Summary
Lo scopo di questa tecnica è la visualizzazione ex vivo delle reti arteriliiche polmonari dei primi topi postnatali e adulti attraverso l'inflazione polmonare e l'iniezione di un composto a base di polimeri radio-opaco attraverso l'arteria polmonare. Vengono inoltre discusse le potenziali applicazioni per i tessuti castati.
Abstract
I vasi sanguigni formano reti intricate nello spazio tridimensionale. Di conseguenza, è difficile apprezzare visivamente il modo in cui le reti vascolari interagiscono e si comportano osservando la superficie di un tessuto. Questo metodo fornisce un mezzo per visualizzare la complessa architettura vascolare tridimensionale del polmone.
Per raggiungere questo obiettivo, un catetere viene inserito nell'arteria polmonare e la vascolatura viene simultaneamente lavata di sangue e dilatata chimica per limitare la resistenza. I polmoni vengono poi gonfiati attraverso la trachea a una pressione standard e il composto polimerico viene infuso nel letto vascolare ad una velocità di flusso standard. Una volta che l'intera rete arteriosa è stata riempita e autorizzata a curare, la vascolatura polmonare può essere visualizzata direttamente o su uno scanner micro-CT.
Quando eseguito con successo, si può apprezzare la rete arteriosa polmonare nei topi che vanno dalle prime età postnatali agli adulti. Inoltre, mentre dimostrato nel letto arteriosa polmonare, questo metodo può essere applicato a qualsiasi letto vascolare con posizionamento del catetere ottimizzato e punti finali.
Introduction
Il focus di questa tecnica è la visualizzazione dell'architettura arteriosa polmonare utilizzando un composto a base di polimeri nei topi. Mentre è stato eseguito un ampio lavoro su letti vascolari sistemici come cervello, cuore e rene1,2,3,4,5, sono disponibili meno informazioni per quanto riguarda la preparazione e il riempimento della rete arteriosa polmonare. Lo scopo di questo studio, quindi, è quello di ampliare il lavoroprecedente 6,7,8 e fornire un riferimento scritto e visivo dettagliato che i ricercatori possono facilmente seguire per produrre immagini ad alta risoluzione dell'albero arteriosa polmonare.
Mentre esistono numerosi metodi per l'etichettatura e l'imaging della vascolatura polmonare, come la risonanza magnetica, l'ecocardiografia o l'angiografiaTC 9,10, molte di queste modalità non riescono a riempire adeguatamente e/o catturare i piccoli vasi, limitando la portata di ciò che può essere studiato. Metodi come la sezionazione seriale e la ricostruzione forniscono alta risoluzione, ma sono tempo/lavoro ad altaintensità di tempo 11,12,13. L'integrità dei tessuti molli circostante è compromessa nella colata di corrosionetradizionale 10,,13,14,15,16. Anche l'età e le dimensioni degli animali diventano fattori quando si tenta di introdurre un catetere o, la risoluzione è carente. La tecnica di iniezione polimerica, d'altra parte, riempie le arterie al livello capillare e, se combinata con la CT, consente una risoluzione senza precedenti5. I campioni dei polmoni di topo giovani come il giorno postnatale 14 sono stati lanciaticon successo 8 ed elaborati in poche ore. Questi possono essere riscanci a tempo indeterminato, o addirittura inviati per preparazione irologica/ microscopia elettronica (EM) senza compromettere il tessuto molleesistente 17. Le principali limitazioni di questo metodo sono il costo iniziale delle apparecchiature/software CT, le sfide con il monitoraggio accurato della pressione intravascolare e l'incapacità di acquisire dati longitudinalmente nello stesso animale.
Questo documento si basa sul lavoro esistente per ottimizzare ulteriormente la tecnica di iniezione dell'arteria polmonare e spingere i confini relativi all'età/dimensione fino al giorno postnatale 1 (P1) per produrre risultati sorprendenti. È più utile per i team che vogliono studiare le reti vascolari arteriose. Di conseguenza, forniamo nuove linee guida per il posizionamento/stabilizzazione del catetere, un maggiore controllo sulla frequenza/volume di riempimento ed evidenziamo notevoli insidie per un maggiore successo di colata. I cast risultanti possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione futura e l'analisi morfologica. Forse ancora più importante, questa è la prima dimostrazione visiva, a nostra conoscenza, che guida l'utente attraverso questa procedura complessa.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) del National Heart Lung and Blood Institute.
1. Preparazione
- Iniettare il topo intraperitonealmente con epatina (1 unità/g peso corporeo del topo) e lasciare che ambulate per 2 min.
- Eutanasia l'animale in una camera di CO2.
- Disporre il mouse in posizione supina su una tavola chirurgica e fissare tutti e quattro gli arti alla scheda con del nastro adesivo. Utilizzare l'ingrandimento per la dissezione fine.
2. Esposizione di polmoni e trachea
- Spruzzare il lato ventrale del mouse con il 70% di etanolo per ridurre al minimo le interferenze dei capelli.
- Afferrare la pelle addominale con le forche e fare una piccola incisione con forbici nella regione ombelicale. Far scorrere le punte delle forbici nello strato fasciale tra la muscolatura addominale e la pelle e iniziare a separare i due strati. Lavorare in modo rostrale, rimuovendo la pelle dall'addome, dalla gabbia toracica e dal collo.
