Summary
Præsenteret her er en protokol til at studere koronar mikrocirkulation i levende murin hjertevæv ved ex vivo overvågning af arteriel perfusion tryk og flow, der opretholder trykket, samt vaskulære trækomponenter, herunder kapillær senge og pericytes, som septal arterie er cannulated og tryk.
Abstract
Koronararteriel tone sammen med åbningen eller lukningen af kapillærerne bestemmer stort set blodgennemstrømningen til kardiomyocytter ved konstant perfusionstryk. Det er dog svært at overvåge de dynamiske ændringer i kranspulsårerne og kapillærerne i hele hjertet, primært på grund af dets bevægelse og non-stop slå. Her beskriver vi en metode, der gør det muligt overvågning af arteriel perfusion sats, tryk og diameter ændringer i arterioler og kapillærer i musen højre ventrikulær papillær muskler. Musens septalarterie er cannulated og perfunderes ved et konstant flow eller tryk med den anden dynamisk målt. Efter perfusion med en fluorescerende mærket lectin (f.eks Alexa Fluor-488 eller -633 mærket Hvede-Germ Agglutinin, WGA), arterioler og kapillærer (og andre fartøjer) i højre ventrikel papillær muskel og septum kunne let afbildes. Ændringer i beholderdiameteren kan derefter måles i nærværelse af eller fravær af hjertesammentrækninger. Når genetisk kodede fluorescerende proteiner blev udtrykt, kunne specifikke træk overvåges. For eksempel blev pericytes visualiseret i musehjerter, der udtrykte NG2-DSRed. Denne metode har givet en nyttig platform til at studere de fysiologiske funktioner kapillær pericytes i hjertet. Det er også velegnet til at studere virkningen af reagenser på blodgennemstrømningen i hjertet ved at måle vaskulær / kapillær diameter og arterielt luminalt tryk samtidigt. Dette præparat, kombineret med en state-of-the-art optisk billeddannelse system, giver en mulighed for at studere blodgennemstrømningen og dens kontrol på cellulært og molekylært niveau i hjertet under nær-fysiologiske forhold.
Introduction
Passende regulering af koronartryk sikrer tilstrækkelig blodforsyning til hjertet til at opfylde dets metaboliske krav1. Det er dog først for nylig blevet klart, hvordan koronartryk-flow er dynamisk reguleret i hjertet, på trods af omfattende undersøgelser, der er blevet udført in vivo og in vitro i de sidste årtier. En af grundene er vanskeligheden ved at etablere en fysiologisk arbejdsmodel for sådanne undersøgelser på grund af hjertets konstante slag. Uanset hvad er der etableret en række metoder til observation af koronarmikrokar i levende væv eller dyr, men ingen af disse metoder var i stand til at opnå konstant / stabil fokus og målingerne af tryk, flow og mikrovaskulær diameter på samme tid2,3. Den direkte visualisering af koronararterielle mikrobeholdere i bankende hjerte blev introduceret for årtier siden4,3, men diametermålingerne i små fartøjer var udfordrende, og de specifikke funktioner i de mange specialiserede celletyper, der var forbundet med mikrocirkulationen, var lige så irriterende. Selv den stroboskopiske metode og det flydende objektive system kunne ikke give ovennævnte oplysninger samtidig5. Ikke desto mindre er der opnået en betydelig mængde værdifuld information ved hjælp af ovennævnte teknologier, som har hjulpet os med at forstå mere om reguleringen af koronar blodgennemstrømning6. Den metode, vi beskriver i dette papir, vil hjælpe en med at undersøge og forstå i detaljer, hvordan komponenter i kranspulsårerne, arterierne og mikrovasculaturen reagerer forskelligt på stimuleringer og metaboliske krav.
