. (B) Выражение Neurexin3 " занимает 48 ч. (C) Клетки собирают с помощью 10 мМ EDTA, а затем гранулы (D). (E) Клетки смешиваются в соотношении 1:1 и перерасходуются в 500 МКЛ средств массовой информации HEK, содержащих 10 мМ CaCl2 и MgCl2. (F)Клетки инкубируется при комнатной температуре до тех пор, пока не произойдет агрегация и окончательное изображение не будет получено в "время 60". Агрегация визуализируется как количество желтой панкты, видимой в поле зрения. Никакая агрегация не наблюдается, когда клетки не выражают правильные пары рецепторов лиганда и, таким образом, рассматриваются как отдельные красные или зеленые puncta. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Neurexin3'A687T SS4- имеет повышенную агрегацию с возбуждающей лиганд LRRTM2 по сравнению с Neurexin3'WT SS4-. (A)Репрезентативные изображения отрицательного контроля после 60-минутной инкубации mCherry с GFP, mCherry с LRRTM2, GFP с Neurexin3'WT SS4/-, и GFP с Neurexin3'A687T SS4/-. Агрегация наблюдалась после 60 минут как в LRRTM2 с Neurexin3'WT SS4-, так и lRRTM2 с Neurexin3'A687T SS4-. (B)Количественная оценка индекса агрегирования во всех условиях SS4 »после 60 минут. Индекс агрегации - область перекрытия/(область канала 1 - область канала 2 - область перекрытия) x 100. (C) Так же,как ( B), но SS4-. Показанные данные представляют среднее ± SEM числа экспериментов (SEM: GFP/mCherry ± 0.0245, mCherry/LRRTM2 ± 0.02465, GFP/Neurexin3'WT SS4- ± 0.02453, GFP/Neurexin3'A687T SS4- ± 0.0109, Neurexin3'WT SS4-/LRRTM2 ± 0.0538, Neurexin3'A687T SS4-/LRRTM2 ± 0.0174; стр. 0.0136). Номера, представленные в барах, представляют собой количество независимых экспериментов. Пунктирные линии представляют собой базовую или среднюю минимальную агрегацию условий управления. Статистическая значимость определялась одной стороной ANOVA, множественными сравнениями; р-н;0,05; plt;0.0001.Эта цифра была изменена с Restrepo et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительные файлы кодирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рассечение белково-белковых взаимодействий, которые происходят в транс во время клеточной адгезии, может привести к лучшему пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе основных клеточных процессов, включая образование, функцию и поддержание синапсов во время созревания и реконструкции. Последствия взаимодействия от клетки к клетке выходят за рамки нейробиологии и играют более широкую роль в трансдукции сигналов, миграции клеток и развитиитканей 14. Аберрации в клеточной адгезии может нарушить клеточные процессы императив для надлежащей функции клеток и может лежащие в основе различных этиологий, таких как рак, артрит, наркомания, аутизм ишизофрения1,15,16. Здесь мы предоставляем оптимизированный подробный протокол, включающий агрегацию клеток HEK, который позволяет тестировать взаимодействие клеток втранс.
С помощью этого протокола агрегации клеток HEK мы можем вскрыть различия в агрегации, чтобы приблизить связывающую способность между пресинаптическим белком и его постсинаптической лигандом. Таким образом, мы можем задать такие вопросы, как: является ли взаимодействие между двумя основными синаптических белков, пострадавших от точки мутации? В частности, зависит ли транс-взаимодействие Neurexin3 с LRRTM2 от A687T? Изучаемая здесь мутация A687T находится в ранее неизученной области связующим звенавнеклеточного домена Neurexin3'7. Результаты показывают, что мутация A687T усиливает агрегацию клеток, содержащихNeurexin3'A687T, к клеткам, содержащим LRRTM2(рисунок 2C). Этот вывод имеет важное значение, поскольку ранее было показано, что LRRTMs только связывать с Neurexins через домен Neurexin называется LNS617, и далее предполагает, что последовательности вверх по течению LNS6 может оказать независимое влияние на транс-взаимодействия между Neurexin3' SS4- и LRRTM27.
Результаты на рисунке 2 демонстрируют специфику этого анализа как всех негативных элементов управления (GFP/mCherry; Neurexin3'WT/A687T SS4 - -mCherry/GFP или LRRTM-GFP/mCherry) не имел наблюдаемой агрегации через 60 минут. Критический контроль, используемый в данном исследовании, Neurexin3'WT/A687T SS4" -mCherry/LRRTM-GFP, также не проявлял агрегации после 60 минут, потому что LRRTM2, как известно, связываются исключительно с SS4 не хватает (SS4-) изоформы Neurexin. Этот контроль показывает, что простого переэкспрессии мембранных молекул недостаточно, чтобы заставить агрегацию в этой системе, что еще раз иллюстрирует специфику этого анализа.
