Prédire l’amputation à l’aide de cellules progénitrices mononucléaires circulantes locales chez les patients traités par angioplastie atteints d’ischémie des membres critiques

Résumé

L’amputation de membre inférieur peut se produire même après angioplastie des vaisseaux obstrués dans l’ischémie critique de membre (CLI). Les cellules progénitrices mononucléaires (PMC) reflètent la réparation vasculaire. Le protocole actuel décrit la quantification des MPCs de la circulation près de l’angioplastie, et sa relation avec le dysfonctionnement endothélial et la prédiction de l’amputation de membre inférieur.

Résumé

L’ischémie critique de membre (CLI) représente un stade avancé de la maladie artérielle périphérique. L’angioplastie améliore le flux sanguin vers le membre inférieur; cependant, quelques patients progressent irréversiblement à l’amputation de membre. L’étendue des dommages vasculaires et les mécanismes de réparation vasculaire sont des facteurs affectant des résultats post-angioplastie. Les cellules progénitrices mononucléaires (PMC) sont réactives aux dommages vasculaires et à la réparation, avec la capacité de refléter des maladies vasculaires. Le présent protocole décrit la quantification des MPCs obtenus de la circulation sanguine du navire près du site d’angioplastie, aussi bien que sa relation avec le dysfonctionnement endothélial et sa capacité prédictive pour l’amputation de membre dans les 30 prochains jours après angioplastie dans les patients présentant CLI.

Introduction

La maladie artérielle périphérique (PAD) est caractérisée par une obstruction vasculaire chronique et progressive avec limitation de l’approvisionnement en sang¹. À l’échelle mondiale, le PAD des membres inférieurs touche environ 10 % de la population âgée, tandis que jusqu’à 7 % de ces cas sont soumis à l’amputation des^{membres 2,3}.

Critical Limb Ischemia (CLI) représente la présentation la plus sérieuse de PAD¹. Les patients éprouvent habituellement la douleur au repos, aux ulcères, ou à la gangrène attribuables aux artères occluses ; tandis que le pronostic clinique est défavorable et marqué par un risque de 30% d’amputation et de mortalité de membre pendant 1^{an 3,4,5.}

L’angioplastie est une procédure endovasculaire mini-invasive qui peut rétablir le flux sanguin vers le membre inférieur chez les patients atteints de CLI; cependant, quelques patients exigeront inévitablement l’amputation majeure de membre, même après thérapie d’angioplastie^1,5. L’identification tôt des résultats défavorables après angioplastie est tout à fait valable, due à la possibilité de l’application de thérapie.

Les facteurs de risque traditionnels peuvent fournir une capacité prédictive limitée pour l’amputation majeure de membre dans les patients présentant CLI subissant l’angioplastie^6. Les biomarqueurs orientés vers la pathophysiologie représentent de nouvelles méthodes avec des applications cliniques potentielles, qui peuvent résulter spécifiquement utiles dans les maladies liées aux dommages^{vasculaires 7.} Aujourd’hui, la participation des populations cellulaires propriétaires de propriétés de réparation endothéliale, sur le site de la plaque athéroclérotique, a été de plus en^{plus reconnue 8,9}.

Les cellules progénitrices mononucléaires (PMC) sont dérivées de la moelle osseuse et possèdent des caractéristiques structurelles et fonctionnelles des cellules souches ayant des capacités régénératrices vasculaires. En raison de la capacité de MPC à proliférer, migrer et montrer l’adhérence vasculaire ; ces cellules sont devenues de bons candidats pour refléter la réparation endothéliale en réponse à l’ischémie^10,11,12. En outre, l’intérêt continu pour les mécanismes sous-jacents aux lésions vasculaires a motivé l’exploration du rôle pronostique des biomarqueurs locaux, puisqu’ils sont considérés comme refléter les dommages vasculaires^{et la réparation 7,13,14}.

Le but de la présente étude est de décrire comment déterminer la quantité de MPCs qui circulent près de l’obstruction vasculaire dans les patients présentant CLI subissant l’angioplastie ; et comment évaluer la relation entre les CPM avec des indicateurs de dysfonctionnement endothélial et d’amputation des membres.

Comparé au pronostic basé sur des comorbidités et des dispositifs vasculaires intrinsèques, la quantité de MPCs locaux montrent la capacité spécifique de prévoir des résultats cliniques concernant le dysfonctionnement endothélial et l’amputation de membre. Uniformément, quelques études ont décrit le rôle pronostique des biomarqueurs semblables pendant l’évaluation des patients présentant PAD^15,16.