Den arbejdsmodel, vi etablerede for at forfølge disse undersøgelser, blev bygget på Westerhof et al.2'stidligere arbejde. Efter cannulation af septal arterie af musens hjerte, fysiologisk saltvand løsning blev brugt til at gennemgå, at arterien for at holde myocytter og andre komponenter i hjertevæv næret. Det arterielle perfusionstryk, strømmen og den vaskulære diameter blev overvåget blandt andre fysiologiske funktioner ved hjælp af passende fluorescerende indikatorer. Denne metode gør det muligt for os at visualisere koronar mikrovaskulær seng under fysiologisk tryk i levende væv og studere de cellulære mekanismer, der ligger til grund for mikrocirkulationsregulering for første gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al dyrepleje var i overensstemmelse med retningslinjerne fra University of Maryland Baltimore og Institutional Animal Care and Use Committee godkendte protokoller.
1. Udarbejdelse af løsningerne
BEMÆRK: Forbered løsninger på forhånd. Der anvendes to typer basisopløsninger i forsøgene: (1) fysiologiske saltvandsopløsninger (PSS) til superfusat i badet og (2) Tyrodes opløsninger til lumenperfusat. Kontinuerlig boblende med CO2 er nødvendig for at opretholde pH i PSS. HEPES-buffered Tyrode's løsning bruges i lumen i stedet for PSS for at undgå bobler går ind i fartøjerne, da bobler ville skade endotelceller7 og okkludere strømmen.
- PSS-løsning: Se formlen og sammensætningen af PSS-opløsningen i tabel 1. Lav 10 L Ca2+gratis og glukosefri PSS-lagerløsning, og opbevar ved stuetemperatur. 1 time før enhver procedure, tegne 1 L af bestanden opløsning og boble med 5% CO2 (74% N2 og 21% O2) for at holde pH-opløsning på ~ 7,4. Der tilsættes 1,8 g glucose og 1,8 mL CaCl2 (1 M lager)8.
BEMÆRK: Tilføj Ca2 + først efter boblende, når pH er ~ 7,4, ellers vil Ca2 + blive udfældet. - Tyrodes løsning: Se formlen og sammensætningen af Tyrodes opløsning i tabel 1. Opløsningen (0,22 μm) filtreres og opbevares ved 4 °C til fremtidig brug9.
- Tyrode's løsning med BDM (2,3-Butanedione monoxime): Tilføj BDM som en reversibel myofilament hæmmer for at forhindre sammentrækning af myocytterne10. Der afvejes 600 mg BDM, og der tilsættes 200 ml tyrodeopløsning. Opløsningen omrøres med BDM, indtil den er helt opløst. Der kræves ingen yderligere filtrering.
- Tyrodes opløsning, der indeholder BDM, opbevares ved 4 °C til fremtidig brug.
2. Forberedelse af afdelingerne
- Coat både dissekerekammer og forsøgskammer på forhånd med polydimethylsiloxan (PDMS) i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
- Fyld dissekeringskammeret med Tyrodes opløsning, der indeholder BDM.
- Tænd køleren 1 time før proceduren. Temperaturen indstilles til 4 °C.
3. Forberedelse af kanylen
- Tænd for mikropipette-aftrækkeren. Vælg indstillingerne i henhold til producentens anvisninger.
- Tag et rent borosilikatglasrør (den ydre og indre diameter af de anvendte glasrør var henholdsvis 1,2 mm og 0,69 mm).
- Sæt et glasrør i de rillede klemmer på en Sutter pipette-aftrækker med en U-formet platinopvarmningsfilament.
- Aktiver aftrækkeren for at producere to kanyler, hver med en lang tynd spids.
- Skær spidsen af hver kanyle ved hjælp af en fin saks under et dissekerende mikroskop for at gøre den endelige diameter af spidsen omkring 100 til 150 μm.
- Fire polere spidsen af den afskårne kanyle til lidt rundt om de skarpe kanter.
- Bøj kanylen langs akslen ved hjælp af en platintråd (opvarmet med fin kontrol) placeret på siden af akslen ca. 2 mm fra spidsen. Vinklen på bøjningen i kanylen skal være omkring 45°.