- Aprire la muscolatura addominale con le forbici e tagliare lateralmente su entrambi i lati fino a quando il diaframma è esposto.
- Afferrare delicatamente il processo xifoide e sollevare leggermente la gabbia toracica massimizzando la vista dei polmoni caudali attraverso il sottile diaframma semitrasparente. Fare con attenzione una piccola incisione nel diaframma appena sotto il processo xifoide. I polmoni collasseranno e si ritrarranno dal diaframma. Disiezionare il diaframma lontano dalla gabbia toracica, facendo attenzione a non nick il parenchyma polmonare.
- Individuare e recidere la vena cava inferiore (IVC) e l'esofago dove passano attraverso il diaframma. Utilizzare la garza per pulire il sangue di pooling nella cavità toracica, evitando il contatto con i polmoni.
- Afferra lo xifoide ancora una volta e solleva delicatamente. Tagliare bilateralmente la gabbia toracica (approssimativamente sulla linea midaxillary) evitando il contatto con i polmoni. Rimuovere completamente la gabbia toracica anteriore, effettuando il taglio finale lungo l'angolo sternale appena prima del manubrium.
- Utilizzando una siringa precompilata, bagnare liberamente i polmoni con salina tamponata di fosfati (PBS, pH 7.4) per evitare l'essiccazione. Continuare questa routine per tutta la procedura.
- Utilizzando le forcepi, afferrare il manubrium e elevarsi delicatamente dal corpo. Utilizzando le forbici, tagliare 1-2 mm lateralmente al manubrium, recidendo le clavicide e rimuovere. Questo esporrà il timo sotto.
- Afferra ogni lobo del timo, allontanati e rimuovi. Ripetere questa procedura con la ghiandola submandibolare. Infine, rimuovere il tessuto muscolare sovrapposto alla trachea.
NOTA: Dopo la dissezione, il cuore, l'aorta ascendente (AA), il tronco arteriosa polmonare (PAT) e la trachea devono essere visibili. Assicurarsi che i rami arteriostri primari del tronco non siano divisi o feriti.
3. Cateterizzazione PA e perfusione di sangue
- Per assemblare l'unità 1, infilare 15 cm di PE-10 tubo sul mozzo di un ago da 30 G e attaccarlo a una siringa da 1 mL precompilata con 10-4 M di sodio nitroprusside (SNP) in PBS. Far srotolare il tubo avanzando lo stantuffo fino a quando tutta l'aria viene epurata da questa unità ( Figura 1).
CAUTION: SNP è tossico se ingerito. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Lavare accuratamente la pelle dopo la manipolazione. Indossare attrezzature di protezione personale adeguate.- In alternativa, assemblate l'Unità 2. Per i topi postnatali giorno 7 (P7) e più giovani, utilizzare un emostatico per staccare un ago aggiuntivo 30 G dal suo hub e infilare l'ago all'estremità aperta del tubo dell'unità 1 (Figura 1).
- Invece di un ago, utilizzare le force curve affilate per afferrare un'estremità di una lunghezza di 10 cm di seta 7-0. Penetrare l'apice del cuore entrando da un lato e passando le punte delle forcepi attraverso il muscolo e fuori dall'altro lato. Afferrare la seta con un'altra serie di forcembi e tirare circa una lunghezza di 2 cm attraverso e legare. Prendere l'estremità rimanente di 8 cm della sutura, tirando il cuore caudally, e nastro adesivo l'estremità alla scheda chirurgica.
NOTA: Questo creerà tensione, esponendo ulteriormente i grandi vasi e legato il cuore in posizione, consentendo un più facile posizionamento del catetere nell'arteria polmonare. - Agganciare le punte delle force curve sotto l'AA e PAT. Tirare una lunghezza di 3 cm di 7-0 seta indietro attraverso l'apertura e creare una sutura sciolta a lancio singolo.
- Utilizzando le forbici fare un'incisione 1-2 mm verso l'apice del cuore, penetrando il ventricolo destro a parete sottile (RV), per consentire l'inserimento del catetere (Unità 1). Prima dell'inserimento, verificare che non vi sia aria nel sistema. Introdurre il tubo innescato nel ventricolo destro e avanzare delicatamente nel PAT semitrasparente a parete sottile.
- Verificare visivamente che il catetere non sia avanzato nei rami polmonari sinistro o destro e non si achioti il ramo dell'arteria polmonare. Utilizzando il nastro adesivo, fissare la parte distale del tubo alla scheda chirurgica.
NOTA: Per identificare il camper, utilizzare le fopante per pizzicare il lato destro del cuore. A differenza del ventricolo sinistro, la parete libera relativamente sottile del camper dovrebbe essere facilmente afferrata. - Per i topi più giovani di P7, collegare l'unità 2 a un micromanipolatore e introdurre l'estremità dell'ago dell'unità nel PAT come descritto sopra utilizzando il manipolatore.
- Verificare visivamente che il catetere non sia avanzato nei rami polmonari sinistro o destro e non si achioti il ramo dell'arteria polmonare. Utilizzando il nastro adesivo, fissare la parte distale del tubo alla scheda chirurgica.
