Method Article

Stabilité et structure du complexe histocompatibilité majeur de chauve-souris classe I avec β2-Microglobuline

DOI:

10.3791/61462

⸱

March 10th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit les méthodes expérimentales pour obtenir stable majeur complexe d’histocompatibilité (MHC) classe I grâce à des substitutions potentielles de β2-microglobuline (β2m) de différentes espèces. La comparaison structurale du MHC I stabilisée par des dommages homologues et β2m ont été étudiées.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le principal complexe d’histocompatibilité (MHC) joue un rôle central dans la présentation du peptide antigène et les réponses immunitaires des cellules T contre les maladies infectieuses et le développement tumoral. Le MHC hybride I complexé d’une substitution β2microglobulines (β2m) de différentes espèces peut être stabilisé in vitro. Il s’agit d’un moyen réalisable d’étudier le MHC I des mammifères, lorsque le β2m n’est pas disponible. Pendant ce temps, il est indiqué que la substitution β2m n’affecte pas significativement la présentation du peptide. Cependant, il y a peu de résumé s’agissant de la méthodologie et de la technologie du MHC hybride I complexés avec des β heterologous2-microglobuline (β2m). Ci-après, des méthodes d’évaluation de la faisabilité d’une substitution β2m dans l’étude MHC I sont présentées. Ces méthodes comprennent la préparation de constructions d’expression; la purification des organismes d’inclusion et le refolding du complexe du CSM; détermination de la thermostabilité des protéines; le criblage en cristal et la détermination de la structure. Cette étude fournit une recommandation pour comprendre la fonction et la structure du MHC I, et est également significative pour l’évaluation de réponse de cellule T pendant la maladie infectieuse et l’immunothérapie de tumeur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le principal complexe d’histocompatibilité (MHC) existe chez tous les vertébrés et est un ensemble de gènes qui détermine l’immunité à médiatté cellulaire contre les pathogènes infectieux. La classe I du MHC présente des peptides endogènes, tels que des composants viraux produits lors de l’infection virale, aux récepteurs des lymphocytes T (TCR) à la surface des lymphocytes CD8+ T pour jouer le rôle de médiateur de l’immunité cellulaire et participer à la régulationimmunitaire 1. Une étude structurale du MHC I liant aux peptides fournit des informations concernant les motifs de liaison peptidique et les caractéristiques de présentation par les molécules du MHC I, qui joue un rôle vital dans l’évaluation des réponses immunitaires deslymphocytes T CD8 + T et le développement du vaccin.

Depuis la première cristallisation et la détermination structurale du MHC I moléculaire par Bjorkman et coll.2, l’analyse de la structure cristalline des molécules du MHC I a grandement favorisé la compréhension de la façon dont les peptides se lient aux molécules du MHC I, et aide à comprendre l’interaction des chaînes légères avec les chaînes lourdes et les peptides. Une série d’études de suivi ont indiqué que bien que les gènes codant la chaîne lumineuse ne soient pas associés au MHC, la chaîne lumineuse est une protéine clé pour l’assemblage des molécules du MHC I3,4. Il interagit avec les trois domaines des molécules de classe I du MHC sur plusieurs surfaces. Lorsque la chaîne de lumière est absente, les molécules de classe I du MHC ne peuvent pas être correctement exprimées à la surface des cellules présentant des antigènes et ne peuvent pas interagir avec le TCR pour exercer leurs fonctions immunologiques.

Le MHC I est composé d’une chaîne lourde (chaîne H) et d’une chaîne légère (c.-à-d. β2microglobulines (β2m)), et est assemblé par liaison à un peptideapproprié 5. Le segment extracellulaire de la chaîne H se compose de domaines α1, α2 et α36. Les domaines α1 et α2 forment la rainure de liaison peptidique (PBG). La chaîne β2m agit comme une sous-unité structurelle du complexe d’assemblage du MHC I, stabilisant la conformation du complexe, et est un chaperon moléculaire pour le pliage de la chaîne MHC I H7,8,9. Une série d’études ont montré que le MHC I H s’enchaîne chez divers mammifères tels que la chauve-souris (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10, rhésus macaque (Primates) (Mamu-B *17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, souris (Rodentia) (H-2Kd)14,15, chien (Carnivora) (DLA-88*50801)16, bovins (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 et équidés (Periss eqca-N*00602 et Eqca-N*00601)18 peuvent se combiner avec des β heterologousde 2m (tableau 1). Ces molécules hybrides sont souvent utilisées dans des études structurelles et fonctionnelles. Cependant, la méthodologie pour l’étude fonctionnelle et structurale du MHC I hybride avec des β2m n’est pas encore résumée. Pendant ce temps, la base structurelle de l’βde 2m entre les différents taxons reste incertaine.