- Sæt kanylens åbne ende ind i holderen af trykmågrafkammeret, og stram beslaget. Tilslut en 5 ml sprøjte fyldt med Tyrodes opløsning til den anden side af beslaget. Tilslut kanylen til en mikromanipulator monteret på kammeret (se figur 1 og figur 2).
- Fyld kanylen med Tyrodes opløsning ved hjælp af sprøjten (5 ml), skyl den, slangen og stikket af luftbobler.
- Forud for kannulationsproceduren måles perfusionstrykket inde i kanylen over et givet flowområde (50 til 300 μL/min. figur 3). Gør det kun, når der anvendes en ny kanyle.
BEMÆRK: Perfusionstrykket inde i kanylen er proportionalt med flowet og er lineært monteret (Figur 3).
4. Udvinding af musehjerte
- Sæt en C57BL/6 mus (enten køn, 8-16 uger gammel) i anæstesikassen, der er forbundet med isofluranens og iltens tanke.
- Tænd ilttanken og start strømmen af isoflurane. Vent ~ 5 min, indtil musen er fuldt bedøvet.
- Når anæstesi er etableret, skal du tage musen ud af anæstesikassen og injicere heparin IP (i peritonealhulen, 360 enheder, 0,5 mL / mus) for at undgå blodpropdannelse i vaskulaturen. Sæt derefter musen tilbage i anæstesikassen.
- 10 min efter heparin er blevet injiceret, flytte musen til den opvarmede seng i en liggende stilling og stabilisere sine poter ved hjælp af mærkning tape. Hold musen under fuld anæstesi med isoflurane ved hjælp af en næse kegle.
- Løft musens mavehud over mellemgulvet med pincet, og brug kirurgisk saks til at skære og eksponere mellemgulvet.
- Skær mellemgulvet og brystbenet over. Åbn kisten.
- Disseker hjertet ud af brysthulen og skær så tæt som muligt på brystvæggen.
- Placer hjertet i iskold Tyrodes opløsning, der indeholder 30 mM BDM.
- Rengør hjertet for at fjerne bindevæv såsom lunge.
- Overfør hjertet til det forkølede dissekeringskammer fyldt med Tyrodes opløsning, der indeholder 30 mM BDM.
5. Forberedelse og cannulation af septal arterie
- Tænd servopumpen. Indstil servopumpen til "flow"-tilstand. Lad det køre med høj hastighed, indtil slangen er fyldt med Tyrode's løsning, der vil blive brugt til at gennemgå vaskulære lumen. Sørg for, at der ikke er bobler i slangen. Sænk derefter hastigheden.
- Fastgør hjertet på PDMS, undgå skader på det midterste område af hjertet.
- Fjern både højre og venstre atria. Skær den højre ventrikel op, og fjern den højre ventrikulære frie væg ved hjælp af et dissekerende mikroskop.
- Udsæt og identificer septal arterien. Placer en nylontråd (30 μm diameter) under septalarterien og bind en løs knude til fremtidig brug.
BEMÆRK: Septal arterien kan let identificeres ved hjælp af et dissekerende mikroskop. Septal arterien er en stor arterie på septum stammer fra højre kranspulsåren i de fleste tilfælde. - Fjern den venstre ventrikulære frie væg med en fin saks.
- Overfør papillærmuskelpræparatet til det eksperimentelle kammer, hvor kanylen var placeret. Kammeret er fyldt med Tyrodes opløsning, der indeholder BDM. Bunden af dette kammer er belagt med et tyndt (~2 mm) lag PDMS.
- Juster kanylens position (ved hjælp af mikromanipulatoren) for at muliggøre kannulation af septalarterien. Stram knuden.
- Fastgør papillærmusklen ved hjælp af små stifter til kammergulvet, så mikroskopmålet har et klart overblik over vaskulaturen. Vær opmærksom på vinklen og kanylens placering og sørg for, at kanylens spids er parallel med arteriel væg.