- Stringere delicatamente la sutura allentata attorno a entrambi i grandi vasi e tagliare la lunghezza di 8 cm di sutura creata nel punto 3.2 per riportare il cuore in una posizione di riposo naturale. Il catetere è ora saldamente fissato all'interno del PAT.
- Agganciare l'auricolare sinistro del cuore per consentire al perfuso di uscire dal sistema.
- Proteggere la siringa contenente SNP (unità 1 o unità 2, a seconda delle dimensioni) nella pompa di siringa e perfuse la soluzione ad una velocità di 0,05 mL/min per lavare il sangue e dilatare al massimo la vascolatura. Sangue/perfusato uscirà attraverso l'auricolare tagliato. Continuare la perfusione fino a quando il perfusate non è chiaro (200 dollari di L in un topo adulto, meno per gli animali più giovani).
NOTA: quando si perfuoca il PBS/SNP a bassa viscosità, è stato utilizzato un tasso di infusione relativamente più elevato nell'interesse del risparmio di tempo. Il composto polimero più viscoso viene infuso a una velocità più lenta per evitare il riempimento eccessivo, la rottura e il controllo sui punti finali distale.
4. Tracheostomia e inflazione polmonare
- Costruire l'unità di inflazione polmonare (Figura 2).
- Collegare un catetere in plastica flessibile 24 G (IV) (aghi rimossi)/butterfly infusione impostato su un stopcock, attaccato a una siringa aperta da 50 mL (senza stantuffo). Appendere la siringa da un supporto ad anello.
- Aggiungere il 10% di formalina tamponata alla siringa. Aprire il stopcock, permettendo formalin per entrare nel tubo e ripulire tutta l'aria dal sistema. Chiudere il pavone e sollevare la siringa fino a quando il menisco è 20 cm sopra la trachea8.
CAUTION: Formalin è infiammabile, cancerogeno, acutamente tossico quando ingerito, e provoca irritazione della pelle, gravi danni agli occhi, sensibilizzazione della pelle e mutagenicità delle cellule germinali. Evitare l'ingestione e il contatto con la pelle e gli occhi. Evitare l'inalazione del vapore o della nebbia. Tenere lontano da fonti di accensione. Indossare attrezzature di protezione personale adeguate.
- Posizionare due suture sciolte inferiori alla cartilagine cricoide a 2-4 mm di distanza.
- Utilizzando le forbici, fare una piccola incisione nel legamento cricotiroide superiore alle suture.
- Inserire il catetere IV nell'apertura e far avanzare la punta oltre le due suture sciolte.
- Stringere le suture intorno alla trachea e aprire il stopcock. Lasciare che la formalina entri nei polmoni per gravità e attendere 5 minuti per i polmoni per gonfiarsi completamente. Se i polmoni aderiscono alla gabbia toracica durante l'inflazione, afferrare l'esterno della gabbia toracica con le forfie con punta smussata e muoversi in tutte le direzioni per aiutare a liberare i lobi. Non prendere contatto diretto con i polmoni.
- Dopo 5 minuti, indietro il catetere IV oltre la prima sutura e ligate. Ripetere l'operazione per la seconda sutura. I polmoni sono ora gonfiati in uno stato chiuso e pressurizzato.
5. Lanciare la vascolatura
- In un tubo da 1,5 mL, preparare 1 mL di una soluzione 8:1:18 di polimero:diluente: agente di cura e invertire delicatamente più volte per garantire una buona miscelazione.
- Togliere lo stantuffo da una siringa da 1 cc, coprire l'estremità opposta con un dito guanto e versare il composto polimero nella siringa. Reinserire con attenzione lo stantuffo, invertire e far avanzare lo stantuffo per rimuovere tutta l'aria e formare un menisco sulla punta della siringa.
- Rimuovere la siringa SNP/PBS dal mozzo dell'ago e gocciolare PBS aggiuntivo nel mozzo per creare un menisco. Controllare attentamente l'hub per l'aria intrappolata, spostare se necessario, e riformare il menisco. Unire l'hub alla siringa riempita con il composto polimero.
NOTA: La creazione di un menisco su entrambe le estremità riduce significativamente la possibilità per l'aria di entrare nel sistema. - Attaccare la siringa riempita composto polimero alla pompa di siringa e infondere a 0,02 mL/min.
NOTA: Per i polmoni più piccoli, una velocità più lenta può essere utile per prevenire il riempimento eccessivo, ma non è essenziale. - Monitorare il composto mentre si muove liberamente lungo il tubo PE e notare il volume della siringa mentre entra nel PAT. Continuare a riempire fino a quando tutti i lobi sono riempiti completamente fino al livello capillare e fermare la pompa di siringa. Controllare nuovamente il volume della siringa.
NOTA: dopo diverse esecuzioni, è possibile utilizzare un volume stimato per misurare un endpoint approssimativo (35 usd per un topo adulto e 5 USD per un cucciolo P1). Dopo che la pompa è stata arrestata, la pressione residua nel sistema continuerà a spingere il composto polimero nelle arterie polmonari. Tutti i lobi polmonari dovrebbero riempirsi ad un ritmo simile. - Coprire i polmoni con una salvietta di pulizia in fibra ottica, applicare liberamente PBS, e lasciare che la carcassa si sieda indisturbata per 30-40 min a temperatura ambiente. Durante questo periodo, il composto polimerica curerà e si indurisce.