Basé sur des résultats^{précédents 7,}la méthode décrite ici peut être utile pour une identification tôt de la population à risque des résultats vasculaires défavorables dans plusieurs arrangements cliniques, tels que l’ischémie inférieure de membre et de coronaire, course, vascularite, thrombose veineuse et d’autres impliquant des dommages vasculaires et la réparation.

Protocole

Le comité d’éthique de la recherche institutionnelle du Centro Médico Nacional « 20 de Noviembre » ISSSTE a approuvé ce protocole prospectif, tous les patients inscrits ont fourni un consentement écrit éclairé.

1. Évaluation du bloc vasculaire du membre inférieur, de l’échantillonnage sanguin et de l’angioplastie de ballon

REMARQUE : L’échantillon d’étude utilisé pour cette expérience comprenait 20 patients diabétiques, âgés de 68 ans et 10 sur 20 étaient des hommes. La moitié de l’échantillon étaient des fumeurs et les comorbidités les plus répandues étaient le diabète sucré de type 2, l’hypertension artérielle systémique et/ou la dyslipidémie. L’échantillon devait être normalisé pour les morbidités liées à l’âge, au sexe et à la comorbidité. Il n’a pas été possible d’écarter les biais possibles en raison de l’influence clinique et démographique sur la relation entre les CPM et l’IPC.

1. Évaluer la gravité clinique de l’ischémie des membres selon la classification^{13 de} Rutherford (voir tableau supplémentaire 1).
2. Effectuer l’angiographie des membres inférieurs, l’échantillonnage sanguin et l’angioplastie ballon.
   1. Utilisez des médicaments anticoagulants et anesthésiques avant la chirurgie.
   2. Placez une aiguille de 18 G dans le vaisseau sanguin à l’emplacement de l’aine sélectionné.
   3. Placez un introduction et avancez un fil de guidage flexible. Ensuite, le guide initial est encore modifié pour un introducer 6 Fr.
   4. Utiliser l’injection périodique de supports de contraste ou de CO_{2 sous} guide fluoroscopique pour identifier la trajectoire des artères et les sites vasculaires bloqués (figure 1).
      REMARQUE : Utilisez des supports de contraste 40 cc, dilués 1:1 dans 0,9 % salins, ou CO₂ à 10 à 20 mL par tir à une pression de 12 psi.
   5. Introduisez deux fils de guidage de navigation 0.014 Fr et deux fils de guidage de soutien 0.014 Fr dans le navire et avancez-les jusqu’au site bloqué.
      REMARQUE: Deux fils de guidage 0.014 Fr (260 cm de long) sont utilisés pour la navigation et deux fils de guidage 0.014 Fr (260 cm de long) sont utilisés pour le support, au cours d’une seule procédure.
   6. Introduire 5 Cathéters Fr et 3 Fr séquentiellement et recueillir 10 mL de sang à partir du site le plus proche de l’obstruction vasculaire. Maintenez des échantillons de sang sur la glace.
      REMARQUE : Les tailles des cathéters peuvent être de 5 Fr et 3 Fr, et elles sont modifiées pendant la procédure.
   7. Avancez à nouveau un fil de guidage. Ensuite, introduire un cathéter ballon angioplastie, qui contient un ballon gonflable situé à l’extrémité du cathéter. Avancez le cathéter ballon angioplastie et placez le ballon directement sur le site de la lésion. Effectuez l’angioplastie en gonflant le ballon contre la plaque de blocage située à la paroi vasculaire. Vérifiez la restauration du flux sanguin.
      REMARQUE : Un stent peut être placé dans la zone bloquée pour aider à garder l’artère ouverte après l’intervention.
   8. Introduire un cathéter et avancer jusqu’au site le plus proche du bloc vasculaire. Recueillir 10 mL de sang à 30 minutes d’intervalle après l’angioplastie. Maintenez des échantillons de sang sur la glace.
      REMARQUE : Il est recommandé de prélever des échantillons de sang avant et après l’angioplastie afin d’évaluer davantage l’influence de l’angioplastie sur le nombre de MPC.
   9. Retirez tous les fils sous guidage fluoroscopique.
   10. Fournir des procédures de soins postopératoires, y compris la thérapie anti-coagulation à l’aide d’enoxaparine à 1 mg/kg sous-cutané toutes les 12 h, aspirine 100 mg, statine, et analgésie. Compresser sur le site de la ponction vasculaire pendant 24 h.