- Test cannulation ved gradvist at udvise opløsningen fra sprøjten gennem kanylen. Hvis alle elementer fungerer korrekt, vil restblod i papillærmusklen forlade vævet i begyndelsen af denne proces, og kun Tyrodes opløsning vil blive set senere.
6. Stabilisering af præparatet
- Tænd den peristaltiske pumpe, der vil give superfusionsopløsningen. Superfuse derefter konstant præparatet i badet med forgasset PSS med en hastighed på 3-4 mL/min.
- Tænd for temperaturregulatoren til superfusionsopløsningen. Temperaturen på badet justeres til ~35-37 °C.
- Tilslut kanylen til servopumpen. Aflæs det tryk, der vises på tryk servo controlleren.
- Overvåg flow og tryk. Gennemstrømningen (μL/min. ) og det arterielle perfusionstryk (mm Hg) digitaliseres ved hjælp af digitalisering og registreres ved hjælp af en tilknyttet software (Figur 2).
- Juster flowet for at indstille trykket ~10 mmHg og lad det køre i ~ 10 min.
- Forøg strømmen af den luminale opløsning for at gøre trykket af arterie ~ 60 mmHg. Det endelige perfusionstryk af selve arteriolen opnås ved at trække trykfaldet af kanylen (Figur 3).
BEMÆRK: Hvis "tryk"-tilstanden på tryk servo controller er valgt, er det luminale tryk indstillet ~ 60 mmHg for disse eksperimenter. Overvåg derefter ændringen af flowet. - Lad prøven stabilisere sig i ~30-60 min. ved at overvåge flow- og/eller trykniveauerne. En gradvis stigning i arterielt tryk observeres normalt i begyndelsen af perfusionen efter kannulation. En ny stabil tilstand vil få etablere sig i sig selv i ca 30 min (Figur 4).
- Igangsætte et eksperiment efter perfusionstrykket er stabiliseret (ved konstant flow).
7. Påfyldning af præparatet med fluorescerende mærket hvede-kim agglutinin (WGA)
- Forbered Tyrodes opløsning, der indeholder Alexa-Fluor-488 konjugeret WGA ved at tilsætte 100 μg konjugeret WGA i 5 ml tyrodeopløsning.
- Skift forsigtigt perfusatet fra normal Tyrodes opløsning til en opløsning, der indeholder fluorescerende mærket WGA. Det er vigtigt at forsigtigt skifte perfusate, så der ikke introduceres bobler.
- Efter ~ 30 min af WGA perfusion, eller når WGA opløsning er ved at løbe tør, ændre perfusate tilbage til normal Tyrode's løsning.
8. Konfokal billeddannelse af arterioler og kapillærer
- Tænd nipkow disk confocal mikroskop system.
- Brug mikroskopet til at finde septal arterien ved hjælp af en lav effekt mål (4x) i transmitteret lystilstand.
BEMÆRK: Septal arterie kan placeres ved at følge placeringen af kanylen. - Start konfokal billeddannelse med den roterende disk confocal og vælg 488 nm excitation laser, 40x objektiv forstørrelse og justere laser intensitet og sampling sats (10 - 500 ms pr billede).
- Konfigurer top- og bundbilledpositioner for konfokalt mikroskop for at definere billedområdet og angive parametrene for z-stack-billeddannelsen.
- Angiv trinstørrelsen som anbefalet for det system, der bruges, eller angiv trinstørrelsen efter behov.
- Vælg indstillingerne for z-stak og/eller tidsserier.
- Vælg eller angiv en ny mappe til lagring af det nye billede.
- Klik på "Kør" for at starte optagelsen af billedbehandling til fremtidig analyse (Figur 5).
9. Eksempel vasodilator eksperiment: pinacidil-induceret vasodilation (Video 1).
- Pinacidil-stamopløsningen (100 mM i DMSO) fremstilles og opbevares ved 4 °C.
- Forbered 10 ml af Tyrodes løsning. Der tilsættes 10 μL pinacidilbestandopløsning for at opnå den endelige koncentration af pinacidil 100 μM.