Анализ клеточной адгезии, описанный здесь, широко используется для проверки взаимодействия транссинаптических молекул клеточной адгезии8,18,19; однако, он может быть использован для проверки клея клеток к клеткам взаимодействия мембраны привязали белков. Этот протокол, который развивался с течением времени, был оптимизирован из первоначально опубликованного протокола и последующих вариаций протокола путем изменения трех экспериментальных параметров. Во-первых, была изменена температура инкубации клеток. Первоначальный протокол требует инкубации ячеек в шаге 1.9 при 4 градусах Цельсия. Эта низкая температура может выступать в качестве экологического стрессора и может снизить жизнеспособность клеток, ведущих к гибели клеток и лизу. Во время клеточного лиза клетки выделяет геномную ДНК и клеточный мусор в средства массовой информации, что приводит к слипанию клеток в растворе, что приводит к ложным срабатываниям во время визуализации. Во-ве, количество клеток на одно состояние было увеличено до 200 000 на душу населения, а объективный размер был изменен на 5 раз; это позволяет исследователю изображение большего количества взаимодействий в поле зрения, с тем чтобы увеличить статистическую мощность в каждом n. В-первых, индекс агрегации измерялся по-разному. Предыдущие индексы агрегации ограничивались выбором размера кластера экспериментатором, что привело к исключению кластеров "подтрастания". В отличие пороговые значения теперь устанавливаются для индивидуального размера ячейки на "нулевом времени", и агрегация теперь рассчитывается как перекрывающаяся область, разделенная на сумму двух областей канала минус область перекрытия, умноженная на 100 в "время 60", что позволяет включить меньшие положительные кластеры, что делает анализ более чувствительным к другим белкам-лигандовым парам(рисунок 2B,C).
Устранение неполадок и оптимизация могут потребоваться в зависимости от взаимодействующих белков испытания. Хотя инкубационный период до окончательного получения изображения будет отличаться в зависимости от проверенных белков, крайне важно, чтобы агрегация не наблюдалась на «нулевом уровне времени». Если агрегация рассматривается в нулевое время, это может означать, что клетки не были здоровы с самого начала. Это может быть связано с несколькими факторами, включая внезапное воздействие температур ниже 37 градусов по Цельсию или медленной экспериментальной процедуры. Важно отметить, что средства повторной помощи для шага 1.7 должны быть при температуре 37 градусов по Цельсию, что позволит клеткам постепенно достигать комнатной температуры без резкого резкого падения температуры. Один из способов иметь оптимальное здоровье клеток на протяжении всего эксперимента заключается в обеспечении того, чтобы шаги 1,7 до 1,9 были завершены в течение 25 минут таймфрейм без перерывов между ними. Рекомендуется, чтобы микроскоп был настроен и готов к использованию перед ячейками сбора урожая в шаге 1.5; это гарантирует, что истинное изображение «нулевого времени» может быть принято немедленно в шаге 2.2.
Если агрегация не наблюдается после 60 минут инкубации, несколько факторов могут способствовать этому отсутствию адгезии. Во-первых, белки, о котором идет речь, не могут быть связывающими партнерами или могут участвовать в низкой близости взаимодействий, не обнаруживаемых этим анализом. В этом случае может потребоваться более чувствительный анализ. Во-вторых, белок (ы) интерес не может локализоваться на мембрану, когда выражается только в клетках HEK. В этом случае подтвердите, что белок локализован мембраной с помощью биохимических методов (поверхностное биотинилирование) или непосредственно пометить белок интереса флуоресцентным тегом и изображением HEK293T клеток в 40x или выше увеличение для оценки выражения поверхности. Однако после того, как локализация мембраны подтвердится, мы рекомендуем использовать нетеговые варианты для этого анализа агрегации клеток HEK, чтобы более точно оценить связывающую способность родного белка. В-третьих, в этом протоколе мы позволили Neurexin3 "выразить в течение 48 ч; однако время экспрессии белка может варьироваться в зависимости от проверенных белков. В-четвертых, крайне важно дополнить средства массовой информации в шаге 1,7 с MgCl2 и CaCl2, если белки, о котором идет речь, зависят от дивалентных катиций, как это имеет место на примере Neurexins и LRRTM211. Если неизвестно, требуют ли партнеры по взаимодействию дивалентных cations для адгезии, добавьте EDTA в одно условие. EDTA должны chelate реминации cations естественно присутствует в DMEM обеспечения кальция и магния свободный раствор. Если адгезия наблюдается после добавления ЭДТА, белки, о котором идет речь, не требуют дивалентных cations для адгезии.
Существует много методов для проверки белковых взаимодействий; однако, большинство из них не являются специфическими для тестирования только транс взаимодействий, которые происходят от клетки к клетке и требуют утомительных шагов очистки белка. Хотя анализ агрегации клеток HEK не является прямой мерой близости и не должен использоваться для замены более количественного подхода к восстановлению констант диссоциации, насколько нам известно, этот анализ представляет собой подход к проверке истинных транс-взаимодействий полуколичественным и относительно эффективным образом. Кроме того, из-за относительной простоты этого анализа, анализ агрегации клеток HEK может быть использован в сочетании с этими более количественными подходами для получения более широкой и более полной характеристики происходящих взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национального института психического здоровья (R00MH103531 и R01MH116901 до J.A.), додокторского обучения Грант от Национального института общей медицины (T32GM007635 к S.R.), и Лида Хилл Гиллиам стипендий для перспективных исследований (GT11021 в S.R.). Мы благодарим доктора Кевина Вульфри за помощь с микроскопом, доктора К. Ульриха Байера за использование его эпифлуоресцентного микроскопа и Томаса Сюдхофа (Стэнфордский университет) для плазмиды LRRTM2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M.
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