- Rimuovere il catetere, seire le braccia/metà inferiore del mouse e posizionare la testa/torace in un conico da 50 mL riempito con 10% di formalina tamponata durante la notte.
- Dopo la fissazione, afferrare la trachea e separare delicatamente l'unità cuore/polmone dalla gabbia toracica e dal torace rimanenti. Posizionare il blocco cuore/polmone in una fiala scintillazione riempita di formalina. Scarta il resto.
6. Letti vascolari alternativi per la colata (tabella 1)
NOTA: Ogni letto vascolare bersaglio può richiedere diversi posizionamenti del catetere, tassi di infusione e tempi di riempimento ottimali. Così, più animali saranno necessari per lanciare più organi.
- Per i letti vascolari sistemici superiori o inferiori al diaframma seguire i passaggi 1.1-2.5 come sopra. Vedere ulteriori note sul sistema del portale e sul diaframma (Tabella 1).
- Afferrare il processo xifoide con un emostatico e tagliare bilateralmente la gabbia toracica (approssimativamente nella linea midaxillary) appena prima delle arterie toracici interne.
- Piegare la gabbia toracica ancora collegata su tale che è appoggiata sul collo / testa dell'animale, esponendo completamente la cavità toracica.
- Seguire il passaggio 3.1 precedente, quindi rimuovere i polmoni. Una volta che l'aorta toracica (TA) è visibile, agganciare le punte delle punte curve sotto di essa, 10 mm di qualità superiore al diaframma. Afferrare una lunghezza di 3 cm di seta 7-0, tirare indietro attraverso l'apertura sotto l'TA, e creare una sutura sciolta a lancio singolo. Ripetere questa procedura 8 mm sopra il diaframma.
- Per le strutture superiori al diaframma, utilizzare le forbici a molla per creare un piccolo foro (30% della circonferenza totale) sulla parte ventrale dell'TA, 2 mm inferiore alle suture sciolte poste al punto 6.4.
- Per le strutture inferiori al diaframma, invece, creare un piccolo foro di 2 mm superiore alle suture sciolte.
- A seconda delle dimensioni dell'animale, introdurre l'Unità 1 o 2 nella nave, avanzare oltre le suture sciolte e legare delicatamente la nave.
- Seguire il punto 3.7, impostando la pompa di siringa ad una velocità di 1,0 mL/min e perfutilizzando un minimo di 5 mL. Perfusate uscirà tramite l'IVC.
- Seguire i passaggi da 5.1 a 5.4 regolando la velocità di infusione a 0,05 mL/min, monitorando visivamente il tessuto bersaglio in tempo reale.
NOTA: il volume di infusione sarà specifico per l'età degli organi e degli animali. Il volume può essere ulteriormente limitato da rami arteriosi leganti che portano a letti vascolari non bersaglio (ad esempio, cervello, fegato, rene, intestino). - Seguire 5.6 quindi rimuovere il tessuto bersaglio e posizionare in formalina.
7. Campionamento del montaggio, scansione e ricostruzione per micro-CT
- Utilizzando la pellicola di paraffina, creare una superficie piana sul letto di scansione e centrare il campione bagnato su questa superficie (Figura 3A).
NOTA: se viene rilevato un elemento di movimento, il campione potrebbe richiedere un'ulteriore stabilizzazione. - Campione di tenda/copertura leggermente con pellicola di paraffina aggiuntiva per prevenire la disidratazione. Fare particolare attenzione a non appoggiare la pellicola di paraffina sul campione causando deformazioni al tessuto (Figura 3B).
- Eseguire la scansione del campione utilizzando le impostazioni descritte nella tabella 2 e standardizzare questi parametri all'interno di un determinato esperimento.
NOTA: si tratta di un'esperimento/endpoint dipendente. Standardizzare i parametri scelti per facilitare il confronto tra i campioni. - Trasferire le scansioni ricostruite per la post-elaborazione e l'analisi.
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Representative Results
Un cast di successo mostrerà un riempimento uniforme dell'intera rete arteriosa polmonare. Lo dimostriamo nei topi C57Bl/6J che variano in età: giorno postnatale P90 (Figura 4A), P30 (Figura 4B), P7 (Figura 4C) e P1 (Figura 4D). Controllando la velocità del flusso e monitorando visivamente il riempimento in tempo reale, sono stati raggiunti endpoint affidabili della vascolatura più distale (Figura 5A).
Le sfide comuni includono danni ai polmoni, riempimento incompleto, riempimento in subfilling o riempimento eccessivo, wedging del catetere e dimensioni degli animali.