- Billede papillær muskel ved lav forstørrelse (4x mål) til også at omfatte septal arterie og gren arterioler.
- Skift luminalopløsning til den pinacidilholdige opløsning.
10. Eksempler på forsøg med blodgennemstrømningskontrol: Vasoconstrictor-induceret arterielt perfusionstryk øges ved konstant strømning (Figur 6)
- Endothelin-1 (ET-1) stamopløsning (10 μM) fremstilles og opbevares ved -20 °C.
- Forbered 10 ml af Tyrodes løsning. Der tilsættes 10 μL ET-1-stamopløsning (10 μM) for at opnå den endelige koncentration af ET-1 10 nM.
- Optag det luminale tryk med konstant flow og billede papillærmusklen.
- Skift luminal løsning til ET-1 indeholdende løsning.
11. Eksempel på billeder af kapillær med pericytter (Figur 7)
- Ofre en NG2DsRedBAC transgen mus som beskrevet i afsnit 4 i denne protokol.
- Ekstrakt hjertet, kanyler septal arterien og indlæse prøven med Alexa-Fluor-488 konjugerede WGA efter protokoller 5-7.
- Billede papillærmusklen ved 488 nm og 560 nm excitation, og 510-525 nm, 575-625 nm emission ved hjælp af confocal. Arteriole trykket vil være omkring 40 mmHg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når en fluorescens vaskulær markør er perfunderet i vaskulære lumen (her WGA konjugeret med Alexa Fluor-488), er det muligt at visualisere hele vaskulære træer som vist i figur 5 (Venstre panel) ved hjælp af høj hastighed konfokal mikroskop. Yderligere forstørrelse muliggør billeddannelse af kapillær i detaljer (Figur 5, Højre panel). Da tryksystemet understøtter en konstant overvågning af luminalt tryk, kan dette præparat bruges til tilknyttede ændringer i arteriel diameter med arterielt tryk. Video 1 viser, at når pinacidil, en ATP-følsomme K+ kanal (KATP)agonist blev serveret fra lumen, diameteren af arterierne blev øget. Figur 6 viser, at når vasoconstrictor ET-1 blev anvendt fra lumen, diameteren af arteriolen blev reduceret, og det luminale tryk blev øget, da strømmen blev sat konstant.
På grund af højopløsningsfunktioner af konfokal mikroskopi i kombination med specifikke cellemærker kan denne procedure også bruges til at visualisere mange andre celletyper, der er forbundet med mikrocirkulationen. Her brugte vi en mus (NG2DsRedBAC transgen mus), der udtrykker DSRed fluorescensprotein under en pericyte specifik promotor (NG2) og mærket fartøjerne med WGA-Alexa Fluor 488. Dette giver os mulighed for at billedet samtidig både kapillær (grøn) og pericytter (rød) i musen papillær muskel (Figur 7) under forhold, der bedre efterligner fysiologi hos levende dyr.
Figur 1: Cannulation af musens septalarterie.
(A) Transmitteret lysbillede viser et eksempel på den cannulated papillær muskel. Mikromanipulator, kanyle og prøve (septum med højre ventrikel papillærmuskel) er angivet som etiketter. (B) Zoomet ind prøve i A viser papillær muskel og den cannulated septal arterie. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Udstyr, der blev brugt i hele eksperimentet.
(A) Hovedkomponenterne i den opsætning, der bruges i eksperimentet. (B) Diagrammet illustrerer forbindelserne mellem papillær muskelforberedelse og det fysiologiske kontrol eksperimentelle udstyr. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Måling af trykket inde i kanylen.
( A )Eteksempel, der viser, hvordan en kanylemodstand blev bestemt ved at måle trykket inde i kanylen over en strømningsafstand (50-300 μl/min). (B) Forholdet mellem trykket inde i kanylen med flow fra 6 kanyler. Trykket inde i kanylen var proportional med strømmen og var egnet af udtrykket Pc = 0.08f-12.25, hvor Pc som tryk inde i kanylen, f som flow. N=6 kanyler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Perfusionstryk ændrer sig under stabilisering ved et konstant flow.