2. Quantification des cellules progénitrices mononucléaires en circulation (CPM) (Figure 2)

1. Dans un nouveau tube conique de 15 mL, transférer 6 mL du sang recueilli et diluer 1:1 (v/v) avec PBS.
   REMARQUE : Traiter le sang dans les 1 h de la collecte.
2. Préparez-vous à la séparation du gradient de densité, en ajoutant 2 mL de gradient de densité moyen à 3 tubes à essai chacun. Ensuite, ajouter 3 aliquots de volume égal du sang dilué dans chaque tube à essai.
   REMARQUE : Ne dépassez pas les trois quarts de la capacité maximale du tube à essai.
3. Centrifugeuse à 1 800 x g pendant 30 min à 4 °C. Recueillir la couche d’interface présente comme un anneau à l’aide d’une pipette, et transférer dans un nouveau tube. Ajouter 2 mL de PBS et tourner à 1 800 x g pendant 6 min à 4 °C. Enregistrez la pastille car cela contiendra des CPM.
4. Lavez la pastille contenant des MPCs avec du PBS par centrifugation tel que décrit à l’étape 2.3. Utilisez du PBS frais pour chaque lavage et faites tourner à 1 800 x g pendant 2 min à 4 °C. Répétez le processus pendant 6 fois.
5. Après le dernier lavage, utilisez 1 mL de PBS pour réutiliser la pastille cellulaire. Diluer 20 μL de la suspension cellulaire avec 20 μL de 0,4% de bleu trypan, 1:1 (v/v). Utilisez 10 μL de cette suspension cellulaire pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et d’un microscope léger.
6. Aliquot 1 x 10⁶ MPCs dans des tubes de cytométrie d’écoulement précédemment étiquetés 5 mL.
   REMARQUE : Préparez des anticorps de contrôle correspondants appariés à l’isotype.
7. Centrifugeuse les tubes à 1 800 x g pendant 6 min à 4 °C. Aspirer et jeter le surnatant.
8. Diluer l’anticorps primaire dans 100 μL de solution d’incubation d’anticorps [1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM, BSA 0,05%] et ajouter au tube. Resuspendez pendant 10 s et incubez pendant 20 min à 4 °C, dans l’obscurité.
   REMARQUE : Les concentrations finales d’anticorps primaires utilisés dans le présent protocole étaient CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50. Le protocole peut être arrêté à cette étape en fixant des lymphocytes dans le paraformaldéhyde de 4% dans PBS et en stockant des échantillons jusqu’à 24 h à 4 °C.
9. Centrifugeuse à 1 800 x g pendant 2 min à 4 °C et jeter le supernatant. Resuspendez en 500 μL de 1x PBS, pH 7.4, EDTA 2 mM.
10. Effectuez l’analyse de cytométrie de flux.
    1. Configurez l’arrière-plan avec des anticorps de contrôle appariés à l’isotype. Puis, à la parcelle FSC/SSC, certains lymphocytes se propagent, essayant d’exclure les débris cellulaires, les granulocytes résiduels et d’autres particules. Cette distribution est considérée comme 100%.
       REMARQUE : Les lymphocytes se propagent habituellement dans la région inférieure gauche de la parcelle.
    2. Utilisez une porte avec immunophénotype commun contenant un nombre élevé de cellules CD45⁺ et CD34⁺. Ensuite, sélectionnez pour les immunophénotypes double positif à l’aide de la porte qui a précédemment identifié CD45⁺, CD34⁺, et en ajoutant soit KDR (VEGFR-2)⁺, CD133⁺ ou CD184⁺. Identifier les sous-populations de PMC par leurs marqueurs spécifiques de surface cellulaire. Indiquez le pourcentage d’événements fermés.
11. Identifier les principales sous-populations de PMC. Dans la présente étude, les immunophénotypes analysés étaient CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺; CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133^{+ et} CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7,17.
    REMARQUE : Ces marqueurs de surface cellulaire ont été utilisés pour l’étude : CD45 (lymphocytes), CD34 (cellules endothéliales et/ou vasculaires), KDR (VEGFR-2) (marqueur membranaire des cellules endothéliales), CD133 (cellules progénitrices endothéliales) et CD184 (cellules souches hématopoïétiques et cellules endothéliales).