In caso di danni al polmone/aerovia, piccole perdite impediranno ai polmoni di tenere la pressione (Figura 5B,C). In assenza di un'inflazione completa, diventa difficile effettuare confronti quantitativi e spaziali accurati tra i campioni. Per ridurre al minimo il rischio di parenchyma polmonare, evitare di tagliare troppo da vicino ai polmoni quando si rimuove la gabbia toracica e mantenere i polmoni umidico con PBS durante tutta la procedura per evitare la disidratazione e l'aderenza alle strutture circostanti. Se un lobo aderisce alla gabbia toracica durante l'inflazione, afferrare delicatamente l'esterno della gabbia toracica (lontano dal polmone) con le finci e spostarlo in una direzione per liberare i lobi. In alternativa, uno strumento smussato, come una spatola, con un bordo liscio può essere utilizzato per sollevare o spingere il polmone gonfiato lontano dalla gabbia toracica. Quando si gonfiano i polmoni, aderire ai parametri di pressione suggeriti ed evitare un'inflazione troppo elevata in quanto ciò può portare alla rottura delle vie respiratorie. Infine, non rimuovere i polmoni dalla cavità toracica fino al completamento della post-fissazione. La trachea, i polmoni e il cuore devono essere rimossi in blocco dalle restanti porzioni della cavità toracica.
Il riempimento irregolare(Figura 5D)o incompleto (Figura 5E) può derivare da una "airlock", in cui l'aria viene introdotta nel sistema vascolare tramite il catetere, bloccando il flusso a valle del composto. Per ridurre al minimo la possibilità di una airlock, eliminare l'aria dalla punta del catetere prima dell'inserimento (punto 3.4) e durante la transizione della siringa da SNP/PBS a composto polimero. Se il riempimento rimane irregolare o incompleto, potrebbe essere un'indicazione di una maggiore resistenza vascolare a causa di stenosi di segmento focale/lungo o tortuosità. I coaguli di sangue possono anche portare a riempimento incompleto e sono facilmente evitabili utilizzando l'epatina prima della procedura.
Un volume di iniezione non corretto porterà al riempimento o al riempimento eccessivo. Il riempimento eccessivo si verifica quando troppo poco composto viene introdotto nella vascolatura (Figura 5F). In alternativa, il riempimento eccessivo o l'introduzione troppo rapida di un composto polimero può causare la rottura arteriosa (Figura 5G) o, più comunemente, il transito venoso (Figura 5H). Entrambi i problemi possono essere alleviati utilizzando una pompa di siringa. I ricercatori devono rispettare attentamente le restrizioni di tasso e volume proposte o stabilire le proprie tariffe in base al loro modello specifico e all'ottimizzazione. Il monitoraggio della perfusione di composti polimeri in tempo reale in ingrandimento è fondamentale e il riempimento di piccole arteriole/capillari deve essere utilizzato come endpoint.
Avanzare il catetere troppo in basso nel tronco polmonare può causare la punta a cuneo in un ramo dell'arteria polmonare e creare uno squilibrio nel flusso. Di conseguenza, un lato si riempie più velocemente dell'altro (Figura 5I), che spesso porta a un riempimento eccessivo in un polmone e al riempimento nell'altro. Mentre lo slittino del catetere è la ragione più probabile in questo scenario, "airlock" e la mancanza di eparla può anche essere fattori che contribuiscono.
Infine, gli animali più piccoli presentano la propria serie di ostacoli aggiuntivi. Gli animali più giovani chiedono mani ferme e piccoli errori sono meno indulgenti. Gli strumenti di alta qualità, specificamente progettati per la microchirurgia, diventano più importanti nei primi timepoint postnatali. L'uso di un micromanipolatore aiuta notevolmente non solo nel posizionamento, ma anche nella prevenzione della dislocazione del catetere. È inoltre essenziale utilizzare la pompa di siringhe su piccoli animali per controllare e gestire con precisione gli endpoint.
Sebbene specificamente mostrata per la vascolatura polmonare, questa procedura può essere facilmente applicata anche ai letti vascolari bersaglio sistemico (tabella 1). Oltre alle sfide sopra elencate, è fondamentale scegliere il punto di ingresso giusto. La colata attraverso l'aorta toracica produce ottimi risultati per la maggior parte dei letti vascolari. Va notato, tuttavia, che l'inserimento del catetere il più approssimato possibile al sito di destinazione e la legatura non bersaglio assiste nel controllo del flusso e del volume. Questi perfezionamenti combinati con un adeguato monitoraggio diretto degli endpoint vascolari distale (Figura 6A-F) e le velocità di infusione standard ottimizzano il riempimento. Molti esempi di tali metodi di cast esistono nella letteratura e sono troppo numerosi per un riferimento completo. Tuttavia, ulteriori dettagli possono essere trovati nel testo specifico dell'organo comequesti 4,5,7,18,19,20,21.
Dopo la colata, i campioni possono essere elaborati per la scansione di CT (Figura 7A,B). Per la post-elaborazione, un pacchetto software commerciale (vedere Tabella dei materiali) ha prodotto un rendering in volume 3D dell'albero vascolare polmonare presentato come immagini fisse ( Figura7C) o filmati. Ulteriori analisi statistiche che esplorano le caratteristiche vascolari come la lunghezza e il numero del segmento, la tortuosità, l'ordine (generazione o rango), il volume e la lunghezza arcade possono anche essere eseguite. Oltre alla scansione CT, i campioni castati possono anche essere cancellati per ottenere immagini lorde o elaborati e tagliati per l'analisi itologica8.