Dans ce cas, la procédure d’expression, de refolding, de cristallisation, de collecte de données cristallines et de détermination de la structure est résumée. En outre, les substitutions potentielles de β2m de différentes espèces sont analysées en comparant la conformation structurelle du MHC I stabilisée par des β homologues et héterologiques de2m. Ces méthodes seront utiles pour poursuivre l’étude structurale du MHC I et l’évaluation de la réponse immunitaire des lymphocytes T CD8+ T dans le cancer et les maladies infectieuses.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. La préparation de l’expression construit

  1. Récupérer les séquences des gènes de classe I du MHC (y compris les gènes prévus) à partir des chauves-souris de la base de données NCBI.
  2. Récupérez des séquences de chaînes lourdes MHC I plus élevées à partir de la Base de données sur l’immunomorphisme (DPI) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) et de la base de données UniProt (www.uniprot.org).
  3. Pour obtenir des complexes solubles de MHC, mutagenize les séquences pour enlever les régions cytosolic et transmembrane.
  4. Cloner les gènes codant les ectodomains de la chauve-souris Ptal-N*01:01 (GenBank no. KT98792919) (résidus 1-277) et chauve-souris β2m (GenBank no. XP_006920478.1) (résidus 1-98) dans les vecteurs pET-28a (Novagen, Beijing, Chine), respectivement.
  5. Insérer les séquences optimisées (pour Escherichia coli)ont été insérées entre les sites NcoI et EcoR1 d’un vecteur pET-28a modifié.
  6. Construire des βplasmidesd’expression de 2 m comme décrit précédemment20.

2. Synthèse peptidique

  1. Prédiction peptides
    1. Comme décrit précédemment10, pour dépister les peptides qui peuvent se lier à Ptal-N *01:01, prédire peptides candidats en utilisant les organes protéiques des virus liés aux chauves-souris virus hendra virus (HeV). Pour obtenir des peptides à haute affinité basés sur le modèle structurel du serveur en ligne, NetMHCpan 4.0 serveur (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 et Rosetta FlexPepDock22 prédit une liaison potentielle dans la fraction peptidique sélectionnée. En outre, d’autres logiciels et bases de données, y compris BIMAS, l’Immune Epitope Database (IEDB), NetCTL 1.2, et SYFPEITHI peuvent également être utilisés, tous intégrant la prédiction du peptide-MHC classe I affinité contraignante, transporteur associé à l’efficacité du transport antigène (TAP), protéasomal C-terminal clivage et la mi-temps de dissociation du peptide-HLA molécules de classe I dans leurs readouts.
    2. Pour prédire les peptides haute liaison, utilisez à la fois le serveur NetMHCpan et Rosetta FlexPepDock.
      REMARQUE : Malheureusement, ni l’une ni l’autre des prédictions produites ne correspondaient aux données expérimentales. Cela peut indiquer que les prédictions actuelles du peptide liant le MHC ne convenaient pas aux mammifères non humains et non souris comme les chauves-souris, qui peuvent avoir une autre façon de se lier au peptide. Par conséquent, nous devons combiner divers logiciels de prédiction et des résultats expérimentaux pour une analyse complète afin d’obtenir des peptides d’affinité élevée.
  2. Préparation et conservation des peptides
    1. Plutôt que de générer des peptides personnalisés, utilisez des fournisseurs de services spécialisés. Achetez tous les peptides commercialement suivant les outils de prédiction peptidique, qui ont un score de liaison plus élevé. La pureté peptidique a été déterminée pour être >95% par HPLC et spectrométrie de masse.
    2. Conserver tous les peptides achetés sous forme de poudre lyophilisé à −80 °C et dissoudre dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) avant utilisation.