3. Relation des CPM avec modification de la fonction endothéliale et du test hémodynamique (FMD)

1. Déterminer la dilatation par céphalo-céphalie (FIÈVRE APF), avant et après l’angioplastie.
   1. Utilisez un transducteur linéaire vasculaire pour mesurer le diamètre de l’artère brachiale.
   2. Placez le brassard du sphygmomanomètre au-dessus du site de mesure dans l’avant-bras et insufflez à 50 mmHg au-dessus de la pression artérielle systolique pendant 5 min et dégonflez.
   3. Déterminez à nouveau le diamètre de l’artère brachiale dans les 60 s suivant. Utilisez l’équation ci-dessous pour estimer la fièvre aphteuse.
      REMARQUE : Calculer le degré de dilatation à l’aide de l’équation (%) = (diamètre maximum après ischémie transitoire - diamètre basal) × 100 / diamètre basal.
2. Corréler le nombre de CPM avec la valeur de la fièvre aphteuse de base et le delta post-angioplastie de la fièvre aphteuse.

4. Capacité pronostique des MPCs pour l’amputation de membre

1. Planifiez des rendez-vous médicaux périodiques après l’angioplastie du ballon et la sortie du patient, afin d’évaluer la qualité du flux sanguin vers le membre inférieur.
2. Évaluer la gravité clinique de l’ischémie des membres à 2 semaines après l’angioplastie. Évaluer la résolution des douleurs de repos, l’ischémie inférieure, et la préservation d’un pied fonctionnel, selon la classification Rutherford¹³.
3. Comparez la sévérité clinique de l’ischémie de membre, à la ligne de base par rapport au suivi. Identifier les cas nécessitant une amputation majeure due à des résultats défavorables.
4. Corréler le nombre de CPM avec la proportion de patients nécessitant une amputation majeure du membre inférieur.

Résultats

Des échantillons de sang provenant d’artères bloquées, sur le site traité pour angioplastie, ont été prélevés auprès de 20 patients diabétiques, âgés de 68 ans et 10 sur 20 étaient des hommes. La moitié de la population échantillonnée fumait. Les lésions vasculaires ont été principalement notées en tant que classe VI de Rutherford ; considérant que les patients présentaient une prévalence plus élevée de diabète sucré de type 2 (100 %), d’hypertension (70 %) dyslipidémie (55 %).

Un suivi cliniq...

Discussion

La collecte de sang à l’emplacement précis du bloc vasculaire peut montrer des difficultés techniques ; par conséquent, nous avons effectué la collecte de sang à proximité du bloc vasculaire. De même, la quantité de MPCs près de la plaque vasculaire semble être fortement dynamique et peut provenir des variations avant et après l’angioplastie. Selon nos observations, il est recommandé d’évaluer les changements de base et de post-angioplastie de 30 min dans le nombre de MPCs, puisqu’ils peuvent refléter plusieurs processus...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BSA	Roche	10735086001	l’albumine sérique bovine (BSA) comme agent tampon, stabilisant, étalon et pour le mélange.
Perles d’étalonnage	Miltenyi Biotec / MACS#	130-093-607	Les billes d’étalonnage MACQuant sont fournies dans une solution aqueuse contenant 0,05 % d’azoture de sodium. 3,5 ml pour un maximum de 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS#	130-080-801	Anticorps conjugués à la R-Phycoérythrine dans un tampon PBS/EDTA
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS#	130-103-798	Monoclonal, isotype recombinant humain IgG1, conjugué
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS#	130-093-601	Anticorps conjugué à la R-Phycoérythrine dans un tampon PBS/EDTA
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS#	130-081-001	Le clone d’anticorps monoclonal AC136 détecte un épitope de classe III du CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS#	130-092-880	Anticorps monoclonal CD45, tubes coniques conjugués humains
	Thermo SCIENTIFIC	#339651	Tubes à centrifuger coniques de 15 ml
Tubes de cytométrie	FALCON Corning Brand	#352052	Tube à fond rond en polystyrène de 5 ml. Style 12x75. Stérile.
EDTA	BIO-RAD#	161-0729	Métaux lourds, (comme Pb) < 10 ppm, Fe< 0,01 %, As< 1ppm, insolubles< 0,005
%Neubauer amélioré	Sans marque	Sans numéro de catalogue	Hémocytomètre pour le comptage des cellules. (plage 0,1000 mm, 0,0025 mm2)
K2 EDTA Tubes de prélèvement sanguin	BD Vacutainer	#367863	Tube vacutainer en plastique lilas (K2E) 10,8 mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Stérile et vérifié la présence d’endotoxines. Densité : 1.077± ; 0,001g/mL
Paraformaldéhyde	SIGMA-ALDRICH		Fixation d’échantillons biologiques, (poudre, 95 %)
Pipette de transfert 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	La pipette de transfert est un outil qui facilite le transfert de liquide avec une plus grande précision.
Tubes à essai	KIMBLE CHASE	45060 13100	Tubes à essai résistants à la chaleur. TAILLE/CAPUCHON 13 x 100 mm

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