Figura 1: Configurazione del catetere e dell'ago. Le siringhe sono mostrate con tubi e aghi attaccati (Unità1 e Unità2). Inset: primo piano di ago e tubi. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Impostazione dell'inflazione polmonare. Supporto ad anello, morsetto, siringa piena di formalina e tubi con un catetere attaccato. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Preparazione del campione Micro-CT. (A) Qui il campione è stato centrato su una base di pellicola di paraffina, (B) Qui il campione è stato centrato e coperto sulla base del parafilm. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Polmoni vascolari in fasi di sviluppo variabili da 3 mesi a 1 giorno di età. Vista dorsale dei polmoni, (A) P90, (B) P30, (C) P7 e (D) P1 Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esempi di riempimento ideale ed errori comuni durantel'infusione di composti polimeri. (A) Quando è stato raggiunto il punto finale di riempimento, è stata osservata una rete vascolare robusta e fine. (B) I polmoni perfuso di formalina completamente gonfiati sono rappresentati da una linea tratteggiata bianca, (C) Vengono mostrati i polmoni sottogonfiati/sgonfi. Questo è stato osservato a causa di una compromessa vie respiratorie polmonari. La posizione gonfiata originale è rappresentata da una linea tratteggiata bianca e la posizione sgonfia è rappresentata da una linea tratteggiata nera, (D) Riempimento irregolare: la vascolatura di porzioni del lobo rimane vuota mentre altre aree sono state interamente riempite, (E) Riempimento incompleto: il composto polimero non è riuscito a penetrare intere sezioni del polmone, (F) Riempimento: il composto polimero non è riuscito a riempire la vascolatura distale, (G) Rupture: la freccia punta al composto polimero estruso dalla vascolatura, (H) Riempimento venoso: si noti la freccia che punta ai segmenti arteriali interamente riempiti ed estendendosi nel sistema venoso. Le vene e le venucche erano di calibro significativamente più grande, (I) Cuneo del catetere: qui il catetere è stato evitato in un'arteria impedendo la vascolatura dei lobi destro da riempire completamente mentre il lobo sinistro era troppo pieno. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Colata vascolare e punti finali in organi aggiuntivi. (A) Rene: l'aspetto punctate del composto polimero nel glomerulo fornito il punto finale. (B) Fegato: notare i piccoli vasi visibili ai bordi dell'organo. (C) Stomaco: piccoli vasi erano visibili e completamente riempiti. (D) Intestino crasso: I piccoli vasi sono facilmente identificabili e riempiti. (E) Diaframma: il muscolo qui è sottile e traslucido con piccoli vasi riempiti apparenti. (F). Cervello: piccoli vasi erano visibili nella corteccia. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Immagini TC e rendering del volume 3D dei polmoni riempiti composti polimeri. (A) Una singola sezione polmonare ricostruita in scala di grigi, (B) Si trattava di una proiezione di intensità massima di una TAC prodotta da polmoni riempiti di polimeri, (C) Un rendering di volume 3D della sala giochi vascolare è stato generato utilizzando software disponibile in modo commerciale (vedi Tabella dei materiali). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Letto vascolare arteriale bersaglio | Posizionamento del catetere | Direzione infusione | Tasso di infusione | Note |
| Cervello | Aorta toracica che punta cranilmente | Retrogrado nei carotidi | .05ml/min | Cannulate aorta toracica, capovolgere il mouse alla posizione prona, aprire il cuoio capelluto, e monitorare visivamente il progresso del polimero attraverso il cranio. |
| Diaframma | Ventronico sinistro | Anterograde in interno toracico, freno e intercostale | .05ml/min | Aprire una finestra sul lato della gabbia toracica, lasciando intatta la maggior parte della gabbia toracica e il diaframma. Cannulate ventrical sinistro, clip atrio destro, e monitorare lo stato di avanzamento dal lato caudale del diaframma. |
| Muscolatura dell'arto superiore | Aorta toracica che punta cranilmente | Retrogrado nel subclave brachiocefalo e sinistro | .02ml/min | Per ottimizzare il flusso degli arti, legare le arterie carotidee e rimuovere la pelle degli arti per consentire il monitoraggio visivo del transito polimero nella muscolatura degli arti. |
| Rene | Aorta toracica che punta caudally | Anterogrado nelle arterie renali | .05ml/min | La vascolatura interna viene riempita ciecamente. Per evitare il transito venoso, interrompere l'iniezione quando il polimero è visibile in un modello forato uniforme attraverso il rene. |
| Sistema portale | Vena del portale | Anterograde nel sistema portale | .02ml/min | Piegare delicatamente il fegato per esporre la vena del portale. |
| Epatica | Aorta toracica che punta caudally | Anterograde nell'arteria epatico | .05ml/min | Legare la vena del portale prima dell'infusione per evitare il transito venoso dall'intestino che scorre nel fegato. |
| Stomaco / Intestino | Aorta toracica che punta caudally | Anterograde nel celiaco, superiore mesenterico e/o inferiore mesenterico | .05ml/min | Alcune regioni dell'intestino sono fornite da arterie multiple e possono riempirsi in momenti diversi. Per evitare il transito venoso, legare le arterie non necessarie per le aree di interesse e monitorare visivamente l'avanzamento del polimero. |
| Cuscinetti intra-addominali per grassi | Aorta toracica che punta caudally | Anterograde ma il vaso dipende dal tampone di grasso in fase di studio | .05ml/min | Le pastiglie di grasso sono fornite da più arterie e possono riempirsi in momenti diversi. Per evitare il transito venoso, legare le arterie non necessarie per un'area di interesse precisa e monitorare visivamente l'avanzamento del polimero. |
| Muscolatura degli arti inferiori | Aorta infrarenale puntamento caudally | Anterogrado nelle arterie femorali | .02ml/min | Rimuovere la pelle degli arti per consentire il monitoraggio visivo del transito dei polimeri nella muscolatura degli arti. |
Tabella 1. Casting letti vascolari alternativi.