3. Purification des organismes d’inclusion

  1. Transformation de E. coli
    1. Transformer 10 ng de plasmide contenant la chauve-souris MHC I Ptal-N*01:01 H chaîne, ou l’homme β2m ou chauve-souris β2m en 100 μL de BL21(DE3) E. coli. Baigner dans la glace pendant 30 min.
    2. Choc thermique à 42 °C pendant 90 s, suivi d’un bain dans la glace pendant 2 min.
    3. Ajouter 800 μL de bouillon de lysogène (LB : extrait de levure, tryptone et NaCl; voir la table des matériaux)à l’étape 3.1.2 et secouer à 200 rotations par minute (régime) sur une plate-forme de basculement à 37 °C pendant 20 min.
    4. Appliquer 100 μL de suspension bactérienne sur la plaque contenant la résistance aux antibiotiques correspondante (ampicilline : 100 ng/mL), qui sont identiques aux constructions précédentes.
  2. Cultures inoculculaires
    1. Choisissez un clone bactérien récemment transformé en 3 mL de LB avec milieu antibiotique (ampicilline : 100 ng/mL) et culture à 37 °C, tout en secouant à 200 rpm sur une plate-forme de basculement pour activer les bactéries. Les cultures peuvent être inoculées tard dans la nuit, pour être prêtes pour l’induction le lendemain matin.
    2. Une nuit à l’avance, transférer 500 μL du stock bactérien activé dans 50 mL de LB avec un milieu antibiotique (ampicilline : 100 ng/mL) et incuber pendant la nuit à 37 °C, en secouant à 200 rpm. Pour plus de commodité lors de la préparation de l’inoculate suivant, congeler le reste du stock bactérien activé en aliquots de 1 mL (500 μL de culture avec 500 μL de 40% de glycérol) à −80 °C jusqu’à ce que la prochaine préparation soit nécessaire.
    3. Pour générer de grandes quantités de protéines recombinantes, transférer la préparation bactérienne en 2 L de LB avec un milieu antibiotique (ampicilline: 100 ng/mL) à un rapport de 1:100, incuber à 37 °C tout en secouant à 200 rpm. Culture jusqu’à ce qu’une absorption de 0,6 à 600 nm soit atteinte. Ajouter 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (varier la concentration d’IPTG pour différents MHCs, la plupart du temps entre 0,1 mM-1 mM) à la fiole pour l’induction de l’expression des protéines.
  3. Bactéries de récolte
    1. Transférer les bactéries dans des bouteilles de centrifugeuses et une centrifugeuse à 5000 x g pendant 20 min à 4 °C. Toutes les étapes doivent désormais être effectuées à 4 °C.
    2. Resuspendez les bactéries dans 60 mL de saline tampon de phosphate (PBS) et libérez la protéine recombinante exprimée par perturbateur cellulaire ultrasonique.
      NOTE: En général, le programme que nous avons mis sur cette machine est ultrasonique 6S, intervalle 12S, 300 W, 99 fois).
  4. Purification des organismes d’inclusion
    1. Centrifugeuse la suspension bactérienne sonique à 12.000 x g pendant 30 min. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans un volume approprié de tampon de lavage (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Répétez ce processus une fois de plus.
    2. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 à 20 min. Jetez le supernatant et resuspendez les corps d’inclusion dans le tampon de resuspension (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Supprimez un échantillon de 20 μL (organismes d’inclusion dans le tampon de resuspension) pour SDS-PAGE afin de tester la pureté des corps d’inclusion.
    3. Centrifugeuse le reste de la préparation à 12.000 x g pendant 10-20 min. Jeter le surnatant. Pesez la pastille contenant les corps d’inclusion et ajoutez le tampon de dissolution (6 M Gua-HCl, 10% glycérine, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) à une concentration finale de 30 mg/mL. Remuer lentement à l’aide d’un agitateur magnétique à 4 °C jusqu’à ce que les corps d’inclusion soient dissous dans le tampon de dissolution.
    4. Centrifugeuse 12 000 x g pendant 10 à 20 min. Jeter les précipités. Conserver les corps d’inclusion à −20 °C ou −80 °C.
      REMARQUE : Avant de procéder à la purification des organismes d’inclusion, confirmez que l’induction et l’expression des protéines recombinantes ont été couronnées de succès. Exécuter des échantillons de chaque culture (prélevés avant et après l’induction de l’IPTG) sur un gel protéique; 15 % SDS-PAGE (gomme concentrée SDS-PAGE : H2O, 30 % acrylamide, 1 M Tris-HCl pH 6,8, 10 % SDS, 10 % APS et TEMED; Gel de séparation SDS-PAGE : H2O, 30% acrylamide, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS et TEMED; voir la Table des Matériaux ) pour les β2m, 10% SDS-PAGE pour la chaîne H.

4. Refolding du complexe de MHC

REMARQUE : L’efficacité des corps d’inclusion refolded affectera le rendement des protéines obtenues. Le pliage est en concurrence avec la polymérisation, de sorte qu’il est généralement admis que le repliement à de faibles concentrations de protéines est la méthode la plus réussie. Dans cet article, la concentration des corps d’inclusion est de 30 mg/mL.

