Prédire l’amputation à l’aide de cellules progénitrices mononucléaires circulantes locales chez les patients traités par angioplastie atteints d’ischémie des membres critiques

Bien que l’angioplastie améliore la circulation sanguine dans l’ischémie critique d’un membre, certains patients progresseront toujours vers l’amputation d’un membre. Par rapport au pronostic basé sur les facteurs de risque traditionnels et les caractéristiques vasculaires intrinsèques, le nombre de MPC locaux peut être plus prédictif du résultat clinique, en ce qui concerne la dysfonction endothéliale et l’amputation d’un membre. Le nombre de MPC locales représente un indicateur prometteur du pronostic des événements vasculaires, tels que l’ischémie, les maladies cardiaques et l’ischémie des membres inférieurs, avec une application potentielle dans la stratification des risques et l’application de la prévention.

Eduardo Vera-Gomez, Alejandro Hernandez-Patricio, Carolina Aranda-Rodriguez, Juan Ariel Gutierrez-Buendia, Atzin Sua Ruiz-Hernandez, Mario Antonio Tellez-Gonzalez et Gabrielle Alexandra Dominguez-Perez feront la démonstration des procédures. Les titulaires d’un doctorat des laboratoires de métabolisme expérimental et de régénération tissulaire seront également Gabrielle Hernandez-De Rubin et Oscar Antonio Loman-Zuniga. Et ceux-ci du service de chirurgie vasculaire.

Pour déterminer la DFM avant et après l’angioplastie, utilisez un transducteur linéaire vasculaire pour mesurer le diamètre de l’artère brachiale du patient. Ensuite, placez le brassard d’un tensiomètre au-dessus du site de mesure dans l’avant-bras, et insufflez le brassard à 50 millimètres de mercure au-dessus de la pression artérielle systolique pendant cinq minutes avant de dégonfler. Dans les 60 secondes suivant le dégonflage, mesurez à nouveau le diamètre de l’artère brachiale et utilisez l’équation pour estimer la DFM.

Pour évaluer la gravité clinique de l’ischémie des membres, selon la classification de Rutherford, placez une aiguille de calibre 18 dans le vaisseau sanguin au site de l’aine sélectionné et placez un introducteur sur l’aiguille. Insérez un fil-guide flexible dans l’introducteur et remplacez le guide par un six introducteurs français. À l’aide d’un guidage fluoroscopique, injectez un produit de contraste pour identifier la trajectoire de l’artère et les sites vasculaires bloqués.

Introduire deux fils-guides de navigation français de 0,014 et deux fils-guides de soutien français de 0,014 dans le navire, et avancer les fils de guidage jusqu’au site bloqué. Ensuite, introduisez un cathéter français 5, puis un cathéter français 3, et prélevez 10 millilitres de sang à l’endroit le plus proche de l’obstruction vasculaire. Placez l’échantillon sur de la glace et avancez à nouveau un fil-guide.

Lorsque le fil-guide est en place, introduisez un cathéter à ballonnet d’angioplastie, contenant un ballon gonflable situé à l’extrémité du cathéter, et avancez le cathéter à ballonnet d’angioplastie jusqu’au site de la lésion. Gonflez le ballon contre la plaque de blocage, située au niveau de la paroi vasculaire, et vérifiez le rétablissement du flux sanguin. 30 minutes après avoir effectué l’angioplastie, avancez un cathéter jusqu’au site le plus proche du bloc vasculaire et prélevez 10 millilitres de sang.

Ensuite, retirez tous les fils-guides et fournissez les soins postopératoires appropriés. Deux semaines après l’angioplastie, évaluer la gravité clinique de l’ischémie des membres, de la douleur au repos résolue, de l’ischémie inférieure et de la préservation fonctionnelle du pied, selon la classification de Rutherford, et identifier les cas nécessitant une amputation majeure en raison d’un résultat défavorable. Dans l’heure qui suit le prélèvement, transférez six millilitres de chaque échantillon de sang prélevé dans de nouveaux tubes de 15 millilitres et diluez les échantillons dans un rapport de un pour un dans le PBS.

Ajoutez deux millilitres de milieu à gradient de densité dans chacun des trois tubes à essai, et ajoutez trois aliquotes de volume égal de sang dilué dans chaque tube jusqu’à ce qu’il ne soit pas rempli aux trois quarts au plus. Séparez les cellules sanguines par centrifugation à gradient de densité et utilisez une pipette pour collecter les cellules de l’interface des couches résultantes. Tirez les cellules de chaque échantillon dans un seul tube de 15 millilitres et lavez chaque échantillon six fois, avec deux millilitres de PBS par lavage.

Après le dernier lavage, remettre en suspension le MPC contenant les pastilles dans un millilitre de PBS par échantillon pour le comptage, et ajouter une fois 10 aux six cellules par tube jusqu’au nombre approprié de tubes de cytométrie en flux de cinq millilitres par échantillon. Granulez les cellules par centrifugation, et remettez en suspension chaque échantillon cellulaire dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt pendant 10 secondes, avant d’incuber les cellules pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, utilisez des anticorps témoins isotypiques pour mettre en place les portes de diffusion directe et latérale appropriées pour l’analyse, et utilisez un tube contenant un grand nombre de cellules CD45 et CD34 positives pour bloquer les NPC.

Pour sélectionner des immunophénotypes doublement positifs, créez de nouvelles parcelles et identifiez les cellules KDR, CD133 et CD184 positives, CD34 positives, CD45 positives, puis identifiez les principales sous-populations de MPC. Le nombre de MPC peut alors être corrélé avec la valeur de base de la DFM, et le delta de la DFM après angioplastie, et la proportion de patients nécessitant une amputation majeure du membre inférieur. Dans cette analyse représentative, 30 jours après l’angioplastie des membres inférieurs, le nombre initial de CPM CD45 positifs, CD34 positifs et KDR positifs était négativement corrélé avec la DFM.

Alors que la variation des CPM CD45 positifs, CD34 positifs, CD133 positifs, CD184 positifs, après angioplastie, était significativement corrélée avec l’amélioration de la DFM. Une augmentation du nombre de base de MPC CD45 positifs, CD34 positifs, KDR positifs, ainsi qu’une réduction post-angioplastie des cellules MPC CD45 positives, CD34 positives, CD133 positives, CD184 positives, ont également été observées chez les patients, qui ont évolué vers l’amputation d’un membre.