| Impostazioni CT | |
| Kvp | 90 |
| Materiale di destinazione | Tungsteno |
| Potere | 8w |
| Filtrazione | Cu 0,06 mm - Al 0,5 mm |
| Numero di proiezione | 6424 |
| Dimensioni rilevatore | CMOS a pannello piatto - 2944 x 2352 pixel |
| Campo di vista (FOV) | 36 mm |
| Dimensione Voxel | 72 m |
| Risoluzione spaziale | formato voxel x 1,5 |
| Tempo di acquisizione | 14 min |
| Ricostruzione | FBP e algoritmo commerciale |
| Binning | 1x1 |
Tabella 2. Parametri di scansione CT.
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Discussion
Eseguito correttamente, questo metodo produce immagini sorprendenti di reti arteriose polmonari, consentendo il confronto e la sperimentazione nei modelli di roditori. Diversi passaggi critici lungo il percorso garantiscono il successo. In primo luogo, i ricercatori devono eparinizzare l'animale nella fase preparatoria per evitare che si forno coaguli di sangue nella vascolatura polmonare e nelle camere del cuore. Ciò consente il transito arteriosa completo del composto polimero. In secondo luogo, quando si perfora il diaframma e si rimuove la gabbia toracica, fare attenzione a proteggere i polmoni da danni involontari, tagli o lesioni. Qualsiasi perdita nelle vie aeree impedirà l'inflazione completa e renderà imprecisi i confronti tra i campioni. In terzo luogo, il legame del cuore all'apice aiuta il posizionamento del catetere. In quarto luogo, l'uso di un vasodilatore forte come SNP aiuterà sia nella rimozione del sangue che nel completo riempimento di arteriole e capillari5,8. Quinto, quando si inserisce il catetere nel PAT, fare attenzione a non seppellire la punta nella biforcazione. Questo causerà uno squilibrio nel flusso, evitando composto polimero al lato sinistro o destro, producendo un gradiente di pressione disuguale. Sesto, l'uso di una pompa di siringa permetterà all'utente di controllare la velocità e il volume sia per la deformazione del topo che per l'età. Infine, lasciare il cuore/polmone attaccato al resto della cavità toracica, fissare durante la notte e rimuovere il giorno successivo. I polmoni saranno ben fissati e il potenziale di deflazione a causa di graffi accidentali durante la separazione sarà ridotto al minimo.
Sebbene questa metodologia raggiunga i risultati desiderati, alcune tecniche alternative possono essere utili per alcuni utenti. Per facilitare il posizionamento del catetere, può essere impiegato un micromanipolatore. Abbiamo scelto una versione con un piccolo profilo e una base magnetica per ridurre al minimo l'invasione in un'area di lavoro già limitata, fornendo al contempo una base stabile (se si utilizza una base magnetica assicurarsi di posizionare una piastra d'acciaio sotto lo spazio di lavoro per consentire al magnete di impegnarsi). Ciò consente all'utente di posizionare con precisione la punta del catetere nel PAT ad un angolo che segue la traiettoria naturale dell'arteria. Inoltre, il catetere è sicuro e meno a rischio di essere sloggiato. Un'altra opzione è l'uso di una punta di catetere8. Anche se non banale da creare, un catetere è molto più sicuro e meno incline a scivolare accidentalmente fuori dal PAT. A seconda della vascolatura di destinazione e degli endpoint sperimentali, questa può essere una considerazione preziosa. L'eutanasia tramite CO2 può causare emorragie polmonari in una piccola percentuale di animali ed è dipendente dalceppo 22. Si consideri un protocollo alternativo per l'eutanasia in caso di impatto sugli endpoint sperimentali. Quando si gonfiano i polmoni, l'uso di formalin aiuta la fissazione dell'organo in atto alla pressione data. Un buffer fisiologicamente neutro può essere sostituito se le navi periferiche devono essere riempite in uno stato non fisso. Se il tasso di infusione e il controllo sono meno importanti per un determinato esperimento, è possibile anche la perfusione a mano. L'iniezione a mano richiede pratica e monitoraggio in tempo reale sotto ingrandimento per evitare il riempimento eccessivo o la rottura del vaso8. Infine, il montaggio/condizioni del tessuto, i parametri di scansione e la post-elaborazione minima che abbiamo impiegato per questa carta dovrebbero servire solo come punto di partenza. Scanner diversi, tessuti, endpoint sperimentali/esigenze dell'utente possono richiedere parametri alternativi.
Mentre le immagini vascolari generate da questa tecnica sono impressionanti, ci sono limitazioni. Principalmente, il metodo di cui sopra è non ottimale per misurare il calibro vascolare a causa dell'incapacità di monitorare e controllare la pressione intravascolare durante l'infusione. Altri gruppi sono riusciti ad affrontare in qualche modo queste preoccupazioni di pressione nella vascolatura sistemica monitorando la pressionedi guida 4,23, tuttavia, tali preoccupazioni sono ulteriormente amplificate sul lato polmonare a causa delle pareti dell'arteria polmonare relativamente sottili che sono facilmente disstensibili con piccoli cambiamenti nellepressioni 24 e l'incapacità di misurare con precisione e controllare staticamente la pressione intravascolare polmonare.