  1. Préparez le refolding buffer.
    1. Varier la composition du tampon de refolding en fonction de la protéine. Par exemple, le pH, la résistance ionique, les conditions de redox et la présence de ligands affecteront les résultats de refolding. Le plus commun est d’utiliser des tampons à base de Tris ou HEPES à un pH neutre avec une concentration de NaCl de 50-500 mM, mais cela dépend également de la protéine cible. Ce qui suit est la formule tampon de refolding utilisée dans cet article.
    2. Préparer le tampon pliant avec 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-arginine, 2 mM EDTA-2Na.
    3. Refroidir le tampon à 4 °C dans un flacon de 250 à 300 mL, puis ajouter 5 mM de glutathion réduit (GSH) et 0,5 mM de glutathion oxydé (GSSG). Remuer lentement à l’aide d’un agitateur magnétique à 4 °C pendant encore 10 à 20 minutes avant d’ajouter les corps d’inclusion et les peptides.
  2. Injection et dilution de la chaîne MHC H et β2m
    REMARQUE : La température à laquelle le refolding est effectué peut varier, bien que généralement, afin de minimiser l’agrégation, 4 °C est le meilleur. Nous utilisons la dilution pour déplier les protéines.
    1. À l’aide d’une aiguille d’une seringue de 1 mL, injecter 1 mL de corps d’inclusion hβ2m ou des corps d’inclusion bβde 2m dans deux tampons de relecture (1 litre chacun), respectivement. Injecter près de la tige en remuant vigoureusement rotative pour obtenir une dilution rapide et efficace. β2m se refolds relativement facile et reste stable même en l’absence de la chaîne H.
    2. Après que le β2m a été dissous dans la solution de refolding, dissoudre des peptides (5 mg/mL) dans DMSO et injecter rapidement 200 μL dans la solution de refolding. Remuer lentement pendant 10-20 min avant d’ajouter la chaîne H.
    3. Injecter la chaîne H avec la même procédure décrite ci-dessus β2m. La chaîne H est très instable; par conséquent, l’ordre d’injection est très important. Injecter 3 mL de corps d’inclusion de la chaîne H dans deux tampons de refolding différents (1 litre chacun) avec hβ2m ou bβ2m, respectivement. L’injection consécutive de petits aliquots au lieu de l’application unique de la quantité entière de protéines augmente le rendement du MHC refolded. Laisser le refolding se dérouler à 4 °C pendant 8-10 h.
  3. Concentration de protéines refolded
    1. Utilisez l’ultrafiltration dans une chambre pressurisée avec une membrane MMCO de 10 kDa pour la concentration des protéines qui se déploient. Cette méthode est pratique et peut être combinée avec l’échange tampon. Ajouter le tampon d’échange (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) à la chambre et se concentrer sur un volume final de 30-50 mL.
    2. Transférer la solution de refolding dans un tube de centrifugeuse, tourner à 12.000 x g pendant 15 min à 4 °C pour enlever les précipités.
    3. Transférer soigneusement le supernatant et se concentrer davantage sur un volume final d’environ 1 mL.
    4. Centrifugeuse à 12 000 xg pendant 10 à 20 min. Transférer le supernatant dans un tube stérile et purifier les protéines à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille de 10/300 GL.
    5. Prélever les échantillons au sommet et les analyser à l’aide de SDS-PAGE (gel polyacrylamide à 15 %).
    6. Recueillir le pic complexe du MHC et se concentrer jusqu’à une concentration finale de 15 mg/mL.
    7. Diluer le complexe à 7,5 mg/mL et 15 mg/mL pour la cristallisation.

5. Cristallisation, collecte et traitement des données

  1. Effectuer la cristallisation du MHC et du peptide complexes à l’aide de la technique de diffusion de vapeur de goutte assise.
  2. Filtrez les complexes Ptal-N*01:01/peptide avec des kits de cristal commerciaux (p. ex., kit Crystal Screen I/II, kit index, kit PEGIon I/II et kit PEGRx).
  3. Sceller la solution qui en résulte et l’équilibrer contre 100 μL de solution de réservoir à 4 ou 18 °C.
  4. Observez la croissance cristalline de la culture pendant 3 jours, 1 semaine, 2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois. Utilisez un microscope pour voir si chaque goutte de cristal a des cristaux.
    REMARQUE : Des cristaux Ptal-N*01:01/HeV1 (bβ2m) ont été observés dans 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) et 25 % (w/v) polyéthylène glycol 3 350 à une concentration de 7,5 mg/mL. Ptal-N*01:01/HeV1 (hβ2m) cristaux ont été observés dans 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2% w/v polyéthylène glycol 3350 à une concentration de 7,5 mg/mL.
  5. Pour une protection cryogénique, transférer les cristaux dans une solution de stockage contenant 20% de glycérol, puis refroidir rapidement dans un flux d’azote gazeux de 100 K.
  6. Recueillir des données sur la diffraction des rayons X à partir de la ligne de faisceau BL19U de l’installation de rayonnement synchrotron de Shanghai (Shanghai, Chine).