(A) En typisk registrering af perfusionstryk under stabilisering ved et konstant flow (~250 μL/min). Bemærk stigningen i perfusionstrykket efter 30 minutters stabilisering. (B) Statistikkerne viser perfusionstrykket før og efter stabiliseringen, da tonen blev udviklet. Den gennemsnitlige strøm af arterilerne for at opretholde det oprindelige tryk (~60 mmHg) er 201,7 ± 8,6 μL/min (n= 45 mus). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Billeddannelse af kapillærer og arterioler.
(A)Billedet viser arterioler og kapillærer, der var fyldt med hvedekim agglutinin (WGA). (B) Zoom ind på det indrammede område i A. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: ET-1 øger det luminale tryk og nedsætter arteriel diameter.
(A) Arteriel diameter ændret med anvendelse af ET-1 (10 nM). (B) WGA-fluorescensprofilerne, der viser diameterændringen med ET-1. Diameteren af arteriolen blev afspejlet af afstanden mellem den maksimale intensitet af fluorescens på arteriole væggen. (C) Det luminale tryk steg i nærværelse af ET-1 (10 nM) ved et konstant flow. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Kapillær med pericytter fra NG2-DsRed mus.
Hjerte pericytes (rød) og kapillærer (grøn) blev afbildet i tryk (40 mmHg) og perfunderes musen højre ventrikulær papillær muskel. Højre panel, de zoomede billeder af de indrammede områder i venstre paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Pinacidil-induceret vasodilation. Pinacidil (100 μM) blev anvendt fra lumen. Vasodilation blev set i arterielt træ. Klik her for at downloade denne video.
| Sammensætningen af fysiologisk saltvandsopløsning (PSS) | |||
| Reagenser | Endelig koncentration (mM) | Molekylvægt | g/10 liter |
| Nacl | 112 | 58.44 | 65.45 |
| KCl | 5 | 74.55 | 3.73 |
| MgSO4 | 1.2 | 120.37 | 1.44 |
| NaH2PO4 | 1.2 | 119.98 | 1.44 |
| NaHCO3 | 24 | 84.01 | 20.16 |
| Glukose | 10 | 180.16 | tilsæt 1,8 g glukose til 1 liter PSS før brug |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | tilsæt 1,8 ml 1 M CaCl2 til 1 liter PSS før brug |
| Sammensætningen af Tyrodes løsning | |||
| Reagenser | Endelig koncentration (mM) | Molekylvægt | g/L |
| Nacl | 140 | 58.44 | 8.18 |
| KCl | 5 | 74.55 | 0.37 |
| NaH2PO4 | 0.33 | 119.98 | 0.04 |
| HEPES | 10 | 238.3 | 2.38 |
| Glukose | 5.5 | 180.16 | 0.99 |
| CaCl2 | 1.8 | 110.99 | der tilsættes 1,8 ml 1 M CaCl2-opløsning |
| MgCl2.6H2O | 0.5 | 203.3 | der tilsættes 0,5 ml 1 M MgCl2-opløsning |
| Bemærk: Juster pH til 7,4 med 1 M NaOH. | |||
Tabel 1: Opløsningernes sammensætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nuværende arbejde har vi indført en bemærkelsesværdig enkel, men meget praktisk ex vivo-metode til at studere koronarmikrocirkulationen i hjertet under fysiologiske forhold. Denne metode blev ændret fra mekaniske undersøgelser ved hjælp af rotter2. Den udfordrende tilføjelse var billedbehandlingsteknologien med høj hastighed og høj optisk opløsning. Vi var derfor i stand til at drage fordel af de avancerede optiske billedbehandlingssystemer, der nu er kommercielt tilgængelige. Ved omhyggelig dissektion og placering af den fungerende papillære muskelforberedelse i en gunstig position var vi i stand til at visualisere arterioler, præ-kapillærarterioler, kapillærer og venules samt pericytter og var i stand til at måle arterielt tryk og / eller flow, mens vi kontrollerede den anden. Den arterie og kapillær diameter ændringer blev overvåget ved hjælp af en highspeed spinning disk confocal mikroskop. Kombinationen af de optiske billeder og den interne perfusion af den fysiologiske saltvandsopløsning gør dette præparat nyttigt i evalueringen af effekten af de biomedicinske behandlinger såvel som i undersøgelsen af de mekanismer, der er involveret i den fysiologiske og patologiske regulering af blodgennemstrømningen i hjerte1.