Una seconda limitazione a questo metodo è che rimane un esperimento post-mortem, singolo punto di tempo, limitando la sua utilità in studi che richiedono condizioni veramente fisiologiche o un corso di tempo. Altre misure animali vive, come l'angiografia polmonare TC (CTPA) o la CT (CE-CT) potenziata dal contrasto offrono la possibilità di misure funzionali e morfologiche. Scansioni ripetute/studi longitudinali e misurazioni in diversi punti del ciclo cardiaco/polmonare, possono essere esplorate10,25,26,27,28. Questi metodi possono essere utilizzati in modo affidabile, oltre all'ecocardiografia, per misurare il calibro arterioso. Tuttavia, sia il CTPA che le misure di ecocardiografia sono attualmente limitate alla valutazione della vascolatura prossimale. Per l'ecocardiogramma, la valutazione è limitata al tronco polmonare, mentre la CTPA consente un calcolo adeguato del calibro dell'arteria polmonare del ramo potenzialmente 1-2 ordini ulteriormente, ma la risoluzione è limitata, oscurando le porzioni distale della vascolatura7. Dosaggio di radiazioni è anche una preoccupazione che dovrebbe essere attentamente monitorato quando si utilizza CT soprattutto in studi longitudinali multi-scansione29,30. Per una di queste applicazioni, le apparecchiature , i tempi di scansione e il software di analisi possono essere costosi e richiedere una formazione specializzata del personale. Gli impianti di imaging degli animali in alcune istituzioni possono alleviare questo onere.
In alternativa a questo composto, alcuni gruppi utilizzano tecniche di colata di corrosione tradizionali accompagnate da rimozione dei tessutimolli 31,32. Questi metodi producono risultati simili a questo composto polimero, ma il prodotto finale è fragile, portando al potenzialeartefatto 15. Inoltre, la rimozione dei tessuti molli elimina il potenziale per la futura iologia33. Un'altra opzione è lasciare intatto il tessuto molle ed eseguire un passo di follow-up in cui il tessuto molle viene "cancellato" rendendo il campionepraticamente trasparente 34,35. La compensazione dei tessuti dà all'utente una certa capacità di vedere più in profondità all'interno di un campione, ma, nel complesso, rimane inferiore a CT in quanto non può fornire la stessa visualizzazione 3D. La sessione istologica seriale e la tomografia array sono metodi che offrono una risoluzione eccezionalmente elevata. Mentre questa tecnica apre le porte a nuove entusiasmanti possibilità, il carico di lavoro è esponenzialmente più alto e non particolarmente favorevole alle grandicoorti 11,12. L'istologia a raggi-X 3D è un approccio non distruttivo che coppie sia sCT e istologia tradizionale o anche EM36,37,38. Ci vuole una visione più di alto livello della patologia utilizzando CT per identificare globalmente e con precisione le regioni di interesse che vengono poi seguite con l'itologia di routine39. Sostituire gli agenti a contrasto a bassa risoluzione (o in alcuni casi nessun contrasto) con il composto polimero nella vascolatura potrebbe servire a elevare entrambe le tecniche quando possibile. Un altro approccio non distruttivo che è computazionalmente intensivo ma, potenzialmente migliora il contrasto, è il recupero di fase di imaging40,41. Questo metodo può essere utile quando si utilizza dati rumorosi in cui il contrasto è debole o nonpossibile 42. Il composto polimero impiegato in questa tecnica, tuttavia, non soffre di questa limitazione. Detto questo, il recupero di fase può essere utile quando il composto polimero è probabilmente diluito, ad esempio nella vascolatura distale43. Infine, la stereologia è stata uno standard nell'analisi strutturale quantitativa polmonare peranni 44. Utilizza il campionamento casuale e sistematico su sezioni trasversali di tessuto per effettuare deduzioni 3D supponendo che i campioni scelti siano sufficientemente rappresentativi. Mentre uno strumento potente, ha il potenziale per portare a errori e pregiudizi. La combinazione di immagini TC con stereologia, tuttavia, mantiene una grandepromessa 45.
Il metodo delineato è relativamente semplice e con la formazione è possibile ottenere un tasso di successo del >90%. Una volta padroneggiato, permette la fusione completa e affidabile della vascolatura polmonare. Nel fissativo, i tessuti e i polimeri rimangono stabili a tempo indeterminato per scansioni future, potenziali iotologia, o EM46,47. Abbiamo dimostrato che questa tecnica può essere utilizzata in animali giovani come P1 fino all'età adulta e crediamo che la fusione embrionale, attraverso l'arteria polmonare, sia a portata di mano. Va notato che questa tecnica può essere applicata praticamente a qualsiasi altro letto vascolare semplicemente alterando il punto di ingresso del catetere e determinando i punti finali appropriati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale NHLBI (DIR HL-006247). Ringraziamo il NIH Mouse Imaging Facility per la guida nell'acquisizione e nell'analisi delle immagini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
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