6. Détermination et analyses de la structure

  1. Avec des données structurelles haute résolution, traiter et l’échelle de la force de la collection en utilisant le programme Denzo et le logiciel HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
  2. Après avoir choisi un meilleur modèle initial dans la Banque de données protéiques (PDB), déterminer les structures utilisant le remplacement moléculaire avec le programme Phaser MR en CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Le modèle utilisé était les coordonnées de structure avec protein data bank (PDB) code 5F1I.
  3. Utilisez le modèle de rayons X raffiné pour le raffinement initial des articulations. Utilisez phenix affiner seul et les modes communs pour la radiographie seule et le neutron commun et le raffinement des rayons X, respectivement.
  4. Après chaque tour de raffinement, vérifiez manuellement le modèle par rapport à Fo − Fc et 2Fo − Fc cartes de densité nucléaire positive dans Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Cela facilite le bon placement des eaux et de certains atomes D. Toutes les figures des structures ont été créées par PyMOL (http://www.pymol.org/).

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Results

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Des travaux antérieurs ont rapporté que le peptide HeV1 (DFANTFLP) dérivé de HeV a été présenté par Ptal-N*01:0110,19. Dans ce cas, la capacité de liaison de ce peptide à Ptal-N*01:01 avec une chauve-souris homologue β2m (bβ2m) e...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La construction d’un complexe protéique hybride par substitution héterologique de différents taxons est une stratégie commune pour les investigations fonctionnelles et structurelles lorsque le complexe homologue n’est pas disponible, comme dans le MHC I et ses ligands. Toutefois, il y a peu de résumé s’agissant de la méthodologie et de la technologie. Dans ce cas, la structure de la chauve-souris MHC I, Ptal-N*01:01, stabilisée par bβ2m ou hβ2m a été analysée. Les acides aminés clés de βliaison...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par le fonds ouvert du laboratoire clé d’État de la biotechnologie pharmaceutique, Université de Nan-jing, Chine (Subvention no. KF-GN-201905), la National Natural Science Foundation of China (subventions 81971501). William J. Liu est soutenu par l’Excellent Young Scientist Program de la NSFC (81822040) et beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 kDa MMCO membraneMerck milliporePLGC07610
30 % AcrylamideLABLEADA3291-500ml*5
5&fois ; Protein SDS LoadingNovoproteinPM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoffMerck milliporeUFC901096
AmpicillineInalco1758-9314
APSSigmaA3678-100G
soucheTIANGENCB105-02
DMSOMP219605580Portez des gants appropriés et une protection oculaire/faciale. En cas de contact avec les yeux, rincer immédiatement et abondamment à l’eau et consulter un médecin.
DTTSolarbioD1070doivent être portés et utilisés dans une cuisine ventilée. En cas de contact avec les yeux, rincer immédiatement et abondamment à l’eau et consulter un médecin.
EDTA-2NaKeyGEN BioTECHKGT515500
GlycérineHUSHI10010618
GSHAmresco0399-250G
GSSGAmresco0524-100G
Chlorhydrate de guanidineAmrescoE424-5KG
h&beta ; 2mnotre laboratoireZhang, S. et al. Base structurelle de la présentation inter-allèle par HLA-A*0301 et HLA-A*1101 révélée par deux complexes peptidiques dérivés du VIH. Mol Immunol. 49 (1) et 2), 395 et 401 (2011).
IPTGInalco1758-1400
Chlorhydrate de L-arginineAmresco0877-5KG
NaClSolarbioS8210
Marqueur protéiqueFermentas26614
SDSBoao Rui JingA112130
Superdex Increase 200 10/300 GLGE Healthcare28990944
TEMEDThermo17919Les gants et les lunettes de protection doivent être portés et utilisés dans une cuisine ventilée.
Tris-HClAmresco0497-5KG
Triton X-100BiorulerRH30056-100mL
TryptoneOxoidLP0042
Extrait de levureOxoid LP0021
Les gants et les lunettes de protection

References

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