Hjerte papillære muskler har været meget udbredt i studiet af hjertefysiologi i mange år. Fraværet af perfusion forringer imidlertid fysiologien, hvis karakteristika for "arbejde" eller "metabolisme" eller "elektrisk aktivitet" overvejes. Det er klart, ikke-perfunderes papillære muskler er naturligvis ikke fysiologiske. Ikke desto mindre lavede Westerhof et al. for årtier siden det trykede tynde papillære præparat fra rotte for at studere blodgennemstrømningsreguleringen2, men dette præparat blev ikke brugt i mus, som vi gjorde her på grund af håndteringsvanskelighederne. Disse efterforskere var heller ikke i stand til at forestille sig de oplysninger, der er nødvendige for at bestemme, hvordan blodgennemstrømningen regulering fandt sted. Vi var heldige, at musen septal arterie er omkring 100 μm i diameter på ~ 60 mmHg perfusion tryk, mindre end hos rotter, men stor nok til vores arbejde. Som en praktisk bemærkning skal der lægges særlig vægt på forberedelsen af kanylen og den tilsluttede slange. Undgå bobler i slangen og kanylen. Bobler er let fanget i det forbundne område og vil blokere eller fordreje blodgennemstrømningen. Du skal derfor dobbelttjekke disse områder. Derudover ville det være nyttigt at bruge en kanyle med en relativt stor spids, så længe den er lille nok til at komme ind i arterien, fordi en større kanyle holder arterien åben og muliggør glat flow. Hvis der observeres en pludselig og uventet stigning i trykket (ved konstant flow) under optagelsen, er det meget sandsynligt, at spidsen af kanylen er blevet fast på arteriel væg, eller kanylen er blevet blokeret af vævsrester. Derfor er kanylens position meget vigtig for at holde flow og tryk stabilt. Jo hurtigere kannulationen er, jo bedre for vævet. Dette fører til en hurtigere genopretning af dens fysiologiske funktion. Vi anbefaler, at den tid, der bruges på cannulation, ikke overstiger ~ 45 min (fra ekstraktion af hjertet til afslutningen af cannulation).
Uanset hvor forsigtig man kan være, tager denne tilsyneladende enkle metode praksis til perfekt. Nogle gange reagerer præparatet ikke på nogen stimulering, uanset den omhu, der er taget under dissektionen eller hurtigheden og effektiviteten af hele proceduren. Badetemperaturen skal være konstant og mellem 35 og 37 °C. En anden vigtig ting er at køre en rutinemæssig referencekontrol for vævsfunktion (for eksempel svaret på KCl) for hvert eksperiment, enten før eller efter dit eksperiment er udført. Vi bruger ET-1 eller KCl (70 mM) som referencer. Endelig er det meget vigtigt at kontrollere og fastslå, at kanylen stadig er på plads, når eksperimentet er færdigt. Se bort fra dataene, hvis kanylen er ude af sted, eller arterien er brudt eller snoet af kanylens spids. To vigtige ting, der er værd at bemærke, er centreret om "præparatets bevægelse" og "dataanalyse". Selv i "quiescence", præparatet stadig bevæger sig (Video 1). Mindre bevægelse er ikke et problem for høj hastighed spinning disk confocal imaging. Sænkning af perfusionstryk eller brug af Na+ kanalblokkere kan forhindre eller minimere bevægelsen uden at forstyrre mikrovaskulær karfunktion. Vi lavede offline analyse af de erhvervede data ved hjælp af ImageJ-win64 (Fiji) og / eller MATLAB med brugerdefineret software til målinger af beholderdiameter. Vi beskriver ikke diameteranalysen her, fordi enhver software (f.eks. Vasotracker11 ) skal være i stand til at analysere diameterændringerne.
Ved at kombinere de fysiologiske undersøgelser med optisk billeddannelse teknikker og høj hastighed konfokal mikroskopi, kan dette præparat i vid udstrækning anvendes til 1) teste den lovgivningsmæssige virkning af nye lægemidler på blodgennemstrømningen i hjertet; 2) Undersøgelse intercellulær kommunikation (mellem og blandt kardiomyocytter, kapillær endotelceller, pericytter og arterielle glatte muskelceller, og fibroblaster); og 3) Undersøg den dynamiske funktionelle ændring af forskellige celletyper ved hjælp af fluorescensmærkede transgene mus1. Denne metode omfatter visualisering af dele af hjertevævet med netværk under "nær" fysiologi. Selv om vi kan være i stand til at efterligne in vivo betingelser ved pacing præparatet og / eller herunder nogle røde blodlegemer i perfusate, kan det ikke erstatte ægte in vivo billeddannelse med en bred vifte af metaboliske og arbejdsbelastninger. Det kan ikke anvendes på de store dyr enten på grund af begrænset dybde i betragtning af en confocal mikroskop. Det bør dog være et nyttigt redskab i undersøgelsen af de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for regulering af koronarmikrocirkulation hos små dyr, herunder mus og rotter. Lignende begreber kan udvides og vedtages i undersøgelsen af blodgennemstrømning kontrol i andre væv eller organer, herunder men ikke begrænset til gastrointestinale system, bugspytkirtel, skjoldbruskkirtlen, lymfeknuder, lever, nyre, skeletmuskel, hjerne12, nethinden, ganglier, knogle, hud, livmoder, testis, æggestokke, binyrer, fedt osv. Denne tilgang vil forbedre og fremme forståelsen af blodgennemstrømningskontrol og reguleringsmekanismer på celle- og molekylærniveau under fysiologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af Center for Biomedicinsk Teknik og Teknologi (BioMET); NIH (1U01HL116321) og (1R01HL142290) og American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M CaCl2 solution | MilliporeSigma, USA | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | MilliporeSigma, USA | M1028 | |
| AxoScope software | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Chiller/water incubator | FisherScientific, USA | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, USA | A1R | |
| Custom glass tubing | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San Jose, CA, USA | ||
| Dissecting microscope | Olympus, Japan | SZX12 | |
| Endothelin-1 | MilliporeSigma, USA | E7764 | |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich, USA | H3393 | |
| Inline solution Heater | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | SH-27B | |
| Isoflurane | VETone, Idaho, USA | 502017 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA, USA | P-97 | |
| Micropipette/cannula holder | Warner Istruments, Hamden, CT, USA | 64-0981 | |
| NG2DsRedBAC transgenic mouse | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Nylon thread for tying blood vessels | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | THR-G | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | SYLGARD, Germantown, WI, USA | 184 SIL ELAST KIT | |
| Peristaltic pump | Gilson, Middleton, WI, USA | minipuls 3 | |
| Pressure Servo Controller | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-S | |
| Scissors | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA | 15000-10 | |
| Servo Pump | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA | PS-200-P | |
| Temperature controller | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | TC-324B | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA | W11261 |
References
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart. Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).
- Tillmanns, H., et al. Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle. Circulation Research. 34, 561-569 (1974).
- Martini, J., Honig, C. R. Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply. Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).
- Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques. Circulation Research. 49, 342-353 (1981).
- Marcus, M. L., et al. Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level. Circulation. 82, 1-7 (1990).
- Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation. Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).
- Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries. Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).
- Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).
- Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion. Circulation. 89, 2412-2420 (1994).
- Lawton, P. F., et al. a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology. Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).
